Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm hoàn thiện quy trình phát hiện các đột biến gây bệnh beta -thalassemia từ 1 tế bào bạch cầu bằng phương pháp minisequensing. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TỪ MỘT TẾ BÀO ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH BETA-THALASSEMIA BẰNG PHƢƠNG PHÁP MINISEQUENCING Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang*; Đặng Tiến Trường* Nguyễn Đình Tảo* Triệu Tiến Sang*; Nguyễn Thu Hà**; Hồng Đặng An Sinh* TĨM TẮT Mục tiêu: hồn thiện quy trình phát đột biến gây bệnh beta -thalassemia từ tế bào bạch cầu phương pháp minisequensing Đối tượng phương pháp: tế bào bạch cầu lympho bệnh nhân (BN) người mang đột biến gen beta-globin tách khỏi máu toàn phần phương pháp ly tâm tỷ trọng dùng ficoll, lấy bạch cầu kính hiển vi soi nổi, sau ly giải tế bào, nhân gen beta-globin nested PCR, chạy minisequensing, điện di tự động phát đột biến gây bệnh đối chiếu với kết phân tích từ máu tồn phần phương pháp ARMS-PCR multiplex ARMS-PCR Kết kết luận: đột biến đối tượng phạm vi nghiên cứu phát phân tích với tế bào bạch cầu, phù hợp kết phân tích từ máu ngoại vi tồn phần để phục vụ cho chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi * Từ khóa: Beta-thalassemia; Một tế bào; Chẩn đốn di truyền tiền làm tổ; Minisequencing Single Cell Genetic Analysis for Mutation Detection in Beta-thalassemia Using Minisequencing Method Summary Objectives: Setting up a protocol for detection of beta-thalsassemia induced mutations from unique lymphocyte using minisequencing method Subjects and methods: peripheral blood lymphocytes of beta-thalassemia patients or beta-globin mutation carriers were isolated using density gradient centrifugation with ficoll One lymphocyte was taken using stereoscopic microscope, then lysised Beta-globin gene was amplified with nested PCR Minisequencing and electrophoresis were performed to detect mutations in comparison with ARMS-PCR and multiplex ARMS-PCR method Results and conclusions: All kinds of common mutations in the subjects were detected using unique lymphocyte as same result using whole peripheral blood sample * Key words: Beta-thalssemia; Single cell; Preimplantation genetic diagnosis; Minisequencing * Học viện Quân y ** Viện Huyết học Truyền máu Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tvkhoabi@gmail.com) Ngày nhận bài: 09/10/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 18/11/2014 Ngày báo đăng: 27/12/2014 32 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Beta-thalassemia bệnh di truyền đơn gen phổ biến giới [1] Ở Việt Nam, ước tính có khoảng triệu người mang gen bị bệnh Hàng năm có khoảng 2.000 trẻ sinh mắc bệnh thalassemia Các đột biến gen beta-globin gây bệnh beta-thalassemia thường đột biến điểm Tại khu vực Đông Nam Á, số đột biến thường gặp là: Cd17, Cd 41/42, Cd71/72, -28, IVS1-1, IVS1-5, IVS2-654, CD26, CD95 [2] Điều trị cho BN tạo gánh nặng kinh tế tinh thần cho gia đình tồn xã hội Chính vậy, việc phòng bệnh khống chế phát tán bệnh cộng đồng cấp thiết Hiện nay, số biện pháp can thiệp chẩn đoán trước sinh chọc hút nước ối hay sinh thiết gai rau phần hạn chế sinh trẻ bị bệnh Tuy nhiên, phương pháp thường tiến hành muộn, dừng thai kỳ ảnh hưởng lớn tới sức khỏe thai phụ Chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi (Preimplantation genetic diagnosis - PGD) phương pháp sàng lọc phôi bất thường mặt di truyền thực trước cấy phôi vào tử cung người mẹ, phương pháp dự phòng hiệu bệnh di truyền, có beta-thalassemia [3, 4, 5, 6] Tuy nhiên, kỹ thuật khó, tiến hành tế bào [1] Minisequencing phương pháp trực tiếp, sử dụng mồi đặc hiệu nucleotid gắn huỳnh quang để phát đột biến điểm [2] Để thực kỹ thuật này, cần có quy trình phát đột biến gen 33 tế bào Do đó, chúng tơi thực nghiên cứu với mục tiêu: Hồn thiện quy trình phát đột biến gây bệnh beta-thalassemia từ tế bào bạch cầu phương pháp minisequensing, làm tiền đề cho chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi ĐỐI TƢỢNG, HĨA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu mẫu máu thành viên thuộc gia đình gồm bố, mẹ mang gen đột biến gây bệnh beta-thalassemia có bị bệnh beta-thalassemia điều trị Trung