Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách khối tế bào gốc (TBG) từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 HIỆU QUẢ CỦA PHƢƠNG PHÁP LY TÂM PHÂN LỚP TỶ TRỌNG PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TỦY XƢƠNG SỬ DỤNG CHO ĐIỀU TRỊ MỘT SỐ TỔN THƢƠNG XƢƠNG VÀ KHỚP Dương Văn Tồn*; Lý Tuấn Khải** Tãm t¾t Nghiên cứu nhằm đánh giá hiệu quy trình thu gom, chiết tách khối tế bào gốc (TBG) từ dịch tủy xương phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào 126 bệnh nhân (BN) khớp giả (KG), chậm liền xương (CLX) thân xương dài, BN ngắn chi đoạn chi điều trị kéo dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN chọc hút lấy 250 ml dịch tủy xương từ xương chậu, tách lấy thành phần tế bào đơn nhân phương pháp ly tâm gradient tỷ trọng với dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/l Kết quả: thể tích khối TBG tủy xương thu 32,19 ± 5,62 ml, số l ượng tế bào có nhân 49,08 ± + 30,79 G/L, tế bào đơn nhân chiếm đa số (57,38 ± 13,86%); đậm độ tế bào gốc CD 34 16,98 ± + 9,89 G/L; tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân tế bào CD 34 tương ứng 34,89 ± 12,05% 55,96 ± 30,46%; + đậm độ tế bào CD 34 tăng 5,67 ± 3,15 lần; tỷ lệ loại bỏ hồng cầu huyết sắc tố tương ứng 99,60 ± 0,48% 99,32 ± 0,41% * Từ khóa: Tế bào gốc tủy xương; Khớp giả; Chậm liền xương; Ly tâm phân lớp tỷ trọng EFFICACY OF GRADIENT DENSITY CENTRIFUGATION METHOD IN ISOLATING BONE MARROW STEM CELLS FOR TREATMENT OF CERTAIN INJURED BONES AND JOINTS Summary The aims of this study was to assess the efficacy of the gradient density centrifugation method in isolating bone marrow stem cells (BMSC) 126 patients with nonunion long bones, shortened limbs, aseptic femoral head osteonecrosis staged I, II (ARCO) were enrolled 250 ml bone marrow fluid was aspirated from the pelvis of every patient Mononuclear cells were separated by the gradient density centrifugation method using Ficoll solution 1.077 Results: Final BMSC suspension volume was 32.19 ± 5.62 ml, the suspension cells concentration was 49.08 ± 30.79 G/L with 57.38 ± 13.86% + + mononuclear cells; CD 34 cell concentration was 16.98 ± 9.89 G/L; mononuclear cells and CD 34 + cells recovering ratio were 34.89 ± 12.05% and 55.96 ± 30.46%, respectively; CD 34 cell concentration increased 5.67 ± 3.15 times; RBC and hemoglobin removing ratio were 99.60 ± 0.48% and 99.32 ± 0.41%, respectively * Key words: Bone marrow stem cell; Nonuni on bone; Shortened limbs; Gradient density centrifugation * Trường Đại học Y Hà Nội ** BƯnh viƯn TWQĐ 108 Ng-êi ph¶n håi (Corresponding): Lý Tun Khi (lytuankhai108@gmail.com) Ngày nhận bài: 31/7/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/9/2013 Ngày báo đ-ợc đăng: 23/9/2013 TP CH Y - DC HC QUN S SỐ - 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Sử dụng TBG, TBG tạo máu điều trị hướng tập trung nghiên cứu thu kết bất ngờ không điều trị bệnh tổ chức tạo máu mà nhiều bệnh quan tổ chức khác với mục đích phục hồi, tái tạo tổ chức Các TBG tạo máu tủy xương máu tuần hoàn nghiên cứu sâu ứng dụng rộng rãi lâm sàng với kết tốt Đã có số nghiên cứu chứng minh cấy ghép TBG tủy xương tự thân điều trị thành cơng trường hợp gãy xương không liền, đoạn xương tái tạo mô xương bị hoại tử người Dịch tủy xương có chứa TBG với số lượng hạn chế, lại đa số tế bào trưởng thành trưởng thành khơng có vai trò tạo xương Vì vậy, để đạt yêu cầu điều trị, dịch tủy xương sau thu gom xử lý cô đặc để tập trung số lượng TBG với đậm độ cần thiết cho trình liền xương loại bớt thành phần tế bào trưởng thành Vì tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Đánh giá hiệu quy trình thu gom, chiết tách khối TBG từ dịch tủy xương phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào điều trị số tổn thương xương, khớp khó hồi phục ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 126 BN KG, CLX thân xương dài, BN ngắn chi đoạn chi điều trị kéo dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN tuổi từ 15 - 66 điều trị ghép TBG tủy xương Viện Chấn thương Chỉnh hình, Bệnh viện TWQĐ 108 Viện Chấn thương Chỉnh hình - Bệnh viện Việt Đức từ tháng 01 - 2008 đến 03 - 2011 Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên cứu: tiến cứu mô tả cắt ngang * Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu: - Kỹ thuật thu gom dịch tủy xương: thu gom dịch tủy xương phương pháp chọc hút qua da, gây tê tủy sống Tiến hành thủ thuật phòng mổ điều kiện vơ khuẩn Vị trí chọc hút gai chậu sau trên, tổng số dịch tủy xương lấy 250 ml - Kỹ thuật tách chiết, cô đặc TBG từ dịch tủy xương: phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào, pha loãng dịch tủy xương theo tỷ lệ 6:1 với dung dịch đệm (nước muối sinh lý dung dịch PBS, 6V dịch tủy xương + 1V dung dịch đệm) tách thành phần tế bào đơn nhân (MNC) dịch tủy xương (trong có chứa TBG) cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/cm 3, huyền dịch khối TBG 30 ml nước muối sinh lý - Kỹ thuật xác định thành phần chất lượng khối TBG: + Đếm số lượng tế bào có nhân thành phần tế bào máy huyết học tự động CELL-DYN 1800 (Abbott, Hoa Kỳ) kết hợp với phương pháp tế bào học kinh điển + Xác định TBG tạo máu kỹ thuật đếm số lượng tế bào CD34+ thiết bị phân tích tế bào dòng chảy FACS-Calibur (Hoa Kỳ) với phần mềm CellQuest theo quy trình ISHAGE, sử dụng sinh phẩm hãng Becton - Dickinson (Hoa Kỳ) * Thu thập xử lý số liệu: phân tích xử lý chương trình thống kê SPSS 18.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Bảng 1: Đặc điểm BN nghiên cứu (n = 126) Ti Trung bình ± SD Nam (n = 95) p N÷ (n = 31) 37,70 ± 11,98 35,56 ± 11,97 > 0,05 36,52 ± 12,26 Bảng 2: Các số tế bào dịch tủy xương trước tách BN nghiờn cu (n = 126) Giá trị Giá trị Giá trị vị thấp cao trung bình SD ml 290,00 340,00 320,69 12,49 G/L 6,10 36,60 18,53 5,65 Tỷ lệ MNC % 27,20 54,10 39,88 5,94 Tỷ lệ GRAN % 45,90 72,80 59,48 5,76 RBC T/L 2,05 4,51 3,86 0,48 HGB g/L 61,00 127,00 117,76 13,87 PLT G/L 25,00 343,00 162,57 99,02 Thể tích dịch tủy xương trước tách Số lượng tế bào có nhân dịch tủy xương Ьn xương gai chậu sau hai bên Do vậy, tư bệnh nhân đặt nằm sấp Một số tác giả ứng dụng ghép trực tiếp tủy xương vào ổ CLX, KG thân xương chày với Trong tổng số 126 khối TBG BN nghiên cứu, 95 khối TBG tách từ BN nam 31 khối TBG từ BN nữ Nghiên cứu tiến hành 126 bệnh nhân có tuổi trung bình 36,52 ± 12,26, tuổi trung bình BN hai nhóm nghiên cứu khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) BN nhỏ tuổi 15 cao 66 tuổi; bao gồm 69 BN KG, CLX thân xương dài, 29 BN ngắn chi đoạn chi điều trị kéo dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng giãn, 28 BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN điều trị ghép TBG tủy xương BN chẩn đoán bệnh dựa tiêu chuẩn lâm sàng cận lâm sàng theo mặt bệnh tương ứng ChØ sè kim lấy tủy, tất 126 BN lấy tủy thể tích thay đổi khác Healey (1990) [7] ghép trung bình 50 ml tủy xương để điều trị BN bị CLX, KG sau lấy u xương chày Connolly (1991) [4] ghép từ 100 - 150 ml tủy xương cho 20 trường hợp KG xương chày Tuy nhiên, có nghiên cứu ghép tủy xương sau tách khối TBG để điều trị CLX, KG lâm sàng Hernigou (2006) [8] lấy trung bình 306 ml tủy xương trước tách Do vậy, khó để chúng tơi tham khảo lấy dịch tủy xương người Việt Nam trưởng thành khỏe mạnh vừa đủ để đạt hiệu liền xương tối ưu Chúng thấy thông thường người trưởng thành, khỏe mạnh cho đơn vị máu (250 ml) khoảng thời gian 10 - 15 phút bình thường, khơng ảnh hưởng đến lao động, sinh hoạt Tương tự, BN khơng có bệnh mạn tính không bị thương tổn nặng kèm theo, khoảng 200 - 