Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của bài viết nhằm thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BKV ở bệnh nhân sau ghép thận.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG NỒNG ĐỘ ADN BK POLYOMAVIRUS BẰNG KỸ THUẬT TAQMAN PROBE REAL-TIME PCR Hoàng Xuân Sử*; Trịnh Thị Mỹ Anh**; Nguyễn Sỹ Lánh*** Phan Quốc Toản****; Nguyễn Giang Hòa****; Đinh Thị Thu Hằng* TĨM TẮT Mục tiêu: thiết lập kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK polyomavirus ADN Vật liệu phương pháp: kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK polyomavirus ADN cơng trình nghiên cứu thiết lập với cặp mồi, probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus, Bioedit đánh giá bước đầu mẫu chuẩn ADN mẫu huyết tương, nước tiểu 10 bệnh nhân sau ghép thận có BK polyomavirus (+) 10 mẫu máu ngoại vi người hiến máu tình nguyện BK polyomavirus (-) Kết kết luận: phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược loại, 0,05 o μ probe, μl ADN khn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl, chu trình nhiệt: (50 C/2 o o o o phút) (95 C/15 phút) (94 C/15 giây, 58 C/60 giây) x 45 chu kỳ, trì C Kỹ thuật Taqman probe real-time PCR đạt ngưỡng phát copy/µl panel mẫu với độ tin cậy 95%, bước đầu đánh giá cho kết tương đương so sánh với kit RealStar® BKV PCR 1.0 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, góp phần chủ động việc theo dõi giám sát BK polyomavirus bệnh nhân sau ghép thận Việt Nam * Từ khóa: BK polyomavirus; Bệnh thận B Taqman probe real-time PCR polyomavirus; Định lượng; Ghép thận; Quantification of BK Polyomavirus Load in Vietnamese Renal Transplant Recipients by an In-house Taqman Probe Real-time PCR Assay Summary Objectives: To establish an in-house real-time PCR assay using Taqman probe for detection and quantification of BKV DNA load in renal transplant recipients Materials and methods: An inhouse quantitative real-time PCR assay was established with specific primer pairs and Taqman probe targeting VP1 gene of BKV using Primer3plus and Bioedit We also initially evaluated performance of the developed assay on 10 fold serial dilutions of plasmid DNA inserted VP1 gene sequence of BKV as well as clinical specimens collected from 10 recipients infected with * Học viện Quân y ** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia *** Bệnh viện Việt Đức **** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/02/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 17/05/2018 Ngày báo đăng: 30/05/2018 29 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 BKV after renal transplantation and peripheral blood samples from 10 healthy blood donors negative for BKV DNA Results and conclusion: The optimization of real-time PCR assay had the following components: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Germany); 05 μM probe, μl DNA template, and deionized H2O equals to 20 μl, was performed using the Rotoro o GeneQ instrument with the cycling conditions as follows: 50 C for mins, denaturation at 95 C o o for 15 mins, followed by 45 cycles of amplification at 94 C for 15s, 58 C for 60s In the developed assay, the limit of detection is copy/µl on DNA panel at 95% confidence In conclusion, this Taqman probe real-time PCR assay achieved a concordant result with the RealStar BKV PCR 1.0 kit on 20 clinical specimens contributes to monitoring and surveilance of BKV of kidney transplant recipients in Vietnam * Keywords: BK polyomavirus; BK polyomavirus-associated nephropathy; Quantification; Renal transplantation; Taqman probe real-time PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Hơn 40 năm qua kể từ B polyomavirus (BKV) lần phân lập từ nước tiểu bệnh nhân (BN) ghép thận (viết tắt BK) bị hẹp niệu quản [2], loài virut