Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Xây dựng quy trình định lượng tạp chất phân hủy của esomeprazol bằng phương pháp HPLC trình bày về tác dụng dược lý của hoạt chất chính bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó có các chất phân hủy. Việc kiểm soát tạp chất phân hủy hiện diện trong nguyên liệu và chế phẩm tương ứng cũng quan trọng. Vì vậy, việc xây dựng một qui trình định lượng tạp chất phân hủy trong nguyên liệu và chế phẩm của hoạt chất này là cần thiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP CHẤT PHÂN HỦY CỦA ESOMEPRAZOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Lê Trung Hậu*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Đối với nguyên liệu hay chế phẩm thuốc, tác dụng dược lý hoạt chất bị ảnh hưởng nhiều yếu tố, có chất phân hủy Đây nguyên nhân gây tác dụng phụ hay làm giảm tác dụng dược lý hoạt chất Do đó, ngồi tiêu chuẩn xác định chất lượng thuốc định tính, định lượng, độ hòa tan , việc kiểm sốt tạp chất phân hủy diện nguyên liệu chế phẩm tương ứng cần thiết Thuốc kháng acid Esomeprazol STADA sản xuất từ nguyên liệu esomeprazol công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam trường hợp ngoại lệ.Hiện tại, Dược điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất cho nguyên liệu chưa có chuyên luận chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành phẩm Esomeprazol STADA chưa xây dựng tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì vậy, việc xây dựng qui trình định lượng tạp chất phân hủy nguyên liệu chế phẩm hoạt chất cần thiết Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao phađảo để định lượng tạp chất phân hủy nguyên liệu esomeprazol chế phẩm Esomeprazol STADA Kết quả: Đã xác định điều kiện sắc ký thích hợp để tách tạp chất phân hủy esomeprazol, sử dụng cột sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động acetonitril - đệm pH 7,6 (25:75), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, bước sóng phát 280 nm Kết thẩm định cho thấy quy trình có khoảng tuyến tính từ 0,04 – 0,50 ppm với hệ số tương quan cao, giới hạn phát 0,01 ppm, giới hạn định lượng 0,04 ppm, độ với tỉ lệ phục hồi 98% - 102% độ xác với RSD < 2% Kết luận: Đề tài xây dựng thành cơng quy trình HPLC định lượng tạp chất phân hủy esomeprazol Quy trình áp dụng để kiểm tra tạp chất phân hủy lô nguyên liệu lô thành phẩm tương ứng Từ khóa: tạp chất phân hủy, esomeprazol, sắc ký lỏng hiệu cao ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF DEGRADATION IMPURITY OF ESOMEPRAZOLE BY HPLC Le Trung Hau, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No - 2013: 134 - 138 Introduction – Aims::For drug substances ormedicines, pharmacologicaleffectoftheactiveingredientis affected bymanyfactors such as presence of degradation impurities This is oneofthecauses of side effects orreducingpharmacological effectsofthe active ingredient Therefore, the quality of drugs is not only monitored by identification, assay, and dissolution tests, etc but also controlled via impurity tests in raw materials and finished products The antacid Esomeprazol STADA capsule produced by STADA Viet Nam Joint Venture Co., Ltd is not an exception Currently, the API monograph esomeprazole with impurities tests is only available in European Pharmacopoeia.While specification of Esomeprazol STADA finished product has not had impurity test yet Hence, development of a method for degradation impurity assay in esomeprazole raw