tâm Thalassemia, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương, có kết sàng lọc đột biến beta-thalassemia từ ADN máu toàn phần phương pháp ARMS-PCR multiplex ARMS-PCR (làm đối chứng) Tất trường hợp lấy ml máu cho vào ống chống đông EDTA để tiến hành bước (tách tế bào, ly trích ADN, nhân gen, tiến hành giải trình tự Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y) Hóa chất - Hóa chất tách bạch cầu: dung dịch cân bằng, dung dịch ficoll (d = 1,077) - Hóa chất ly giải tế bào: dung dịch KOH 0,2 M, dung dịch tricine 0,2 M - Hóa chất tinh sạch: SAP, EXO1 - Hóa chất điện di tự động: hidi-formamid, geneScan-120 LIZ - Hóa chất cho PCR: PCR Reaction mix, ADN polymerase, primers, minisequensing primers, SNaPshot multiplex kit TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 - Thiết bị: máy ly tâm văng, kính hiển vi soi có độ phóng đại 320X, buồng thao tác PCR (Mỹ), máy PCR ABI 9700 (Applied Biosystem), hốt ủ hóa chất (Hàn Quốc), máy điện di tự động 3130xl Genetic analyzer, hệ thống điện di gen Phƣơng pháp nghiên cứu - Tách tế bào bạch cầu phương pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng ficoll-paque theo quy trình nhà sản xuất - Pha loãng bạch cầu dung dịch PBS 1X, gắp tế bào bạch cầu kính hiển vi soi đặt vào ống PCR 0,2 ml - Ly giải tế bào μl KOH 0,2 M, ủ 650C 10 phút, trung hòa KOH μl tricine 0,2 M - Tiến hành phản ứng nested PCR theo Wang CS (2003), có cải biên [2] Cụ thể: + PCR vòng 1: nhân gen beta-globin với thể tích 50 μl chứa dịch ly giải tế bào bạch cầu; 0,2 μm primer vòng 1; 0,2 mM loại deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP) 2,5 đơn vị HotStarTaq ADN polymerase (Qiagen) 1X PCR buffer chứa 1,5 mM MgCl2 + PCR vòng 2: nhân gen beta-globin, sử dụng μl sản phẩm PCR vòng với thể tích 50 μl Thành phần phản ứng tương tự vòng 1, ngoại trừ ADN polymerase giảm đơn vị Chu trình nhiệt tương tự PCR vòng - Minisequencing tiến hành với SNaPshotTM multiplex ready reaction mix (Applied Biosystems) 0,2 μm minisequencing primer theo quy trình nhà sản xuất - Trình tự mồi gen beta-globin vòng: beta-F1* ACGGCTGTCATCACTTAGAC HUMHBB: 62010-62029 beta-R1* AAGAGGTATGAACATGATTAGC HUMHBB: 63466-63445 BGLO-2F GTCATCACTTAGACCTCACC HUMHBB: 62016-62035 BGLO-2R CAGAATAATCCAGCCTTATCC HUMHBB: 63424-63404 1.457 bp 1.409 bp Bảng 1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR nested PCR 95 C 45 giây 56 C 45 giây 72 C phút phút 72 C chu kú 30 chu kỳ chu kỳ Sản phẩm nhân vòng tinh enzym SAP EXO1, chạy multiplex minisequensing theo quy trình kit ABI PRIMER TSNaPshot Multiplex (Applied Biosystems) với mồi minisequencing 34 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng cho minisequencing SNP-654 TGATAATTTCTGGGTTAAGG SNP-28 (gact)7 GATGGCTCTGCCCTGACTT Cd 26) (gact)3 CAACCTGCCCAGGGCCT Cd 17R act (gact)7 CAACTTCATCCACGTTCACCT Cd 28R (gact)6 GATGGCTCTGCCCTGACTT Cd 71/72F IVSI-1R kế, băng điện di rõ, nét, đẹp, không thấy sản phẩm phụ Kết điện di tự động phát đột biến A TT THB16 T THM16 C ct (gact)8 AGAAAGTGCTCGGTGCCTTTA TCTTGTAACCTTGATACCAA Sản phẩm minisequencing điện di huỳnh quang máy 3130xl Genetic analyzer, phân tích phần mềm GeneMapper ID v 3.2 Đánh giá kết phát đột biến dựa vào kích thước, màu sắc độ lớn pic thu c trờn in di hunh quang Kết nghiên cøu vµ bµn luËn Kết nhân gen beta-globin Hình 2: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THM16 THB16 THM16 (mẫu máu người mẹ gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd26, pic bên phải màu đen nucleotid C (bình thường), pic bên trái màu đỏ nucleotid T (đột biến) THB16 (mẫu máu người bố gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, pic bên phải xanh nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ nucleotid T (bình thường) A T T THC16 Hình 1: Hình ảnh điện di gel agarose sản phẩm khuếch đại vòng gen beta-globin Marker ADN kp (dải giữa); chứng âm (dải thứ nhất); chứng dương (dải thứ hai); dải lại: băng gen beta-globin, kích thước tương đương 1.409 bp thành viên thuộc gia đình Sản phẩm nhân gen có chất lượng tốt, kích thước phù hợp với dự kiến theo thiết 35 C Hình 3: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC16 THC16 (mẫu máu người gia đình 16) mang kiểu gen dị hợp tử