hội cần nghiên cứu để làm sáng tỏ chế bệnh học nhiều bệnh liên quan BKV thành viên nhóm nhỏ Polyoma Papovaviruses, bao gồm BKV, JC virut Simian 40 virut (SV-40), loại virut phổ biến với tỷ lệ huyết dương tính trẻ em trung bình 80% [4] Nhiễm B V thường khơng có triệu chứng lâm sàng, nhiên số triệu chứng ghi nhận sốt viêm đường hô hấp thể nhẹ [5] Sau nhiễm nguyên phát, B V tiềm ẩn nhiều quan thể, đặc biệt tế bào biểu mô niệu đạo biểu mơ thận hi thể tình trạng bị ức chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch qua trung gian tế bào có liên quan đến tái hoạt động chép virut, dẫn đến kích hoạt chuỗi phản ứng phân giải tế bào [6] Ở BN ghép thận, sau BKV nhân lên, vào mao mạch, xuất nước tiểu (viruria) công 30 phận ghép, dẫn đến tổn thương khác hoảng 1/3 số BN có viruria phát triển B V máu (viremia), không can thiệp kịp thời phát triển thành bệnh thận B V (B Vassociated nephropathy, B VN) với tỷ lệ dao động - 10%, dẫn đến thải ghép, chức thận ghép [5] Việc tái hoạt động BKV người nhận ghép thận với dấu hiệu thường gặp virut phát tán nước tiểu với tỷ lệ 20 - 60% BN [6] Trong đó, người khỏe mạnh hay BN có khả miễn dịch, tượng tái hoạt động B V xuất B V viruria Ngoài liên quan đến thận ghép, B V thường gặp người nhận ghép tủy xương [7], hay số báo cáo cho thấy B V B V viruria BN ghép tạng thận ghép tim, phổi gan Nhìn chung, BKV có mặt máu nước tiểu không liên quan đến suy giảm chức thận BN [4, 5, 8, 9] Như vậy, đến BKV khẳng định nguyên nhân quan trọng hàng đầu dẫn đến B VN BN sau ghép thận 4] Hiện tượng mô thận ghép thấy 45% BN BKVN [10] Chính vậy, việc chẩn đốn sớm ức chế hồn tồn BKV TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 nhân lên sau ghép thận đích điều trị cuối nhằm hồi phục chức hình thái thận ghép Định lượng nồng độ BKV ADN real-time PCR có giá trị trực tiếp phát tái hoạt động virut giám sát điều trị [1] BKV với hệ gen ADN dạng vòng, kích thước 5,13 kb, gen VP1 mã hóa cho viral protein thường sử dụng chẩn đoán Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử B V công bố Việt Nam Một số sở y tế sử dụng kít thương mại Realstar BKV PCR (Altona Diagnostics, Đức), Artus® BK Virus RG PCR Kit (Qiagen, Đức)… xác định tải lượng BKV ADN, nhiên giá thành kít cao, đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng chưa đề cập đến khía cạnh kít khơng phù hợp với số chủng BKV Việt Nam Chính vậy, chúng tơi thực cơng trình nhằm: Thiết lập kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp phần chủ động việc theo dõi giám sát BKV BN sau ghép thận VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm Lựa chọn mẫu máu ngoại vi (06 mẫu, ký hiệu PB 1, 2, 5, 7, 8, 10), nước tiểu (04 mẫu, ký hiệu PBK3, 4, 6, 9) 10 BN sau ghép thận có BKV (+), BN B VN (PB 10) khẳng định mô bệnh học kết hợp với phân tích trình tự gen VP1 BKV, BN lại khẳng định semi-nested PCR theo Arthur CS [11] (nhóm bệnh) 10 mẫu máu ngoại vi người hiến máu tình nguyện BKV (-) (nhóm chứng) Các mẫu bệnh phẩm cung cấp nhờ hợp tác nghiên cứu Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y Khoa Thận, Lọc máu - Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức Bệnh viện Trung ương Huế Thiết lập kỹ thuật Taqman probe real-time PCR 200 µl mẫu huyết tương, cặn nước tiểu sử dụng để tách chiết BKV ADN theo quy trình kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), thu 100 µl mẫu ADN Cặp mồi, Taqman probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus Bioedit dựa trình tự tham chiếu gen VP1 BKV cơng bố Genbank có tên qBK-F/R, qBK-Pr đặt Hãng IDT, Mỹ tổng hợp, có trình tự qBK-F: 5’TAGGCGCCAACCATTAGAC-3’; qB -R: 5’- ACGTAATGGCACTTGCTCG-3’; qB -Pr: 5’-FAM- GAGCAGCCGCAGCCCATATAGGCBHQ1-3’ Quá trình tối ưu kỹ thuật realtime PCR bao gồm khảo sát chu trình nhiệt, đánh giá nhiệt độ gắn mồi khác nhau; tối ưu thành phần tham gia sở phản ứng realtime PCR tiêu chuẩn Phản ứng real-time PCR có thành phần sau: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 - 0,5 μ mồi xuôi, mồi ngược loại, 0,05 - 0,3 μ probe, μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl Quá trình khuếch đại thực máy real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen, Đức) với chu trình: (50oC/2 phút) 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 (95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 56 60oC/60 giây) x 45 chu kỳ, trì 7oC Kết real-time PCR tối ưu lựa chọn giá trị khảo sát cho chu kỳ ngưỡng thấp Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN mẫu chuẩn ADN: Bộ mẫu chuẩn ADN thiết lập từ mẫu plasmid tinh khiết pGEMT-VP1 pha loãng nước khử ion tạo dải nồng độ 100 - 108 (copy/µl) Plasmid pGEMT-VP1 thiết lập qua đường tái tổ hợp, chứa trình tự gen VP1 BKV phân lập từ BN BKVN khẳng định giải trình tự [2] Bộ mẫu chuẩn ADN sở để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết lập xác định nồng độ BKV ADN * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN mẫu lâm sàng: Kỹ thuật real-time PCR khảo sát 10 mẫu BKV ADN BN sau ghép thận có BKV (+) 10 mẫu BKV (-) huyết tương người khỏe mạnh hiến máu tình nguyện xác định BKV (-) semi-nested PCR theo Arthur CS [11] Đồng thời, định lượng BKV ADN đối chứng với kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Altona Diagnostics, Đức) có chứng CE-IVD [12] Tất thử nghiệm tối ưu định lượng tiến hành lặp lại lần, xác định giá trị trung bình, lần chạy có chứng âm nước khử ion chứng dương 32 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Thiết lập tối ưu kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN Kỹ thuật real-time PCR thiết lập tối ưu mẫu chứng dương huyết tương BN sau ghép thận bị BKVN Sử dụng phần mềm chuyên dụng để thiết kế mồi, probe hoàn toàn cho kỹ thuật Taqman probe real-time PCR có khả xác định BKV ADN phù hợp với chủng Việt Nam quốc tế Để hiệu suất phản ứng real-time PCR lý tưởng, tối ưu điều kiện thành phần phản ứng a b Hình 1: Biểu đồ khuếch đại tối ưu kỹ thuật real-time PCR phát BKV AND (A: Tối ưu nồng độ mồi - 4: Nồng độ mồi tương ứng 0,2; 0,3; 0,4 0,5 µM; dc: Đối chứng âm nước kh ion; B: Tối ưu nồng độ probe từ 0,05 - 0,3 µM) TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Từ kết hình 1A cho thấy: nồng độ mồi cho giá trị Ct sớm 0,2 µ Như vậy, nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng real-time PCR BKV Trên sở nồng độ mồi tối ưu, nồng độ probe khảo sát mức 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 µM ết cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM nồng độ thấp mà cho kết đáng tin cậy Do đó, nồng độ probe tối ưu lựa chọn cho phản ứng real-time PCR BKV ADN 0,05 µM (hình 1B) Chu trình nhiệt tối ưu xác định sau: (50oC/2 phút) (95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 58oC/60 giây) x 45 chu kỳ, trì 7oC Bảng 1: Thành phần tối ưu kỹ thuật real-time PCR Thành phần STT Nồng độ cuối Thể tích (µ ) 1X 10 QuantiTect Probe PCR master mix qBK-F/R µM 0,2 µM 0,8 Probe qBK-Pr µM 0,05 µM 0,2 Nước khử ion DNA/RNAase free - BKV ADN Tổng Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN Trong cơng trình này, sở có sẵn mẫu chuẩn dương plasmid tái tổ hợp chứa gen đích VP1, lựa chọn mẫu plasmid có nồng độ, độ tinh cao (nồng độ 1010 copies/µl, A260/280: 2,01 xác định máy đo quang phổ Nanodrop ND-1000) làm mẫu chuẩn Theo cách này, mẫu chuẩn có độ đồng cao pha lỗng thành nồng độ xác, hướng thiết lập WHO NIBSC (National Institute for Biological Standards and Control, Viện Quốc gia Kiểm chuẩn Sinh học) khuyến cáo Các mẫu plasmid có dải nồng độ 100 - 108 (copies/µl) chia nhỏ thành nhiều 20 ống, ống chứa ADN plasmid đủ dùng cho phản