material and finished product is * Công ty TNHH Liên Doanh STADA Việt Nam Tác giả liên lạc: DS Lê Trung Hậu ĐT: 0913799068 134 ** Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Email: diemnhim@yahoo.com Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học necessary Subjects and Methods: A reversed phase high performance liquid chromatographic method was developed for quantitative determination of degradation impuirity in esomeprazole raw material and Esomeprazol STADA finished product The appropriate chromatographic conditions were found out for complete separation of degradation Results: impurity and esomeprazole, using Eursopher C8 column (250 x 4.6 mm; μm), mixture of acetonitril and buffer pH 7.6 (25:75, v/v) as eluent in isocratic mode, flow rate of 1.0 ml/min, and detection wavelength of 280 nm The method was validated and shown linearity range from 0.04 ppm to 0.50 ppm with high correlation coefficient, detection limit of 0.01 ppm, quantitation limit of 0.04 ppm, accuracy with recovery ratio in 98% - 102%, and precision with RSD < 2% Conclusion: A liquid chromatographic method was successfully developed for degradation impurity assay of esomeprazole The validated method was applied for impurity test in three batches of raw materials and of finished products Key words: Degradation impurity, esomeprazole, HPLC ĐẶT VẤN ĐỀ ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, việc nghiên cứu tác dụng dược lý hoạt chất chính, nhà nghiên cứu phải khảo sát tác dụng dược lý tạp chất phát sinh nguyên liệu thành phẩm nguyên liệu đầu vào lẫn tạp tạp chất phân hủy trình sản xuất lưu hành Những tạp chất phát sinh làm thay đổi hiệu lâm sàng đặc tính an tồn thuốc gây tác dụng khác với hậu không lường trước Việc kiểm soát tạp chất liên quan nguyên liệu đặc biệt chế phẩm tương ứng quy định chặt chẻ phần lớn chuyên luận Dược điển nước (EP, USP, BP).Esomeprazol (Nexium, Esomeprazol STADA) đồng phân S omeprazol, dùng làm thuốc ức chế bơm proton, làm giảm tiết acid dày (4).Hiện tại, Dược điển Châu Âu có quy định kiểm tra tạp chất cho nguyên liệu chưa có chuyên luận chế phẩm tương ứng.Trong tiêu chuẩn thành phẩm Esomeprazol STADA chưa xây dựng tiêu kiểm tra tạp chất phân hủy.Vì vậy, việc xây dựng qui trình định lượng tạp chất phân hủy nguyên liệu chế phẩm hoạt chất cần thiết Đối tượng nghiên cứu Chuyên Đề Dược Học Tạp chất phân hủy esomeprazol: 5Methoxy-2-(((4-methoxy-3,5-dimethyl pyridin-2l)methyl)sulphonyl)-1H-benzimidazole (tạp D, Sulphon)(1,3) Trang thiết bị, hóa chất dung môi Trang thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu cao Shimadzu LC-20A Cột sắc ký Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; μm) Cột Inert Sustain C8 (125 x 4,6 mm; μm) Cân phân tích GH 202 Mettler Toledo Các thiết bị phân tích hiệu chuẩn Hóa chất dung mơi Acetonitril đạt tiêu chuẩn dùng cho sắc ký lỏng (Merck).Dinatri hydrophosphat, acid phosphoric đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck) Phương pháp nghiên cứu Khảo sát điều kiện phân tích Esomeprazol tạp D chất phân cực, nên pha động sử dụng phải phân cực Vì vậy, sắc ký pha đảo áp dụng Theo Dược điển Châu Âu, điều kiện sắc ký để kiểm tra tạp phân hủy sử dụng cột pha đảo C8, pha động bao gồm acetonitril đệm phosphat pH 7,6 (27:73) Căn vào đó, số điều kiện sắc ký 135 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 khảo sát cột sắc ký, kích thước cột, tỉ lệ dung môi pha động, nồng độ mẫu đo để chọn điều kiện