Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết Xác định đột biến gen và phát hiện người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 Hydroxylase trình bày Tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường do đột biến gen CYP21A2,... Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC patients of Mediterranean descent with Wilson disease, identification of 19 novel mutations , J Med Genet, 36(11), 833 - 836 12 Rossi E, Olynyk JK, Cullen DJ et al (2000) Compound heterozygous hemochromatosis genotype predicts increased iron and erythrocyte indices in women, Clinical Chemistry, 46 (2), 162 - 166 Summary MUTATION ANALYSIS OF ATP7B GENE IN WILSON DISEASE FAMILY Wilson disease an autosomal recessive disorder of copper metabolism caused by mutations in the ATP7B gene that encodes a P-type copper transporting ATPase The aim of this study was to screen and detect mutations of the ATP7B gene in a Wilson disease famlily (n = 6) Mutations were screened and detected by DNA sequencing in 21 exon of ATP7B gene The results showed that 6/6 patients had different heterozygous mutations including: ins47_48CGGCG in exon and p.V456L in exon of ATP7B gene Keywords: XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Viết Tiến2, Nguyễn Phú Đạt1, Tạ Thành Văn1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu hụt enzym 21- hydroxylase bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường đột biến gen CYP21A2 Nghiên cứu thực với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát người lành mang gen bệnh cho thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân Nghiên cứu tiến hành 33 bệnh nhân 78 thành viên thuộc 33 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh; Kỹ thuật giải trình tự gen MLPA sử dụng để xác định đột biến người lành mang gen bệnh Kết cho thấy nhóm bệnh nhân, 33/33 (100%) bệnh nhân phát đột biến với dạng đột biến khác nhau, đột biến 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G) chiếm tỉ lệ cao 13/33 (39,5%), đột biến xóa đoạn chiếm tỉ lệ 7/33 (21,2%); nhóm người lành mang gen bệnh, 32/33 người bố, 33/33 người mẹ 5/12 thành viên gia đình khác (anh, chị, em) xác định người lành mang gen bệnh Kết thu sở di truyền quan trọng cho chẩn đoán trước sinh tư vấn di truyền nhằm làm giảm tỷ lệ mắc bệnh có phác đồ điều trị sớm cho thai nhi từ tuần đầu Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, đột biến gen CYP21A2, người lành mang gen bệnh TCNCYH 82 (2) - 2013 187 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh (congenital adrenal hyperplasia - TSTTBS) thể thiếu enzym 21 - hydroxylase bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể số Bệnh gây nên đột biến gen CYP21A2 làm rối loạn trình sinh tổng hợp hormon vỏ thượng thận, gây bệnh cảnh lâm sàng suy thượng thận cấp nam hóa trẻ gái, dậy sớm giả trẻ trai [1, 2] Cho đến nay, nhiều dạng đột biến phát đột biến đoạn, đột biến chuyển đoạn, đột biến lặp đoạn, đột biến điểm; đột biến điểm chiếm tỷ lệ cao [3] Bệnh dự phòng phương pháp tư vấn di truyền phát người lành mang gen bệnh, chẩn đoán trước sinh Nghiên cứu Lee cộng ước tính tỷ lệ người lành mang gen bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh 1/83 quần thể người Trung Quốc [3] Các báo cáo khác giới cho thấy tỷ lệ chung người lành mang gen bệnh 1/55 [4, 5] Ở Việt Nam, khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, bệnh viện Nhi Trung ương nơi quản lí số lượng lớn bệnh nhân mắc tăng sản thượng thận bẩm sinh với khoảng 600 bệnh nhân Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu tồn diện phát đột biến gen bệnh