Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết này nhằm đánh giá đặc điểm hình thái vi thể mô u trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô thanh quản người. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VI THỂ KHỐI U BIỂU MƠ THANH QUẢN NGƢỜI TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH Nguyễn Văn Ba* TĨM TẮT Ung thư biểu mơ quản bệnh ác tính thường gặp ung thư đầu cổ Với nghiên cứu này, ghép tế bào (TB) ung thư quản người dòng Hep-2 vào da đùi để tạo khối ung thư phát triển chuột thiếu hụt miễn dịch “nude mice” Kết cho thấy chuột hình thành khối u sau tuần ghép 106 TB ung thư Hình thái vi thể tiêu nhuộm HE tuần sau gây u cho thấy mơ u có hình ảnh ung thư biểu mơ TB vảy quản, chưa có di tới quan * Từ khóa: Ung thư biểu mơ quản Hep-2; Chuột thiếu hụt miễn dịch; Ghép dị loài MORPHOLOGICAL STUDY OF TUMOR TISSUE IN NUDE MICE BEARING HUMAN LARYNGEAL CARCINOMA SUMMARY Laryngeal carcinoma is a common malignancy in head and neck cancers In this study, we have implanted human laryngeal carcinoma cells (Hep-2 cells line, supplied by ATCC, the USA) into athymic mice (Bal B/c immudeficient mice, namey Foxn1nu, purchaged from Charles-River Co., the USA) by subcutaneous injection of the cancer cells (with x 106 cells per one mouse) on one thigh of the mice The results showed that one week after implatation, a tumor developed at the side of injection; histological analysis of the tumor tissue (H&E staining) weeks after implatation showed typical features of laryngeal squamous cell carcinoma, without spread of the implanted cancer cells to other organs (liver, lung, kidney and spleen) of the animal * Key words: Human laryngeal carcinoma Hep-2; Nude mice; Genograft ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư quản bệnh lý ác tính thường gặp đứng thứ hai ung thư vùng đầu cổ sau ung thư vòm Ở Mỹ, ung thư quản chiếm 2% với khoảng 3.700 người chết năm 2002 [3] Tại Việt Nam, ung thư quản đứng hàng thứ chín (3%) ung thư toàn thân Bệnh thường gặp nhiều nam (80%) lứa tuổi 40 - 60, xu hướng tỷ lệ người trẻ mắc bệnh ngày nhiều [2] * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Văn Ba (bsnguyenvanba@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/9/2013; Ngày phản biện đánh giá báo: 20/10/2013 Ngày báo đăng: 8/11/2013 98 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Mơ hình ghép dị lồi ung thư mơ tế bào vảy quản có vai trò quan trọng nghiên cứu ung thư Năm 2009, Myers CS [5] tạo thành công khối ung thư loại biểu mô TB vảy quản cách tiêm dòng TB Hep-2 lấy từ khối u người vào lưỡi chuột nude nhận thấy có di đến hạch bạch huyết vùng cổ di phổi Các tác giả thấy tiêm TB vào lưỡi chuột, khối u có kích thước lớn so với tiêm da chuột nude Tại Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu nhiều mơ hình ung thư quản Do vậy, để đáp ứng yêu cầu phục vụ nghiên cứu tiền lâm sàng ung thư quản, tiến hành đề tài nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái vi thể mô u chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư biểu mô quản người ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - 10 chuột nhắt BALB/c thiếu hụt miễn dịch, TB lympho T (nude mice, Foxn1nu) nhập từ Công ty Charles-River (Hoa Kỳ) - Môi trường nuôi cấy bảo quản TB: môi trường EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium), Catalog No 30-2003, ATCC bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh penicillin streptomycine - Dòng TB ung thư biểu mô quản người Hep-2, mua từ công ty ATCC, Hoa Kỳ Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy ghép TB ung thư vào chuột: Nuôi cấy TB ung thư biểu mô quản người môi trường EMEM, bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh penicillin streptomycine Mỗi chai nuôi cấy diện tích 75 cm2 chứa 106 TB Ni cấy tăng sinh TB thay môi trường lần/tuần điều kiện nhiệt độ 370C, CO2 5% Khi TB phát triển đạt 75 - 80% diện tích, tiến hành cấy chuyển sang chai Trước ghép, rửa TB lần dung dịch PBS 1X, sau đó, tách dung dịch Trypsin-EDTA 1X Hút dung dịch, cấy TB ung thư biểu mô quản người chuẩn bị vào bơm tiêm ml với số lượng 107/ml Cố định chuột nude tiêm 0,1 ml da đùi phải (106 TB/chuột) Quá trình thao tác thực điều kiện vơ trùng tuyệt đối * Theo dõi xác định hình thành khối ung thư chuột: - Đánh giá khối u, theo dõi phát triển vị trí tiêm (đùi phải) lần/tuần, quan sát, sờ nắn đo kích thước khối u thước xác NSK - Xác định kích thước khối u: đo khối u theo hai kích thước dài x rộng thước xác NSK (Nhật Bản), lần/ tuần Xác định kích thước u theo phương pháp Yamaura CS [8] 101 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 - Theo dõi trọng lượng chuột lần/tuần, xác định biến đổi trọng lượng chuột lần cận * Xác định hình thái vi thể khối ung thư chuột: - Sau tuần tiến hành giết chuột, bóc tách khối u tạng (gan, phổi, lách, thận), bảo quản dung dịch formalin 10%, 24 - 48 Tiếp theo, khối u tạng đúc khối paraffin, cắt lát dày m, nhuộm HE (hematoxylin eosin) - Đọc, phân tích hình thái vi thể mơ ung u tạng kính hiển vi quang học Kỹ thuật tiến hành Khoa Giải phẫu Bệnh lý, Bệnh viện 103 * Xử lý số liệu: sử dụng phần mềm SPSS15.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm vi thể khối u đùi chuột nude Sau tuần gây u, tiến hành giết chuột, lấy tiêu làm mô học (nhuộm HE) quan sát kính hiển vi quang học, nhận thấy: TB u tạo thành dải, mật độ TB cao TB u có hình đa diện, nhân to nhỏ, khơng đều, tăng kiềm tính, chất màu thơ đậm, nhiều hình ảnh nhân chia bất thường, tỷ lệ nhân so với bào tương lớn Một số nơi TB u bị loạn sừng tạo thành cầu sừng Những TB ung thư xâm nhập lòng mạch xâm lấn phá hủy mô vân Mô ung thư thường có ổ hoại tử lớn nhỏ Mơ đệm dải xơ mảnh bị thâm nhiễm, TB viêm lympho Đây hình ảnh ung thư biểu mơ TB vảy quản 1 Hình 1: Hình ảnh TB ung thư TB u tạo thành dải, mật độ TB cao (1) Mô đệm (2) dải xơ mảnh bị thâm nhiễm, TB viêm lympho (HE,100x) 102 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình 2: TB ung thư hình đa diện, nhân to nhỏ khơng đều, tăng kiềm tính, phần bào tương nhìn khơng rõ TB nằm chồng lên Nhân chia khơng điển hình (1), nhân (2), hạt nhân (3), (HE 400x) Hình 3: Hình ảnh TB ung thư dày đặc xâm lấn phá hủy mô vân TB u tạo thành cầu sừng TB ung thư (1), TB ung thư hoại tử (2), cầu sừng (3) (HE, 400x) 102 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình Hình ảnh TB ung thư (1) hoại tử u (2) (HE, 100x) Đặc điểm vi thể quan gan, lách, phổi, thận chuột sau gây u Kết nhuộm HE quan sát kính hiển vi mơ gan, lách, phổi, thận chuột sau 28 ngày gây u cho thấy khơng có biến đổi lớn cấu trúc khơng có xâm nhập TB ung thư đến quan khảo sát Hình 5: Hình ảnh gan chuột 28 ngày sau gây u Cấu trúc tiểu thùy gan bình thường, Khoảng cửa; Các dải TB gan (HE x 400) 103 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 1 Hình 6: Hình ảnh lách chuột 28 ngày sau gây u Tủy đỏ (1), tủy trắng (2) (HE,100x) Hình 7: Hình ảnh phổi chuột 28 ngày sau gây u (1) Các phế nang, (2) Tiểu phế quản tận (HE, 400x) 104 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 Hình 8: Hình ảnh thận chuột 28 ngày sau gây u (1) Tiểu cầu thận; (2) Ống lượn gần; (3) Ống lượn xa; (4) Mạch máu (HE, 400x) BÀN LUẬN Kết nghiên cứu hình thái vi thể khối u quản chuột nude có đặc điểm giống khối u quản nguyên phát người [6] Điều có ý nghĩa để nghiên cứu đặc tính sinh học hình thành phát triển khối u, từ tiếp tục nghiên cứu tìm dược chất phương pháp trị liệu ung thư điều trị ung thư quản thực nghiệm, tiến tới áp dụng cho điều trị ung thư quản người dòng Hep-2 (loại ung thư biểu mô TB vảy) Trên giới, có nhiều tác giả nghiên cứu tác dụng loại thuốc phương pháp trị liệu ung thư quản chuột nude Đáng ý nghiên cứu Shilipa CS [7], kết cho thấy chất methanol chiết xuất từ rễ Rubia cordifolia Linn, thuộc họ Rubiaceace làm giảm tăng sinh TB ung thư làm biến đổi hình thái vi thể TB này, gây chết TB ung thư nhiều hay tùy thuộc vào liều thời gian điều trị (24 giờ, 48 giờ) Đặc điểm TB ung thư tăng sinh kiểm soát nhóm nhiều nhóm TB với hình ảnh hạt nhân lớn, nhân quái, nhân chia tạo thành khối u di giai đoạn cuối Vì vậy, nghiên cứu này, chúng tơi quan sát hình ảnh vi thể quan có lực với TB ung thư gan, lách, phổi, thận 105 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ 9-2013 Hình ảnh vi thể quan gan, phổi, lách, thận chuột nude 28 ngày sau gây u cho thấy cấu trúc quan bình thường khơng có hình ảnh di TB ung thư đến gan, phổi, lách, thận, phù hợp với nghiên cứu Andreas P Kyriazis CS [4] Nhóm tác giả tiêm x 106 x 107 TB dòng Hep-2 da chuột nude mà khơng thấy có di TB ung thư đến gan, phổi, lách, thận Đồng thời, họ tiến hành cấy ghép x 106 x 107 TB ung thư vào chuột nude, 3/7 chuột xuất di Vào ngày thứ 28 sau gây u, quan sát thấy khoang phúc mạc lấp đầy với khoảng ml chất lỏng màu vàng nhạt có chứa số lượng lớn TB ung thư Khối u lớn hay nhỏ hay nốt rắn chiếm toàn ổ bụng, xương chậu mơ sau phúc mạc Nhóm TB ung thư thâm nhập rộng rãi vào thành ruột, gan, thận, tuyến tụy di đến gan biểu bật Các TB ung thư tìm thấy phổi chuột động mạch, phế nang, mao mạch phổi Chúng lựa chọn phương pháp tiêm TB ung thư vào tổ chức da chuột với liều trung bình 106 TB/chuột cách làm phổ biến nhất, Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn CS [1] sử dụng trước Bằng phương pháp này, khơng cần gây mê động vật, khối u phát triển, dễ dàng can thiệp vào khối u để điều trị đo kích thước Đồng thời, kỹ thuật tạo khối u với kích thước tương đối đồng đều, khoảng 593,6 ± 117,2 mm3, vị trí da Vì vậy, tạo