sắc ký thích hợp thỏa mãn yêu cầu sau: độ phân giải Rs tạp D esomeprazol (và tạp khác có) phải lớn 1,5; hệ số bất đối (As) pic tạp D phải nằm khoảng 0,8 đến 1,5 Điều kiện sắc ký ban đầu(1): pha động acetonitril - đệm pH 7,6 (27:73), cột sắc ký phả đảo C8 (125 x 4,6 mm, μm), bước sóng phát 280 nm, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 40 μl Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính chọn lọc, độ đúng, độ xác, khoảng tuyến tính, giới hạn phát giới hạn định lượng Xác định hàm lượng tạp chất nguyên liệu chế phẩm esomeprazol Phương pháp sau thẩm định ứng dụng để xác định hàm lượng tạp phân hủy nguyên liệu chế phẩm esomeprazol KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát điều kiện phân tích Dựa theo điều kiện sắc ký Dược điển Châu Âu, sử dụng cột pha đảo C8 (125 x 4,6 mm; μm), cột Inert Sustain có kích thước tương đương sử dụng để khảo sát hỗn hợp chuẩn esomeprazol tạp D, tỉ lệ tạp D 0,2% so với esomeporazol (1) Kết cho thấy esomeprazol tạp D khơng tách hồn tồn Khi tăng chiều dài cột lên 250 mm, độ phân giải không cải thiện Các khảo sát tiến hành cột sắc ký Eurospher C8 cho thấy độ phân giải cải thiện đáng kể với cột Eurospher C8 (250 x 4,6 mm; μm), esomeprazol tạp D tách hoàn toàn Kết khảo sát tỉ lệ acetonitril đệm phosphat pH 7,6 lên độ phân giải mẫu thử giả lập (được chuẩn bị từ chế phẩm Esomeprazol STADA có thêm chuẩn tạp D cho tỷ lệ tạp D 136 0,2% so với esomeprazol) cho thấy: - Với tỉ lệ 27:73, esomeprazol tạp D tách hoàn toàn, độ phân giải tạp chưa biết gần tạp D khoảng 1,3 - Với tỉ lệ 25:75, esomeprazol tạp D tách hoàn toàn, độ phân giải tạp chưa biết gần tạp D khoảng 2,7 Khảo sát tỉ lệ esomeprazol tạp D cho thấy hỗn hợp esomeprazol tạp D có nồng độ tương ứng 200 ppm 0,4 ppm tiến hành sắc ký nhiều lần liên tiếp pic tách hoàn toàn, hệ số bất đối pic tạp D nằm khoảng 0,8 – 1,5 số đĩa lý thuyết cột không bị giảm, điều chứng tỏ cột không bị tải Như vậy, điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng tạp D là: - Pha động: acetonitril - đệm phosphat pH 7,6 (25:75) - Cột sắc ký: Eurospher (250 x 4,6 mm; μm) - Bước sóng phát hiện: 280 nm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm mẫu: 40 μl Thẩm định phương pháp Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 1: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống mẫu chuẩn (n=6) Thông số RSD% RSD% RSD% của thời diện RS AS số đĩa lý gian lưu tích pic Chất thuyết (tR) (S) Tạp D 0,50 0,42 - 1,0 1,53 Esomeprazol 0,24 0,17 11,6 1,1 1,65 Nhận xét: Hệ số bất đối nằm khoảng 0,8 – 1,5 RSD thông số sắc ký cho lần tiêm lặp lại nhỏ 2% Độ phân giải lớn 1,5 Tiến hành sắc ký lần mẫu thử cho thấy độ phân giải pic tạp D pic gần lớn 1,5 Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp hệ thống Tính chọn lọc Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu giả dược, mẫu chuẩn, mẫu thử (chế phẩm Esomeprazol Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 STADA) theo điều kiện sắc ký chọn, mẫu tiêm lần Kết cho thấy mẫu trắng mẫu giả dược không xuất pic thời gian lưu pic tạp D pic esomeprazol, sắc ký đồ mẫu thử cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu pic tạp D Mẫu trắng Nghiên cứu Y học esomeprazol mẫu chuẩn, tạp D tách hoàn toàn esomeprazol tạp chưa biết khác với độ phân giải lớn 1,5 Như vậy, qui trình phân tích có tính đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu minh họa hình Mẫu giả dược Mẫu chuẩn Esomeprazol Mẫu th Esomeprazol Tạp D Tạp D Hình 1: Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu giả dược, mẫu chuẩn mẫu thử Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Pha lỗng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu nhỏ phát để xác định LOD pha lỗng nồng độ chất phân tích đến mức tín hiệu đáp ứng độ xác độ để xác định LOQ Đo tín hiệu thu từ mẫu trắng (N) mẫu thử (S) Thiết lập tỉ số S/N Nồng độ mẫu thử điểm có S/N = 3/1 LOD S/N = 10/1 LOQ Kết thu sau: LOD LOQ tạp D 0,01μg/ml 0,04 μg/ml Chuyên Đề Dược Học Khoảng tuyến tính, độ xác độ Khoảng tuyến tính xác định khoảng nồng độ từ LOQ - 120% so với giới hạn qui định (0,2%) Tiến hành pha dung dịch chuẩn có nồng độ khác Mỗi dung dịch tiến hành sắc ký lần Độ lặp lại: Chuẩn bị mẫu thử mẫu thử giả lập, tiến hành sắc ký mẫu lần ngày Độ xác trung gian: chuẩn bị mẫu giống độ lặp lại tiến hành ngày khác nhau, thiết bị phân tích khác 137 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Độ thực cách thêm chuẩn tạp D vào mẫu thử ba mức nồng độ 80%, 100% 120% so với giới hạn quy định (0,2%) Ở mức nồng độ, chuẩn bị mẫu tiến hành sắc ký mẫu lần Kết thống kê cho thấy qui trình phân tích có khoảng tuyến tính từ 0,04 ppm – 0,50 ppm với giá trị bình phương hệ số tương quan cao, tỷ lệ hồi phục nằm khoảng 98% 102% RSD < 2% độ xác Bảng 2: Kết khảo sát khoảng tuyến tính, độ xác độ Phương trình hồi qui Khoảng tuyến tính (ppm, µg/ml) R Độ lặp lại (RSD, n = 6) Độ xác trung gian (RSD, n = 18) Độ (tỷ lệ hồi phục, n=9) Tạp D y = 57279,9x 0,04 – 0,50 0,9997 Mẫu thử: 1,91%; Mẫu thử giả lập: 1,16% Mẫu thử: 1,78%; Mẫu thử giả lập: 1,61% 98,23% - 101,39% Bảng 3: Kết xác định hàm lượng tạp D nguyên liệu chế phẩm esomeprazol Lô Dựa vào kết thực nghiệm thu được, áp dụng quy trình thiết lập để định lượng tạp chất phân hủy D nguyên liệu esomeprazol chế phẩm Esomeprazol STADA Quy trình có tính chọn lọc, độ xác độ cao, giới hạn phát giới hạn định lượng thấp, giúp phát kiểm tra tạp chất phân hủy nguyên liệu thành phẩm tương ứng TÀI LIỆU THAM KHẢO European pharmacopoeia (2010), 1951-1953 ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5 Nalwade SU, Reddy VR, Rao DD, Morisetti NK(2012), A validated stability indicating ultra performance liquid chromatographic method for determination of impurities in esomeprazole magnesium gastro resistance tablets, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 57:109-114 Reuters T (2009), Physicians’ Desk Referrence, 652 Ngày nhận báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 25.12.2013 Ngày báo đăng: 138 Chế phẩm (%) 0,10 0,10 0,09 KẾT LUẬN Xác định hàm lượng tạp D nguyên liệu chế phẩm esomeprazol Tiến hành xác định tạp D lô nguyên liệu lô chế phẩm tương ứng Mỗi lô chuẩn bị mẫu Mỗi mẫu sắc ký lần với điều kiện sắc ký chọn Nguyên liệu Không phát Không phát Không phát 10.03.2014 Chuyên Đề Dược Học ... phân hủy. Vì vậy, việc xây dựng qui trình định lượng tạp chất phân hủy nguyên liệu chế phẩm hoạt chất cần thiết Đối tượng nghiên cứu Chuyên Đề Dược Học Tạp chất phân hủy esomeprazol: 5Methoxy-2-(((4-methoxy-3,5-dimethyl... giới hạn định lượng Xác định hàm lượng tạp chất nguyên liệu chế phẩm esomeprazol Phương pháp sau thẩm định ứng dụng để xác định hàm lượng tạp phân hủy nguyên liệu chế phẩm esomeprazol KẾT QUẢ VÀ... xác định hàm lượng tạp D nguyên liệu chế phẩm esomeprazol Lô Dựa vào kết thực nghiệm thu được, áp dụng quy trình thiết lập để định lượng tạp chất phân hủy D nguyên liệu esomeprazol chế phẩm Esomeprazol