nhân phát người lành mang gen bệnh Việc phát đột biến phát người lành mang gen bệnh giúp khẳng định chẩn đoán cho phép điều trị sớm, phòng tránh suy thượng thận cấp trường hợp xét nghiệm hormon không Địa liên hệ: Tạ Thành Văn - Trường Đại học Y Hà Nội Số Tôn Thất Tùng, Đống Đa, Hà Nội Email: tathanhvan@hmu.edu.vn Ngày nhận: 04/03/2013 Ngày chấp thuận: 26/4/2013 188 rõ rang; tư vấn tiền hôn nhân nhằm giảm trẻ sinh bị mắc bệnh chẩn đoán điều trị trước sinh cho thai nhi gái mắc bệnh để phòng làm giảm nam hóa chuyển giới gây mơ hồ giới tính sau sinh Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên, đề tài thực với mục tiêu: (1) xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát người lành mang gen bệnh cho thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh nhân II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Đối tượng 33 bệnh nhân 78 thành viên thuộc 33 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21hydroxylase bao gồm: bố, mẹ anh, chị, em ruột bệnh nhân Các bệnh nhân theo dõi điều trị khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền bệnh viện Nhi Trung ương Phương pháp 2.1 Kỹ thuật tách chiết DNA DNA tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform Tất mẫu DNA tiến hành đo nồng độ độ tinh sạch, có mẫu DNA đạt giá trị OD 260/280 1.8 - sử dụng để phân tích gen [6] 2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen Các cặp mồi đặc hiệu sử dụng để khuyếch đại gen CYP21A2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR: 900 - 10 giây, [980 - 10 giây, 550 - 15 giây, 720 - phút] x 30 chu kỳ Sản phẩm PCR tinh giải trình tự máy ABI - 3100 trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, trường Đại học Y Hà Nội Kết phân tích phần mềm CLC so sánh kết phân tích gen TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC bệnh nhân với kết phân tích gen thành viên gia đình probe tỷ lệ thuận với số copy đoạn DNA đích đặc hiệu với probe 2.3 Kỹ thuật MLPA (Multiplex ligation dependent probe amplification) 2.4 Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thực theo yêu cầu đạo đức nghiên cứu Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC - Holland) để phát đột biến xóa đoạn bệnh nhân người lành mang gen bệnh Thành phần kit gồm probe để khuyếch đại gen CYP21A2, probe tương ứng với vùng gen, ngồi có probe đặc trưng cho gen người sử dụng để làm đối chứng probe cho nhiễm sắc thể X Y để xác định giới tính Sản phẩm khuếch đại điện di mao quản máy giải trình tự Số lượng sản phẩm khuếch đại III KẾT QUẢ Bằng kỹ thuật giải trình tự gen MLPA, 33/33 (100%) bệnh nhân phát có đột biến gen CYP21A2, với dạng đột biến khác Đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/ C > G) chiếm tỷ lệ cao 13/33 (39,5%), đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%), dạng đột biến lại dao động - 15,3% Bảng Các dạng đột biến gen phát bệnh nhân STT Dạng đột biến Thể lâm sàng Số bệnh nhân n % Mất muối 13 39,5 Nam hóa đơn 3,0 Mất muối 6,0 Nam hóa đơn 15,3 656 A/C > G (IVS2-13A/C > G) I172N/I172N & 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) IVS2 - 13A/C > G/R356W I172N/I172N IVS2 - 13A/C> G/R493S Mất muối 3,0 R356W/R356W Mất muối 12,0 Xóa đoạn Mất muối 21,2 33 100 Tổng số - Kỹ thuật giải trình tự gen MLPA sử dụng để phát người lành mang gen bệnh, kết cho thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ 5/12 thành viên gia đình (anh, chị, em) xác định có đột biến - Phân tích phả hệ 33 gia đình cho thấy 33 gia đình có bị bệnh hệ, 28 gia đình có bị bệnh, gia đình có hai có bị bệnh (bảng 2) TCNCYH 82 (2) - 2013 189 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng Kết phát đột biến gen thành viên gia đình bệnh nhân Thành viên gia đình khác Người bố Người mẹ n % n % n % Có mang gen đột biến 32 32/33 33 33/33 5/12 Không mang gen đột biến 1/33 0 7/12 33 33/33 33 33/33 12 12/12 Kết Tổng số Hình ảnh minh họa số dạng đột biến điển hình Phả hệ gia đình mang gen đột biến IVS2 - 13A/C > G I II III Hình Kết đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) gen CYP21A2 Mũi tên thẳng đứng vị trí đột biến, chữ số mũi tên vị trí nucleotid Hình ảnh giải trình tự gen theo chiều ngược 190 TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bệnh nhân có đột biến đồng hợp tử 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G), mẹ bệnh nhân có đột biến dị hợp tử nên người lành mang gen bệnh, bố bệnh nhân có hình ảnh phân tích gen giống người bình thường nên khơng mang gen bệnh Phả hệ gia đình mang đột biến xóa đoạn I II III Hình Kết đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon gen CYP21A2 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4, 6, 8, gen CYP21A2; E1P, I2P, E10P đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2, exon 10 gen CYP21A1P; C4A, C4B đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B; Y đỉnh tương ứng với nhiễm sắc thể Y dùng để xác định giới tính Kết MLPA cho thấy bệnh nhân không thấy xuất đỉnh tương ứng với TCNCYH 82 (2) - 2013 gen C4B exon 1, 3, 4, 6, gen CYP21A2, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn từ gen C4B đến exon gen CYP21A2 Chiều cao đỉnh gen C4B exon 1, 3, 4, 6, gen CYP21A2 người bố người mẹ bệnh nhân 1/2 so với chiều cao đỉnh mẫu đối chứng; bố mẹ bệnh nhân người lành mang gen bệnh 191 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC IV BÀN LUẬN Bằng kỹ thuật MLPA giải trình tự gen, 33/33 (100%) bệnh nhân phát đột biến với dạng đột biến khác nhau, đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) chiếm tỉ lệ cao 13/33 (39,5%), đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%), dạng đột biến lại dao động từ 15,3% Trên sở đột biến gen bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh phát hiện, nghiên cứu tiến hành xác định trạng thái dị hợp tử cho thành viên gia đình bệnh nhân Kết cho thấy 32/33 người bố, 33/33 người mẹ 5/12 thành viên gia đình khác (anh, chị em) xác định có đột biến Đột biến gen CYP21A2 nghiên cứu rộng rãi nhiều nước giới, có 150 đột biến khác báo cáo [2, 7] Các đột biến hay gặp gen CYP21A2 bao gồm 656 A/C > G (IVS2 - 13A/ C > G), I172N, R356W đột biến xóa đoạn với tỷ lệ khác tùy chủng tộc Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu giới, đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) dạng đột biến hay gặp với tỷ lệ dao động (12 - 56%) tùy thuộc vào chủng tộc [8], đó, tỷ lệ gặp đột biến nước châu Á Trung Quốc (27%), Hồng Kong (34%), Singapor (32,7%) [1] Nghiên cứu phát tỷ lệ đột biến xóa đoạn cao so với số nước Một nghiên cứu Brazil tiến hành xét nghiệm gen cho 41 gia đình có người bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu enzym 21 OH nhận thấy dạng đột biến xóa đoạn 8,1% [9], đột biến xóa đoạn 30kb tìm thấy với tỷ lệ thấp bệnh nhân thể muối (4,5%), tỷ lệ nghiên cứu khác châu Âu châu Mỹ 20% thể muối [3] Tần số gặp đột 192 biến xóa đoạn với tần số thấp báo cáo Nhật (11,8%), Trung Hoa – Đài Loan (9,5%) Singapo (gốc Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia) (3,9%) [1, 10] Đột biến xóa đoạn lớn dẫn đến tồn hoạt tính enzym dẫn đến thể lâm sàng nặng - thể cổ điển muối [11] Điều hoàn toàn phù hợp với bệnh nhân nghiên cứu Giải trình tự gen cho thành viên gia đình số bệnh nhân mang đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) dạng đồng hợp tử, kết xét nghiệm cho thấy người mẹ người lành mang gen dị hợp tử, có kiểu đột biến với bệnh nhân người bố có kết bình thường Bệnh nhân mang hai allen bị bệnh, allen gây bệnh nhận từ người mẹ allen gây bệnh phải nhận từ người bố, phương pháp giải trình tự gen không phát đột biến điểm người bố, có khả bệnh nhân bị đột biến xóa đoạn q trình giảm phân người bố có mang đột biến xóa đoạn mà chưa phát Theo tác giả White P.C chuyển đoạn gen thường liên quan đến đột biến Ig2, trao đổi chéo không tương xứng gây đoạn gen Tần số chuyển đoạn gen theo cách thức (1/104) phù hợp với tỷ suất chuyển đoạn gen bệnh nhân thiếu enzym 21 - OH [7] Khả người bố mang đột biến xóa đoạn cần phải sử dụng phương pháp MLPA để xác định xác Phát đột biến gen bệnh nhân khơng đóng vai trò quan trọng để chẩn đoán xác định bệnh, điều trị sớm tránh biến chứng cho bệnh nhân mà sở quan trọng để phát người lành mang gen bệnh cho thành viên gia đình, đặc biệt gia đình có bị bệnh họ có kế hoạch tiếp tục sinh thứ [12] Đây sở khoa học quan để chẩn TCNCYH 82 (2) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC đoán trước sinh cho mẹ, chị, em gái bệnh nhân mang thai, tránh sinh đứa trẻ bị bệnh có phác đồ điều trị sớm cho thai nhi chẩn đoán sớm từ thời kỳ bào thai V KẾT LUẬN 33/33 (100%) bệnh nhân phát đột biến với dạng đột biến khác nhau, đột biến 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) chiếm tỷ lệ cao 13/33 (39,5%), đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21,2%) 32/33 người bố, 33/33 người mẹ 5/12 thành viên gia đình (anh, chị, em) xác định người lành mang gen bệnh Lời cảm ơn Nghiên cứu hỗ trợ kinh phí đề tài cấp Bộ Y tế “Nghiên cứu quy trình phát người mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) kỹ thuật sinh học phân tử” TÀI LIỆU THAM KHẢO Angel.O.K Chan, But.M.W (2011) Molecular analysis of congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency in Hong Kong Chinese patients, Steroids 76, 1057 - 1062 Saroj N, New M I (2011) Congenital adrenal hyperplasia due to 21 – hydroxylase deficiency, Annals of the new york academy of sciences, 1192, - 11 Lee H H (2004) The chimeric CYP21P/ CYP21 gene and 21-hydroxylase deficiency, Journal Hum Genet, 49, 65 - 72 Anastasovska.V, Kocova M (2010) Detected heterozygouts during the molecular analysis of the common CYP21A2 point mutations in Macedonian patients with con- TCNCYH 82 (2) - 2013 genital adrenal hyperplasia and their relatives, Contributions, Sec, Biol.Med.Sci, MASA, XXXI, 2, 71 - 82 Baumgartner Parzer S.M, Nowotny P et al (2004) Carrier frequency of congenital adrenal hyperplasia (21-hydroxylase deficiency) in a Middle European population, The journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 90(2), 775 - 778 Tạ Thành Văn (2010) PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất Y học, 28 - 32 White P.C, Speiser P W (2000) Congenital adrenal hyperplasia due to 21- hydroxylase deficiency, Endocrine reviews, 21 (3), 245 - 291 Wilson RC, Nimkarn S, Dumic M et al, (2007), Ethnic specific distribution of mutations in 716 patients with congenital adrenal hyperplasia owing to 21- Hydroxylase deficiency, Mol Genet Meta, 90(4), 414 - 421 Fernanda B Coeli., Fernanda C Soardi., et al (2010) Novel deletion alleles carrying CYP21A1P/A2 chimeric genes in Brazilian patients with 21-hydroxylase deficiency, BMC medical Genetics, 11, 104 - 124 10 Satomi.K, Takio.T et al (2002) Genetic Analysis of Japanese Patients with 21hydroxylase deficiency: Identification of a patient with a new