250 ml máu thể thích nghi bù trừ dung Lấy dịch tủy xương: qua thăm khám cho thấy đa phần xương chậu BN không to, phần gai chậu trước khơng dày, tiên lượng gặp khó khăn chọc dịch cao phân tử mà không ảnh hưởng đến huyết động Hơn nữa, với thể tích dịch tủy xương đủ lớn, hy vọng có đủ số lượng TBG cần thiết Vì vậy, chúng tơi lấy thể tích dịch tủy xương chung cho tất 101 BN 250 ml Mọi BN truyền dịch trình lấy tủy xương huyết mặn 0,9% Hes 6% Qua theo dõi sau lấy tủy TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 xương, không gặp trường hợp bị tai xương trước tách 18,53 5,65 G/L, MNC biến sốc hay tụt huyết áp chiếm 39,88 5,94%, số lượng hồng cầu Ở 126 BN nghiên cứu cho lượng huyết sắc tố 3,86 thấy số lượng tế bào có nhân dịch tủy 0,48 triệu/l, 117,76 13,87 g/l Bảng 3: Tỷ lệ số lượng tuyệt đối tế bào CD34+ dịch tủy trước tách BN nghiên cứu (n = 126) ChØ sè Tỷ l t bo CD34 ơn vị Giá trị thấp Giá trị cao Giá trị trung bình SD % 0,17 1,19 0,55 0,19 + + Số lượng tế bào CD34 /ml dịch tủy xương + Số lượng tế bào CD34 dịch tủy xương x10 0,02 0,28 0,10 0,04 x10 7,03 88,70 33,25 17,28 Bảng 4: Các số tế bào khối TBG tách BN nghiên cứu (n = 126) ChØ số ơn vị Giá trị Giá trị Giá trị thấp nhÊt cao nhÊt trung b×nh SD Thể tích khối tế bào gốc ml 21,00 55,00 32,19 5,62 Số lượng tế bào có nhân khối TBG G/L 10,80 225,20 49,08 30,79 Tỷ lệ MNC % 27,00 84,60 57,38 13,86 Tỷ lệ GRAN % 15,40 73,00 42,67 14,03 RBC T/L 0,03 1,14 0,12 0,02 HGB g/L 2,00 24,00 6,04 3,17 PLT G/L 44,00 1023,00 353,48 236,58 Dịch tủy xương tách thành phần tế bào đơn nhân cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll Trong 32,19 ± 5,62 ml khối TBG tủy xương sau tách phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào đặc, số lượng tế bào có nhân 49,08 30,79 g/l, tế bào đơn nhân chiếm đa số (57,38 13,86%) Kết tương tự nghiên cứu Nguyễn Mạnh Khánh [2] 65 BN CLX, KG thân xương chày, sau tách cô đặc Bảng 5: Tỷ lệ số lượng tuyệt đối tế bào CD34 + khối TBG BN nghiên cứu (n = 126) khối TBG tủy xương, số lượng tế bào có nhân trung bình 44,5 ± 26,0 g/l, số lượng tế bào đơn nhân khối trung bình 25,0 ± 14,6 g/l Nhiều tác giả khác cho nên tách cô đặc tủy xương trước ghép để loại bỏ tế bào không cần thiết cho trình liền xương làm tăng mật độ TBG tạo xương dịch ghép Kết cho thấy hiệu việc tách khối khối TBG tủy xương, loại tế bào không cần thiết TBG nằm khối tế bào đơn nhân ny Chỉ số T l t bo ơn vị Giá trị thấp Giá trị cao Giá trị trung b×nh SD % 0,14 4,76 1,22 0,65 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 CD34+ Tỷ lệ giữ CD 34+ Số lượng tế bào CD34+/ml khối TBG x106 Số lượng tế + bào CD34 khối TBG x106 0,06 0,54 0,30 2,03 ml 1,98 16,96 9,89 62,85 Tỷ lệ tế bào CD 34 + khối TBG tách phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào 1,22 0,65% Nghiên cứu 65 BN CLX, KG thân xương chày, số tác giả thấy tỷ lệ tế bào CD34 + trung bình 1,3 ± 0,5% (0,3 - 3,1%) Nồng độ tế bào CD34+/ml khối TBG tủy xương 0,5 ± 0,2 g/l Tổng số lượng tế bào CD34+ khối TBG trung bình 13,8 ± 5,3 x 106 Bảng 6: Tỷ lệ loại bỏ tế bào bạch cầu hạt (GRAN), hồng cầu, huyết sắc tố tiểu cầu BN nghiên cứu (n = 126) ChØ sè Tng CD 34+ ơn vị Giá trị Giá trị Giá trị thấp cao trung bình nhất SD T lệ loại GRAN % 38,00 97,68 80,83 13,49 Tỷ lệ loại hồng cầu % 95,96 99,92 99,60 0,48 Tỷ lệ loại huyết sắc tố % 96,31 99,83 99,32 0,41 Tỷ lệ loại tiểu cầu % 35,54 95,42 52,79 40,68 Khi tách phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào, tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt (GRAN) 80,83 13,49% Đây thành phần không cần thiết khối TBG Như vậy, tỷ lệ loại bỏ thành phần tương đối cao Bảng 7: Tỷ lệ giữ lại tế bào CD 34+ BN nghiên cứu (n = 126) ChØ sè ơn vị Giá trị thấp Giá trị cao Giá trị trung bình SD T l gi MNC % 7,70 68,79 34,89 