Cd26/Cd17 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 A A T T Hình 4: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THB24,THM24 THB24,THM24 (mẫu máu người bố, mẹ gia đình 24) mang kiểu gen dị hợp tử Cd17, pic bên phải xanh nucleotid A (đột biến), pic bên trái đỏ nucleotid T (bình thường) A Hình 6: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THM48 THB48 THM48 (mẫu máu người mẹ gia đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử IVS1-1, pic phải màu đen nucleotid C (bình thường), pic trái màu đỏ nucleotid T (đột biến) THB48 (mẫu máu người bố gia đình 48) mang kiểu gen dị hợp tử Cd41/42, pic phải xanh da trời nucleotid G (đột biến), pic trái màu đen nucleotid C (bình thường) Hình 5: Hình ảnh điện di tự động sản phẩm minisequencing mẫu THC24 THC24 (mẫu máu người gia đình 24) mang kiểu gen đồng hợp tử Cd17, xuất pic xanh cây, nucleotid A (đột biến) A Kết điện di minisequencing phân tích xác định đột biến rõ ràng, phát trường hợp: người lành mang gen (THM16, THB16, THM24, THB24, THM48, THB48), đồng hợp tử gây bệnh (THC24) dị hợp tử đột biến (THC16, THC48) Dưới kết tổng hợp phát đột biến gen beta-globin từ tế bào bạch cầu tách từ máu ngoại vi thành viên thuộc gia đình có mắc bệnh beta-thalassemia 36 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 Bảng 3: Kết phát đột biến gây bệnh beta-thalassemia THB16 Cd17 Cd17 THM16 Cd26 Cd26 THC16 Cd17/Cd26 Cd17/Cd26 THB24 Cd17 Cd17 THM24 Cd17 Cd17 THC24 Cd17/Cd17 Cd17/Cd17 THB48 Cd41/42 Cd41/42 THM48 IVS1-1 IVS1-1 THC48 Cd41/42/IVS1-1 Cd41/42/IVS1-1 Tất thành viên thuộc gia đình phát đột biến, thấy di truyền đột biến từ bố mẹ cho Các đột biến giống với kết sàng lọc máu toàn phần phương pháp ARMS-PCR multiplex ARMS-PCR Wang W, Kham SK, Yeo GH, Quah TC, KẾT LUẬN Qua phân tích mẫu thuộc gia đình BN người mang gen đột biến gây bệnh beta-thalassemia, đối chiếu kết phân tích phát đột biến hai phương pháp ARMS-multiplex PCR từ mẫu máu toàn phần minisequencing từ tế bào bạch cầu, chúng tơi rút kết luận: - Đã hồn thiện quy trình phát đột biến gen beta-globin gây bệnh beta-thalassemia từ tế bào phương pháp minisequensing - Bốn loại đột biến gen beta golobin thường gặp gây bệnh beta-thalassemia phát Cd17, Cd26, Cd41/42 IVS1-1 phương pháp minisequencing từ tế bào phù hợp với phương pháp ARMS PCR multiplex ARMS-PCR từ máu toàn phần TÀI LIỆU THAM KHẢO Ng IS, Law HY Challenges in screening and prevention of thalassaemia in Singapore Asian-Oceanian Journal of Paediatrics and Child Health 2003, 2, pp.29-38 37 Chong SS Multiplex minisequencing screen for common Southeast Asian and Indian beta thalassaemia mutations Clin Chem 2003, 49, pp.209-218 Kuliev A, Rechitsky S, Verlinsky O, Ivakhnenko V, Evsikov S, Wolf G et al Preimplantation diagnosis of thalassaemias J Assist Reprod Genet 1998, 15, pp.219-225 Deng J, Peng WL, Li J, Fang C, Liang XY, Zeng YH et al Successful preimplantation genetic diagnosis for alpha- and betathalassaemia in China Prenat Diagn 2006, 26, pp.1021-1028 De Rycke M, Van de Velde H, Sermon K, Lissens W, De Vos A, Vandervorst M et al Preimplantation genetic diagnosis for sicklecell anemia and for beta-thalassaemia Prenat Diagn 2001, 21, pp.214-222 Kanavakis E, Vrettou C, Palmer G, Tzetis M, Mastrominas M, Traeger- Synodinos J Preimplantation genetic diagnosis in 10 couples at risk for transmitting beta-thalassaemia major: clinical experience including the initiation of six singleton pregnancies Prenat Diagn 1999, 19, pp.1217-1222 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2015 38 ... tích mẫu thuộc gia đình BN người mang gen đột biến gây bệnh beta- thalassemia, đối chiếu kết phân tích phát đột biến hai phương pháp ARMS-multiplex PCR từ mẫu máu toàn phần minisequencing từ tế. .. minisequencing từ tế bào bạch cầu, rút kết luận: - Đã hoàn thiện quy trình phát đột biến gen beta- globin gây bệnh beta- thalassemia từ tế bào phương pháp minisequensing - Bốn loại đột biến gen beta golobin... Hồn thiện quy trình phát đột biến gây bệnh beta- thalassemia từ tế bào bạch cầu phương pháp minisequensing, làm tiền đề cho chẩn đoán di truyền trước chuyển phơi ĐỐI TƢỢNG, HĨA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP