Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason và prednisolon bằng HPLC để kiểm tra một số chế phẩm đông dược. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI DEXAMETHASON ACETAT BETAMETHASON VÀ PREDNISOLON BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ĐỂ KIỂM TRA MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐƠNG DƢỢC Đào Văn Đơn*; Nguyễn Hồng Hải** Nguyễn Thị Thủy*; Nguyễn Thị Thanh Phương** TĨM TẮT Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời đồng thời dexamethasone acetate (DA), betamethasone (BE) prednisolone (PR) phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector UV, pha động ACN:H 2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl Quy trình định lượng thẩm định đầy đủ Trong khoảng - 200 g/ml, diện tích peak nồng độ có tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ Giới hạn định lượng chất DA, BE PR 1,0 g/ml, 0,5 g/ml 0,5 g/ml Độ xác < 2% Độ 92 - 100% Quy trình hồn tồn ứng dụng để kiểm tra DA, BE PR chế phẩm đơng dược thị trường * Từ khóa: Glucocorticoid; Dexamethason acetat; Betamethason; Prednisolon; Sắc ký lỏng hiệu cao; Thuốc đông dược SIMULTANEOUS DETERMINATION OF DEXAMETHASONE ACETATE, BETAMETHASONE AND PREDNISOLONE IN HERBAL MEDICINES BY HPLC Summary A HPLC method for the simultaneous determination of glucocorticoids (dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone) in herbal medicines was validated Using acetonitrile and water as the mobile phase, Gemini C18 (250 x 4.6 nm, µm) column, UV detection at 240 nm and flow at 1.5 ml/min, the glucocorticoids were separated satisfactorily within 12 minutes The quantitation limits of dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone were about 1.0 g/ml, 0.5 g/ml and 0.5 g/ml, respectively The calibration curve of each glucocorticoid had a correlation coefficient close to The precisions were all less than 2% The recovery rates of extraction were 92 - 100% for all glucocorticoids This method can be used to detemine dexamethasone acetate, betamethasone and prednisolone simultaneously in herbal medicines * Key words: Glucocorticoid; Dexamethasone acetate; Betamethasone; Prednisolone; HPLC; Herbal medicines * Học viện Quân y * Trung tâm Kiểm nghiệm Hà Nội Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: GS TS Nguyễn Liêm PGS TS Nguyễn Văn Minh 18 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc đông dược cho thuốc tương đối an tồn, tác dụng phụ nên nhiều người tin tưởng sử dụng Tuy nhiên, nhược điểm thuốc tác dụng thường chậm Lợi dụng tâm lý người sử dụng, số sở sản xuất thuốc đông dược trộn lẫn thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược để tạo tác dụng nhanh, nhiên người sử dụng tin an toàn loại tân dược trộn quan sát khó phát Trong loại tân dược, nhóm thuốc glucocorticoid (GC) sử dụng nhiều Đặc biệt hoạt chất dexamethason acetat (DA), betamethason (BE) prednisolon (PR) chúng có tác dụng chống viêm mạnh, dễ kiếm rẻ tiền Ở nước ta, có số nghiên cứu phát GC chế phẩm đông dược [1, 2] Nếu áp dụng quy trình để kiểm tra GC gây tốn thời gian vật chất Thực tế đòi hỏi cần có quy trình phân tích đồng thời nhiều GC chế phẩm đơng dược Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason prednisolon HPLC để kiểm tra số chế phẩm đông dược NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa hoàng g, Đỗ trọng g, Ngưu tất g, Đương quy g, Phòng phong g, Phục linh g, Quế nhục g, Cam thảo g, Tế tân g, Tần giao g, Nhân sâm g - Mẫu trắng: 2,0 g mẫu tự tạo - Mẫu thử: 2,0 g mẫu tự tạo bổ sung mg chất DA, BE PR * Dung mơi, hố chất: - Chất chuẩn: DA, BE, PR Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW sản xuất - Methanol, acetonitril (Merck) đạt tiêu chuẩn HPLC - Các hố chất, dung mơi khác: ethanol, methanol, ethyl acetat, cloroform, diethyl ether, H2SO4 đặc đạt tiêu chuẩn phân tích * Thiết bị dụng cụ phân tích: Các thiết bị phân tích chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005 bao gồm: - Thiết bị phân tích: hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D, kênh dung mơi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm) Phần mềm xử lý số liệu Empower® - Thiết bị dụng cụ khác: cân phân tích Sartorius độ xác 0,1 mg, bình chạy sắc ký lớp mỏng, đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm 366 nm, bình phun thuốc thử màu; dụng cụ thủy tinh, bình định mức, pipet có độ xác phù hợp Ngun vật liệu nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu * Đèi tượng nghiên cứu: * Khảo sát quy trình định lượng: - Mẫu tự tạo: chiết tạo bột cao khô từ 10 thang thuốc “Độc hoạt ký sinh thang” - Thành phần thang thuốc độc hoạt tang ký sinh: Độc hoạt 12 g, Tang ký sinh g, Xuyên khung g, Bạch thược g, Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu [1, 2, 3, 4], lựa chọn quy trình xử lý mẫu sau: Cân xác 2,0 g bột mẫu tự tạo vào bình nón có nút mài 100 ml bổ sung 21 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 thêm mg chất DA, BE, PR Thêm 20 ml ethyl acetat vào bình, đun nóng bếp cách thuỷ 10 phút Lọc nóng qua giấy lọc, chiết tiếp lần Tráng giấy lọc ethyl acetat nóng Gộp dịch chiết ethyl acetat bốc cách thuỷ tới cắn Cắn hoà tan ml MeOH, lắc siêu âm 10 phút Lọc qua giấy lọc chuyển vào bình định mức 10 ml Tráng bình rửa cắn giấy lọc ml MeOH, thêm MeOH đến vạch, lắc Dịch chiết lọc qua màng lọc 0,45 µm trước phân tích HPLC * Điều kiện sắc ký [1, 2, 3, 4]: Cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm), detector PDA quét phổ 200 - 400 nm, tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl Tiến hành khảo sát pha động ACN: H2O với tỷ lệ 30/70, 45/55 60/40 (v/v) * Thẩm định quy trình định lượng: Thẩm định quy trình định lượng theo ICH, gồm tiêu: tính tương thích hệ thống sắc ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ xác, độ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Khảo sát quy trình định lƣợng Chúng tơi tiến hành xử lý mẫu khảo sát điều kiện sắc ký theo quy trình ®ịnh lượng ghi sắc ký đồ Phân tích kết quả, lựa chọn điều kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời chất DA, BE, PR sau: cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, µm) Detector PDA; pha động ACN:H2O (45:55, v/v); tốc độ dòng 1,5 ml/phút; thể tích bơm mẫu: 10 µl Thẩm định quy trình định lƣợng * Tính tương thích hệ thống sắc ký: Tiêm sắc ký lần mẫu chuẩn hỗn hợp chất DA, BE, PR có nồng độ chất 20 µg/ml Chạy sắc ký theo điều kiện chọn Bảng 1: Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống sắc ký DA STT BE PR tR (phút) Speak (μV.s) tR (phút) Speak (μV.s) tR (phút) Speak (μV.s) 9,656 342818 4,556 388354 3,475 404278 9,677 343544 4,549 382184 3,454 399624 9,673 340630 4,551 385761 3,483 396339 9,664 351654 4,544 389145 3,489 401248 9,697 348503 4,539 394348 3,467 406105 X 9,673 345430,2 4,548 387958,4 3,474 401518,8 RSD (%) 0,16 1,31 0,14 1,16 0,40 0,97 Độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu diện tích peak chất < 2% Điều chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, ứng dụng để phân tích mẫu với kết tin cậy 22 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 * Độ chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp DA, BE, PR có nồng độ µg/ml, mẫu trắng mẫu thử a PR BE DA b a BE PR DA Hình 1: Sắc ký đồ DA, BE, PR mẫu chuẩn, mẫu thử mẫu trắng a Mẫu chuẩn hỗn hợp DA, BE, PR pha MeOH b Mẫu trắng khơng có chất phân tích c Mẫu thử có chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu trắng, vị trí tương ứng với thời gian lưu DA, BE PR không xuất peak mẫu chuẩn Các peak chất phân tích mẫu thử cân đối tách hồn tồn khỏi peak tạp Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt độ đặc hiệu cao * Khoảng nồng độ tuyến tính: Pha dãy dung dịch chuẩn DA, BE, PR nồng độ khoảng - 200 µg/ml chạy sắc ký Bảng 2: Kết xác định mối tương quan nồng độ diện tích peak DA, BE PR C (µg/ml) 20 50 100 150 200 Speak (DA) (μV.s) 81369 342818 747125 1616455 2540421 3436877 Speak (BE) (μV.s) 90786 388354 824518 1790089 2824083 3813497 Speak (PR) (μV.s) 90296 404278 842144 1838438 2891513 3908626 y(DA) = 16481x - 830; R = 0,9985 Phương trình hồi quy tuyến tính y(BE) = 18325x - 293; R = 0,9983 y(PR) = 17255x + 917; R = 0,9978 22 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Hình 2: Đường biểu diễn phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ DA, BE PR Diện tích peak nồng độ DA, BE, PR khoảng khảo sát cã tương quan chặt chẽ víi R2 ≈ * Giới hạn phát giới hạn định lượng dưới: Dựa vào độ nhiễu đường mẫu trắng đường chuẩn, ngoại suy giới hạn phát DA, BE PR 0,3 µg/ml; 0,2 µg/ml 0,2 µg/ml Giới hạn định lượng chất DA, BE PR 1,0 µg/ml; 0,5 µg/ml 0,5 µg/ml * Độ xác: Pha mẫu LQC (10 µg/ml), MQC (80 µg/ml) HQC (160 µg/ml) Mỗi nồng độ pha mẫu độc lập Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn Bảng 3: Kết xác định độ xác phương pháp HPLC D iƯ n STT (µV*s) e a ëk DA BE PR LQC MQC HQC LQC MQC HQC LQC MQC HQC 161547 1317459 2668028 173099 1425516 3023572 167169 1365628 2736538 156487 1352527 2689305 177673 1467955 2991015 165014 1323995 2782875 163165 1367089 2605408 179561 1476597 2977847 166869 1302562 2828710 158745 1305185 2621529 181071 1463504 2961584 171122 1322851 2763549 161808 1339778 2649713 177628 1435685 3056980 162608 1352944 2743346 X 160350 1336408 2646797 177806 1453851 3002200 166556 1333596 2771004 SD 2691,7 25231,1 33976,7 2997,7 22036,1 38162,3 3133,9 25353,2 37011,3 RSD (%) 1,68 1,89 1,28 1,68 1,52 1,27 1,88 1,90 1,34 Độ lệch chuẩn tương đối đều, < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ xác tốt, đáp ứng u cầu phân tích 23 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 * Độ đúng: Chúng sử dụng phương pháp thêm chuẩn (DA, BE PR) vào 2,0 g mẫu tự tạo, để xác định độ Bảng 4: Kết khảo sát độ phương pháp HPLC LOẠI CHẤT DA BE PR LƯỢNG THÊM VÀO (µg) LƯỢNG THU HỒI (µg) TỶ LỆ LƯỢNG THU HỒI THÊM VÀO (%) (µg) LƯỢNG THU HỒI (µg) TỶ LỆ THU HỒI (%) LƯỢNG