12,05 % 58,25 250,27 55,96 30,46 Lần 0,7 25,83 5,67 3,15 Tỷ lệ giữ lại tế bào MNC tách TBG từ dịch tủy xương phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào 34,89 12,05% Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Mạnh Khánh [2]: tỷ lệ % tế bào CD34 + khối TBG tủy xương sau tách tăng gấp lần so với trước tách (trước tách 0,6 ± 0,2%, sau tách 1,3 ± 0,5%) Connolly (1989) [4] đánh giá hiệu tạo xương ghép tủy xương đơn tủy xương cô đặc qua ly tâm vào khoang phúc mạc ổ chậm liền xương Với thể tích ghép, kết cho thấy q trình tạo xương thúc đẩy ghép tủy xương qua ly tâm, không xảy ghép tủy xương chưa qua xử lý Tại khoang ghép tủy xương, sau ly tâm, mức độ canxi lắng đọng nhiều so với ghép tủy toàn (193% so với 101%) Tại ổ gãy chậm liền xương, tạo xương tốt mặt hoá sinh học Trên phim X quang tuần sau ghép, trình liền xương cải thiện rõ rệt nhóm ghép tủy xương qua ly tâm Theo tác giả, khác biệt sau ly tâm mật độ TBG tủy xương ghép tăng lên khiến trình tạo xương cải thiện KẾT LUẬN Qua nghiên cứu quy trình thu gom, chiết tách khối TBG từ dịch tủy xương phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào 126 BN tổn thương xương, khớp khó hồi phục, chúng tơi rút số kết luận sau: TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 - Thể tích khối TBG tủy xương thu 32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào có nhân 49,08 ± 30,79 g/l, tế bào đơn nhân chiếm đa số (57,38 ± 13,86%) Healey JH, Zimmerman PA, McDonnell JM, Lane JM Percutaneous bone marrow grafting of delayed union and nonunion in cancer patients Clin Orthop 1990, 256, pp.280-285 - Tỷ lệ tế bào CD 34 + khối TBG tủy xương 1,22 ± 0,65%, số lượng tế bào gốc CD 34+ 16,98 ± 9,89 g/l Hernigou P, Mathieu G., Poignard A, Manicom O, Beaujean F, Rourd H Percutaneous autologous bone-marrow grafting for nonunions Surgical technique J Bone Joint Surg 2006, 88A, Suppl 1, pp.322-327 - Tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân tế bào CD 34+ tương ứng 34,89 ± 12,05% 55,96 ± 30,46%; sau chiết tách, đậm độ tế bào CD 34 + tăng 5,67 ± 3,15 lần - Tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt, hồng cầu, huyết sắc tố tiểu cầu 80,83 13,49%, 99,60 ± 0,48%, 99,32 ± 0,41% 52,79 40,68% TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Thị Thu Hà TBG khả sử dụng TBG điều trị Y học Việt Nam số đặc biệt, 2004, 302 (9), tr.3-20 Nguyễn Mạnh Khánh Nghiên cứu ứng dụng ghép TBG tủy xương tự thân điều trị CLX, KG thân xương chày Luận án Tiến sỹ Y học 2010 Brazelton T, Rossi FM, Keshet GI, Blau HM From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice Science 2000, 290, pp.1775-1779 Connolly JF, Guse R, Lippiello L, Dehne R Development of an osteogenic bone marrow preparation J Bone Joint Surg 1989, 71A, pp.684-691 Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D, Rafii S Young adult bone marrowderived endothelial precursor cells restore agingimpaired cardiac angiogenic function Circ Res 2002, 90, E89-E93 Grant MB, May WS, Caballero S et al Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization Nat Med 2002, 8, pp.607-612 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ... dịch tủy xương phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào điều trị số tổn thương xương, khớp khó hồi phục ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 126 BN KG, CLX thân xương. .. phần tế bào đơn nhân cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll Trong 32,19 ± 5,62 ml khối TBG tủy xương sau tách phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào cô đặc, số lượng tế bào. .. chậu sau trên, tổng số dịch tủy xương lấy 250 ml - Kỹ thuật tách chiết, cô đặc TBG từ dịch tủy xương: phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào, pha loãng dịch tủy xương theo tỷ lệ 6:1 với