ứng, bảo quản điều kiện -20oC Kỹ thuật real-time PCR sau tối ưu đánh giá mẫu chuẩn BKV ADN cho hiệu suất phản ứng PCR đạt 103,7%, sai số 0,005 - giá trị gần lý tưởng, cho thấy quy trình tối ưu real-time PCR thao tác kỹ thuật tốt, mẫu chuẩn đạt nồng độ có độ xác cao Theo tính tốn, ngưỡng phát kỹ thuật real-time PCR mẫu chuẩn ADN thiết lập đạt copy/µl với độ tin cậy 95% ngưỡng đạt số kít thương mại (dữ liệu khơng trình bày) Đây sở để đánh giá kỹ thuật realtime PCR định lượng nồng độ BKV ADN mẫu lâm sàng (hình 2) 33 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 5-2018 Hình 2: Biểu đồ khuếch đại định lượng nồng độ BKV ADN mẫu lâm sàng đường chuẩn standard curve kỹ thuật real-time PCR phát triển (SK2-SK4: mẫu chuẩn với nồng độ 103; 102; 101 (copies/µl); PBK1-PBK3: Các mẫu bệnh phẩm BK (+); NC: Đối chứng âm nước kh ion) Bước đầu, đánh giá đồng thời kỹ thuật real-time PCR phát triển (đặt tên kít LDA_BK) kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0 (Hãng Altona) mẫu lâm sàng gồm 10 mẫu bệnh phẩm dương tính với BKV 10 mẫu âm tính Kết giá trị trung bình lần thử nghiệm 10 mẫu bệnh phẩm B V dương tính thống kê theo bảng 2, 10 mẫu âm tính khơng xuất tín hiệu huỳnh quang với kít Bảng 2: Nồng độ mẫu bệnh phẩm B V dương tính Nồng độ copy/ m STT Mã Kít LDA_BK Kít Altona Log copy/ ml Kít LDA_BK Kít Altona Sự khác biệt ( og) Hệ số biến thiên CV% (log) PBK1 1.88E+04 1.36E+04 4.27 4.13 0.14 2.37 PBK2 2.90E+04 1.69E+04 4.46 4.23 0.24 3.84 PBK3* 9.98E+08 5.1E+08 9.00 8.71 0.29 2.33 PBK4* 1.10E+07 1.01E+07 7.04 7.00 0.04 0.39 PBK5 5.16E+03 5.13E+02 3.71 2.71 1.00 22.1 PBK6* 9.45E+08 2.08E+08 9.98 9.32 0.66 4.82 PBK7 1.70E+03 1.35E+03 3.23 3.13 0.10 2.23 PBK8 1.13E+06 3.67E+05 6.05 5.56 0.49 5.95 PBK9* 2.48E+05 1.21E+05 5.39 5.08 0.31 4.2 10 PBK10 3.24E+04 1.70E+04 4.51 4.23 0.28 4.53 (*: Mẫu nước tiểu) 34 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Từ kết đánh giá cho thấy, kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN phát triển xác định 10 mẫu bệnh phẩm BKV (+), kết tương đương so với kít thương mại RealStar® BKV PCR 1.0, thể qua khác biệt số log giá trị nồng độ (sử dụng kít khác nhau) hệ số biến thiên (CV%) mẫu Giá trị nồng độ xác định kít LDA_BK từ 103 - 108 copies/ml Chỉ có mẫu PBK5 nồng độ khác biệt log, CV 22,1%, điều lý giải kít khác chiến lược thiết kế mồi, mẫu chuẩn, sai khác lần thao tác Đồng thời, số lượng mẫu đánh giá cơng trình hạn chế nên chưa thể khẳng định khác biệt mẫu PB có ý nghĩa thống kê hay không Phát B V viremia kỹ thuật real-time PCR khẳng định có giá trị chẩn đốn dương tính giá trị chẩn đốn âm tính cao cho B VN so với phát viruria xét nghiệm tế bào decoy hay PCR Tuy nhiên, tương tự xét nghiệm real-time PCR theo dõi tải lượng virut khác, có khác biệt đáng kể cách phát triển kỹ thuật dẫn đến khó khăn so sánh kết phòng thí nghiệm khác xác định giá trị ngưỡng chẩn đoán điều trị B VN Tuy nhiên, Hirsch CS xác định mức nồng độ B V ADN > 104 copies/ml huyết tương tuần BN sau ghép thận có liên quan đến B VN với độ đặc hiệu 93% 9], giá trị nêu hướng dẫn gần huyến nghị trung tâm giới sử dụng khảo nghiệm, sai khác nồng độ chấp nhận log Ghép thận phương pháp điều trị thay hiệu cho BN bệnh thận mạn giai đoạn cuối Ở nước ta ước tính có khoảng 80.000 BN bị bệnh thận mạn giai đoạn cuối năm khoảng 4.000 BN có nhu cầu ghép thận Việc theo dõi điều trị BN sau ghép thận đóng vai trò quan trọng trì chức thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy mô ghép hay suy chức thận ghép Nguyên nhân dẫn đến suy chức thận ghép đồng loại chủ yếu BKV nhân lên tế bào biểu mô ống thận, làm tổn thương, hoại tử ống thận trực tiếp Ống thận hoại tử tỷ lệ với BKV nhân lên, nhiên BKV nhân lên bị giới hạn vùng tủy thận không làm ảnh hưởng đến chức thận ghép Do đó, giai đoạn