mutation of a homozygous deletion of adenine at codon 246 and patients without demonstrable mutation within the structural gene for CYP21, The Journal of clinical Endocrinology & Metabolism, 87(6), 2668 - 2673 11 Finkielstain GP, Chen W, Mehta SP, Fujimura FK et al (2011) Comprehensive genetic analysis of 182 unrelated families with congenital adrenal hyperplasia due to 21hydroxylase deficiency, J Clin Endocrinol Metab, 96 (1), 161 - 172 193 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 12 Juan Tian., Guohua Yang et al (2011) Molecular diagnosis of two families with classic congenital adrenal hyperplasia, Gene, 05.019, 368 - 389 Summary MUTATION AND CARRIER DETECTION OF CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA CAUSED BY 21 - HYDROXYLASE DEFICIENCY Congenital adrenal hyperplasia causes by 21- hydroxylase deficiency (CAH - 21OH) is an autosomal recessive genetic disorder due to mutation in the CYP21A2 gene The aim of this study was to identify mutations of CYP21A2 gene in patients with CAH - 21OH and detect the carrier in family members of CAH - 21OH patients 33 CAH - 21OH patients and 78 family members were selected for this study; direct DNA sequencing and MLPA were used to identify the mutation and carriers in CYP21A2 The result showed that, in the patient group, 33/33 (100%) patients were found to have mutation in CYP21A2 gene with different types of mutation and 656 A/C > G (IVS2 - 13A/C > G) was the most common mutation with 13/33 (39.5%) and following is the deletion mutation with 7/33 (21.2%) In the carrier group, 32/33 fathers, 33/33 mother and 5/12 siblings were identified as carrier Our results are important for prenatal diagnosis and genetic counseling to reduce the ratio of disease and have suitable treatment for mother in initial weeks of gestation Keywords: congenital adrenal hyperplasia, CYP21A2 mutation, carrier CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THỂ THIẾU 21 - HYDROXYLASE Ngô Thị Thu Hương1, Trần Vân Khánh1, Nguyễn Phú Đạt1, Nguyễn Viết Tiến2, Tạ Thành Văn1 Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Phụ sản Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, khoảng 90% gây nên thiếu hụt enzym 21- hydroxylase Việc đưa phác đồ điều trị thích hợp với bà mẹ mang thai giải pháp hiệu để để tránh tượng nam hóa trẻ gái bị bệnh Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu chẩn đoán trước sinh cho thai phụ mang gen đột biến dị hợp tử bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21 - OH Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen MLPA để xác định đột biến gen thai nhi tuần thứ 16 04 thai phụ thuộc 04 gia đình bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh Kết cho thấy, thai nhi mang đột biến dị hợp tử 656A/C > G/1763insT, thai nhi mang đột biến đồng hợp tử 2110C > T (R356W) thai nhi không mang gen đột biến gen Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh, chẩn đoán trước sinh, đột biến gen CYP21A2 194 TCNCYH 82 (2) - 2013 ... (1) xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21- hydroxylase, (2) phát người lành mang gen bệnh cho thành viên gia đình có quan hệ huyết thống với bệnh. .. (39,5%), đột biến xóa đoạn chiếm tỷ lệ 7/33 (21, 2%), dạng đột biến lại dao động từ 15,3% Trên sở đột biến gen bệnh nhân bị bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh phát hiện, nghiên cứu tiến hành xác định. .. MLPA để xác định xác Phát đột biến gen bệnh nhân đóng vai trò quan trọng để chẩn đốn xác định bệnh, điều trị sớm tránh biến chứng cho bệnh nhân mà sở quan trọng để phát người lành mang gen bệnh