THÊM VÀO (µg) LƯỢNG THU HỒI (µg) TỶ LỆ THU HỒI (%) 100 95,87 95,87 1000 935,7 93,57 1500 1397,4 93,16 100 93,12 93,12 1000 915,5 91,55 1500 1383,3 92,22 100 89,28 89,28 1000 917,8 91,78 1500 1415,1 94,34 100 93,75 93,75 1000 903,9 90,39 1500 1367,7 91,18 100 95,16 95,16 1000 949,3 94,93 1500 1349,3 89,95 X 93,44 92,44 92,17 RSD (%) 2,75 1,94 1,85 100 97,8 97,8 1000 958,1 95,81 1500 1453,1 96,87 100 98,3 98,3 1000 963,4 96,34 1500 1456,8 97,12 100 95,7 95,7 1000 952,5 95,25 1500 1384,2 92,28 100 101,2 101,2 1000 913,8 91,38 1500 1376,3 91,75 100 93,1 93,1 1000 891,7 89,17 1500 1427,4 95,16 X 97,22 93,59 94,64 RSD (%) 2,78 3,01 2,38 100 97,5 97,5 1000 975,4 97,54 1500 1414,2 94,28 100 98,3 98,3 1000 957,3 95,73 1500 1456,7 97,11 100 99,8 99,8 1000 936,7 93,67 1500 1369,8 91,32 100 102,7 102,7 1000 985,3 98,53 1500 1407,8 93,85 100 97,6 97,6 1000 941,6 94,16 1500 1447,8 96,52 X 99,18 95,93 94,62 RSD (%) 1,94 2,19 2,19 Tỷ lệ thu hồi DA, BE PR cao, khoảng từ 92 - 100%, cho thấy: phương pháp chiết lựa chọn cho phép chiết gần hoàn toàn DA, BE PR (tû lÖ chiÕt tõ 92,17 - 99,18%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ cao Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời DA, BE PR phương pháp HPLC Quy trình xử lý mẫu: chiết cách thuỷ ethyl acetat (3 lần × 10 phút/lần); dịch chiết cách thuỷ đến cắn hoà tan cắn MeOH để phân tích HPLC Điều kiện HPLC: cột sắc ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 24 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 1-2013 µm), detector UV, pha động ACN:H 2O (45:55, v/v), tốc độ dòng 1,5 ml/phút, thể tích bơm mẫu 10 µl Quy trình định lượng thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn ICH ứng dụng để kiểm tra GC chế phẩm thuốc đông dược thị trường TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồng Thị Hoa Nghiên cứu phát dexamethason trộn trái phép thuốc đông dược phương pháp sắc ký Khóa luận Tốt nghiệp Dược sü đại học Trường Đại học Dược Hà Nội 2007, tr.20-30 25 Lê Đào Khánh Long Góp phần tìm hiểu phương pháp định tính phát betamethason dexamethason pha trộn trái phép chế phẩm đơng dược Khố luận Tốt nghiệp Dược sỹ đại học Trường Đại học Y - Dược Thành phố Hồ Chí Minh 2009, tr.21-28 Asean Identification of dexamethasone, betamethasone, hydrocortisone acetate, betamethasone 17-valerate, and triamcinolone acetonide in cosmetic products by TLC and HPLC, ACM MAL 07 Ku, Y R, Wen, K C, Ho, L K., Chang, Y S Solid phase extraction and high performance liquid chromatographic determination of steroids adulterated in traditional Chinese medicines Journal of Food and Drug Analysis 1999, (2), pp.123-130 ... trình để kiểm tra GC gây tốn thời gian vật chất Thực tế đòi hỏi cần có quy trình phân tích đồng thời nhiều GC chế phẩm đơng dược Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài nhằm mục tiêu: Định lượng đồng thời. .. hành đề tài nhằm mục tiêu: Định lượng đồng thời dexamethason acetat, betamethason prednisolon HPLC để kiểm tra số chế phẩm đông dược NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Địa hoàng g, Đỗ trọng... dụng, số sở sản xuất thuốc đông dược trộn lẫn thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược để tạo tác dụng nhanh, nhiên người sử dụng tin an toàn loại tân dược trộn quan sát khó phát Trong loại tân dược,