sớm bệnh khó xác định biểu BKVN Chỉ BKV bắt đầu nhân lên xảy vùng vỏ thận, có mối liên quan rõ với hoại tử tế bào biểu mô ống thận nồng độ creatinin huyết tăng Cơ chế dẫn đến rối loạn chức mô ghép thận đồng loại xác định rò rỉ nước tiểu chảy ngược từ ống thận bị tổn thương vào khoang kẽ mao mạch quanh ống thận Do đó, tổn thương hoại tử ống thận cấp dấu hiệu quan trọng BKVN BKV hoạt động BKVN phát triển phụ thuộc vào hiệu điều trị giảm liều thuốc ức chế miễn dịch đáp ứng miễn dịch kháng virut thể chủ Diễn biến tái hoạt động BKV phát trực tiếp xác định tải lượng BKV ADN hỗ trợ phát gián tiếp qua theo dõi đáp ứng 35 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 miễn dịch đặc hiệu với B V Do đó, sử dụng kỹ thuật real-time PCR tối ưu xác định tải lượng BKV ADN giúp theo dõi, giám sát số máu nước tiểu, công cụ có giá trị tiên lượng BKVN, cần nghiên cứu phát triển Việt Nam renal transplantation Lancet 1971, (7712), pp.1253-1257 KẾT LUẬN Sharma R et al BK virus in kidney transplant: Current concepts, recent advances, and future directions Exp Clin Transplant 2016, 14 (4), pp 377-384 Đã thiết lập thành công kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN huyết tương, nước tiểu BN sau ghép thận với ngưỡng phát copy/µl panel mẫu, độ tin cậy 95% Phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược loại, 0,05 μ probe, μl ADN khuôn, nước khử ion DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl, với chu trình nhiệt thực máy real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen, Đức) Kỹ thuật real-time PCR bước đầu đánh giá cho kết tương đương so với kít RealStar® BKV PCR 1.0 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng Reploeg M.D, G.A Storch, D.B Clifford BK virus: a clinical review Clin Infect Dis 2001, 33 (2), pp.191-202 Sawinski D S Goral BK virus infection: an update on diagnosis and treatment Nephrol Dial Transplant 2015, 30 (2), pp.209-217 Pavlakis M A, Haririan, D.K Klassen BK virus infection after non-renal transplantation Adv Exp Med Biol 2006, 577, pp.185-189 Loeches B et al BK virus in liver transplant recipients: a prospective study Transplant Proc 2009, 41 (3), pp.1033-1037 Remund K.F, M Best, J.J Egan Infections relevant to lung transplantation Proc Am Thorac Soc 2009, (1), pp.94-100 Hirsch H.H et al Polyomavirusassociated nephropathy in renal transplantation: critical issues of screening and management Adv Exp Med Biol 2006, 577, pp.160-173 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 Bohl D.L, D.C Brennan BK virus nephropathy and kidney transplantation Clin J Am Soc Nephrol 2007, Suppl 1, pp.S36-46 Đinh Thị Thu Hằng, Hoàng Xuân S Đặc điểm kiểu gen BK polyomavirus bệnh nhân sau ghép thận miền Bắc Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN Khoa học Y Dược 2018, tập 34, số tr.1-6 11 Arthur R.R, S Dagostin, K.V Shah Detection of BK virus and JC virus in urine and brain tissue by the polymerase chain reaction J Clin Microbiol 1989, 27(6): pp 1174-9 Gardner S.D et al New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after 12 RealStar® BKV PCR Kit 1.0_https://www.altona-diagnostics.com 2016 36 ... Kết real-time PCR tối ưu lựa chọn giá trị khảo sát cho chu kỳ ngưỡng thấp Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng độ BKV ADN. .. VP1 BKV phân lập từ BN BKVN khẳng định giải trình tự [2] Bộ mẫu chuẩn ADN sở để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết lập xác định nồng độ BKV ADN * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định lượng nồng. .. định giá trị trung bình, lần chạy có chứng âm nước khử ion chứng dương 32 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Thiết lập tối ưu kỹ thuật real-time PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN Kỹ thuật real-time PCR