thuận lợi cho trình theo dõi phát triển khối u hàng ngày biện pháp khơng can thiệp Điều có ý nghĩa nghiên cứu, vì, để đánh giá khối u phát triển động vật phức tạp, khối u khơng khu vực ngoại vi khó theo dõi Tuy nhiên, hạn chế môi trường tổ chức da, thời gian nghiên cứu ngắn (28 ngày), dòng TB ung thư Hep-2 di so với phương pháp đưa trực tiếp vào quan loại [4] Điều nhiều ảnh hưởng đến nghiên cứu tiền lâm sàng liên quan tới trị liệu di ung thư KẾT LUẬN Hình thái vi thể tiêu nhuộm HE cho thấy mơ u có hình ảnh ung thư biểu mơ TB vảy quản chưa có di tới quan lân cận - Tế bào ung thư tạo thành dải, mật độ TB cao xâm nhập mạch, xâm lấn vân TB u có hình đa diện, nhân to nhỏ khơng đều, tăng kiềm tính, chất màu thơ đậm, nhiều hình ảnh nhân chia bất thường, tỷ lệ nhân so với bào tương lớn Một số nơi TB u bị loạn sừng tạo thành cầu sừng Mô ung thư thường có ổ hoại tử lớn nhỏ Mơ đệm dải xơ mảnh, bị thâm nhiễm TB viêm lympho - Hình ảnh vi thể quan có 106 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 lực với TB ung thư: gan, lách, phổi, thận chưa thấy có di khối u Daisuke Sano and Jeffrey N Myers Xenograft models of head and neck cancers., Head & Neck Oncology 2009, 32 (1), pp.1-6 TÀI LIỆU THAM KHẢO Manuela Sacchi, Carl H Snyderman, Dae Seog Heo et al Local adoptive immunotherapy of human head and neck cancer xenografts in nude mice with lymphokine-activated killer cells and interleukin Cancer Research 1990, 50, pp.3113-3118 Hồ Anh Sơn, Nguyễn Lĩnh Toàn, Bùi Khắc Cường, Nguyễn Văn Ba Tạo khối ung thư vú người chuột nude Tạp chí YDược học Quân sự, KC.10 2012, tr.1-5 Võ Quốc Trứ, Trần Minh Trường Đối chiếu lâm sàng hình ảnh học MRI ung thư quản Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh 2009, tr.239-242 American Academy of OtolaryngologyHead and Neck surgery Laryngeal Cancer Factsheet Source: www.entnet.org Andreas P Kyriazis, Linda DiPersio, Gabriel J Michael et al Growth patterns and metastatic behavior of human tumors growing in athymic mice Cancer Research 1978, 38, pp.3186-3190 PN Shilpa, V Sivaramakrishnan, S Niranjali Devaraj Induction of apoptosis by methanolic extract of rubia cordifoliaLinn in Hep-2 cell line is mediated by reactive oxygen species Asian Pacific Journal of Cancer Prevention 2012, 13, pp.2753-2758 Yamaura et al Solitary lung tumors and their spontaneous metastasis in athymic nude mice orthotopically immplanted with human non-small cell lung cancer Neoplasia 2000, (2), pp.315-324 107 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2013 108 ... nhi u nghiên c u nhi u mơ hình ung thư quản Do vậy, để đáp ứng y u c u phục vụ nghiên c u tiền lâm sàng ung thư quản, tiến hành đề tài nhằm: Đánh giá đặc điểm hình thái vi thể mơ u chuột thi u hụt. .. hụt miễn dịch mang khối ung thư bi u mô quản người ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C U Đối tƣợng nghiên c u - 10 chuột nhắt BALB/c thi u hụt miễn dịch, khơng có TB lympho T (nude mice, Foxn1nu)... loại [4] Đi u nhi u ảnh hưởng đến nghiên c u tiền lâm sàng liên quan tới trị li u di ung thư KẾT LUẬN Hình thái vi thể ti u nhuộm HE cho thấy mô u có hình ảnh ung thư bi u mơ TB vảy quản chưa có