Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm khảo sát sự phát triển phôi sau sinh thiết. Qua nghiên cứu cho thấy phát triển của 50 phôi ngày 3 sau sinh thiết một phôi bào không ảnh hưởng đến phát triển phôi tại các ngày 4 và 5. Còn 20 phôi túi sau sinh thiết được đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá có tỷ lệ sống cao sau rã đông.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 NGHIÊN CỨU SỰ PHÁT TRIỂN PHÔI SAU SINH THIẾT ĐỂ CHẨN ĐỐN DI TRUYỀN TRƢỚC CHUYỂN PHƠI Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Ngọc Diệp*; Dương Đình Hiếu* Nguyễn Đình Tảo*; Quản Hồng Lâm* TĨM TẮT Mục tiêu: khảo sát phát triển phôi sau sinh thiết Đ i tượng: 50 phôi ngày 20 phôi túi đƣợc sinh thiết Phương pháp: nghiên cứu tiến cứu mô tả Kết quả: 32/50 phôi ngày sau sinh thiết phát triển thành phôi túi (64%) Tỷ lệ sống sau rã đông 20 phôi túi sinh thiết đƣợc đông lạnh phƣơng pháp thuỷ tinh hoá đạt 95% Kết luận: sinh thiết phôi bào phôi giai đoạn phân chia ngày không ảnh hƣởng đến phát triển phôi ngày Phôi túi sinh thiết đƣợc đông lạnh phƣơng pháp thuỷ tinh hố có tỷ lệ sống cao sau rã đơng * Từ khóa: Phơi túi; Phơi ngày 3; Sinh thiết; Tỷ lệ sống sau rã đông; Chuyển phơi; Chẩn đốn di truyền Study on Embryo Development after Biopsy for Genetic Diagnosis prior Embryo Transfer Summary Objective: To investigate the invitro development of embryos after biopsy Subjects: 50 embryos on day and 20 blastocysts were biopsied Research method: Description progressive research Result: At day 5, 32 of 50 embryos after biopsy reached the blastocyst stage (64%) The survival rate of post-thawing 20 biopsied blastocysts was 95% Conclusion: The one-cell biopsy from cleavage embryo at day did not affect the embryo development on day and day By vitrification, the post - thawing survival rate of the biopsied blastocyst was high * Key words: Blastocyst; Day embryo; Biopsy; Post-thawing survival rate; Embryo transfer; Genetic diagnosis ĐẶT VẤN ĐỀ Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm đóng vai trò quan trọng lĩnh vực hỗ trợ sinh sản ngày đƣợc phát triển rộng khắp giới Tuy nhiên, tỷ lệ thành công hỗ trợ sinh sản đạt khoảng 30 - 40%, lĩnh vực nhiều vấn đề cần đƣợc tiếp tục nghiên cứu Hiện nay, hầu nhƣ việc lựa chọn phôi dựa tiêu chuẩn hình thái phơi Tuy nhiên, việc đánh giá hình thái chƣa phản ánh đầy đủ chất lƣợng thực phôi, dựa vào thông số hình thái kết thụ tinh ống nghiệm hạn chế * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Thanh Tùng (tung_ttcnp@yahoo.com) Ngày nhận bài: 06/05/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 24/06/2015 Ngày báo đăng: 08/07/2015 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 Để nâng cao tỷ lệ thành công trẻ sinh sống khoẻ mạnh thụ tinh ống nghiệm, việc chẩn đoán di truyền trƣớc chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis - PGD) sàng lọc di truyền trƣớc chuyển phôi (Preimplantation Genetic Screening - PGS) yêu cầu quan trọng, cấp thiết thực tiễn Để thực kỹ thuật này, trƣớc tiên cần sinh thiết phôi, cung cấp vật liệu di truyền cho chẩn đoán Đây kỹ thuật xâm lấn phơi ảnh hƣởng đến phát triển phôi sau sinh thiết Do vậy, tiến hành nghiên cứu nhằm: Khảo sát phát tri n phôi sau sinh thiết ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 70 phôi ngƣời dƣ thụ tinh ống nghiệm, chia thành nhóm: - Nhóm I: 50 phơi ngày - Nhóm II: 20 phơi ngày * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi đ sinh thiết: - Phôi ngày có phơi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tƣơng < 10% - Phôi ngày đạt tiêu chuẩn 3AA, 3AB [1] Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu mô tả cắt ngang * K thuật sinh thiết phơi: - Chuẩn bị: + Kính hiển vi soi ngƣợc trang bị vi thao tác có gắn hệ thống laser 30 phút Các phôi sinh thiết để giọt sinh thiết 10 phút trƣớc sinh thiểt - Quy trình sinh thiết phơi ngày 3: + Lựa chọn phơi bào nhỏ, nhìn rõ nhân để sinh thiết + Xoay phôi để đƣa phôi bào sinh thiết vị trí giữ cố định phơi kim giữ vị trí + Dùng laser tạo lỗ thủng màng suốt phơi vị trí giờ, kích thƣớc lỗ khoảng nửa kính thƣớc phơi bào có hình chữ V hình chêm + Đƣa kim sinh thiết đƣờng kính 30 µm qua lỗ thủng, vừa hút vừa kéo phôi bào sinh thiết (tránh làm vỡ phôi bào) + Rưa phơi bào sinh thiết mơi trƣờng PBS, chuyển vào tuýp eppendorf với thể tích PBS - µm - Quy trình sinh thiết phơi ngày 5: + Phơi ngày đƣợc tạo lỗ thủng 10 µm màng suốt phôi đƣợc ngày + Khi phơi túi hình thành, chờ có - 10 tế bào nuôi chui qua lỗ thủng màng suốt tiến hành sinh thiết + Xoay phôi túi để đƣa tế bào nuôi chui qua lỗ thủng vị trí + Cố định phơi kim giữ vị trí + Dùng kim sinh thiết đƣờng kính 20 µm vừa hút vừa kéo tế bào ni, khơng đứt dùng laser cắt rời khỏi phôi túi + Kim sinh thiết có đƣờng kính 30 µm 20 µm + Rửa tế bào nuôi sinh thiết môi trƣờng PBS, chuyển vào tuýp eppendorf với thể tích PBS - µm + Đĩa sinh thiết phơi tạo giọt mơi trƣờng sinh thiết, giọt tích µl, phủ dầu khống ổn định tủ ấm 37oC, * Đông lạnh phôi ngày sau sinh thiết phương pháp thuỷ tinh hoá, s dụng môi trường đông rã đông c a Kitazato: 46 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 * Nuôi cấy phôi ngày sau sinh thiết: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Sau sinh thiết, rửa phôi ngày môi trƣờng G-IVF tiếp tục nuôi cấy giọt mơi trƣờng 20 µl G2 plus đƣợc phủ dầu khống Ovoil hộp cấy Nunc, ni tủ Cook 37oC sử dụng khí trộn CO2 6%, O2 5% Bảng 3: Sự phát triển phôi ngày sau sinh thiết THỜI ĐIỂM ĐÁNH GIÁ PHƠI Ngày Phơi khơng Phôi phát triển: phát triển: 45 (90%) (10%) * Thời m đánh giá chất lượng phôi sau sinh thiết: Phơi ngày sau sinh thiết: đánh giá hình thái phôi vào ngày ngày theo đồng thuận Alpha ESHRE (2011) chất lƣợng noãn phôi [1] Bảng 1: Phân loại phôi nuôi cấy ngày PHÂN LOẠI MÔ TẢ Tốt Hiện tƣợng nén diễn tồn thể tích phơi Trung bình Hiện tƣợng nén diễn phần lớn phơi Xấu Hiện tƣợng nén xảy 1/2 thể tích phơi, với diện - phơi bào rõ màng tế bào, tƣợng nén xảy phôi trƣớc phôi đạt đến phôi bào Bảng 2: Phân loại phôi nuôi cấy ngày PHÂN LOẠI MƠ TẢ Tốt Phơi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân loại nụ phôi tế bào ni: AA, AB, BA Trung bình Phơi có mức độ giãn rộng ≥ 3, phân loại nụ phôi tế bào nuôi: BB, BC Xấu Phơi có mức độ giãn rộng < ≥ 3, phân loại nụ phôi tế bào nuôi: AC, CB, CC Ngày 50 phôi 45 phôi giai đoạn kết dính Ngày Hình thành phơi túi: 32 (64%) - phôi túi giai đoạn sớm Số phôi bào - 22 phôi túi không thay nở rộng đổi - phôi túi nở rộng Tiếp tục nuôi cấy phôi ngày sau sinh thiết, kết cho thấy phơi ni cấy ngày có 45 phôi (90%) phát triển, phôi giai đoạn kết dính phơi (10%) khơng phát triển với số phôi bào phôi giống nhƣ ngày sau sinh thiết Trong số phôi nuôi cấy đến ngày 5, 32 phôi (64%) phát triển thành phôi túi Phôi túi giai đoạn phát triển khác nhau: phôi túi giai đoạn sớm, 22 phôi túi nở rộng phôi túi nở rộng * Phân loại chất lượng phôi ngày 4: Tốt: 30 (66,7%); trung bình: 10 (22,2%); xấu: (11,1%) * Phân loại chất lượng phôi ngày 5: phôi túi giai đoạn sớm nên khơng thể đánh giá chất lƣợng, có 26 phôi giai Phôi ngày sau rã đông: đánh giá hình thái sau đoạn nở rộng nở rộng nên có * Phân tích x lý s liệu: dựa chƣơng trình SPSS 13.0 loại tốt 16 (61,5%), phơi túi loại trung bình thể đánh giá chất lƣợng phơi túi (23,1%) phơi loại xấu (15,4%) 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 Bảng 4: Tình trạng phôi ngày sinh thiết sau rã đông THỜI GIAN PHÔI TÚI PHÔI TÚI SINH THIẾT SAU RÃ ĐÔNG SỐNG SAU RÃ ĐƠNG PHƠI TÚI THỐI HĨA n = 20 19 (95%) (5%) PHƠI TƯI TRỞ VỀ HÌNH THÁI BAN ĐẦU (giờ) 1,96 ± 0,15 Phôi túi sinh thiết sau rã đơng có tỷ lệ phơi sống 19/20 (95%), có phơi thối hố (5%) Thời gian phơi túi sống trở trạng thái ban đầu trƣớc sinh thiết 1,96 ± 0,15 Hình 1: Sinh thiết phơi ngày Hình 2: Sinh thiết phơi ngày 48 BÀN LUẬN Trong thập niên 1990 đầu thập niên 2000, sinh thiết phôi ngày đƣợc sử dụng đa số trung tâm hỗ trợ sinh sản Tiềm tế bào phôi giai đoạn phân chia cân Do vậy, sinh thiết - tế bào phơi ngày có số lƣợng - tế bào hầu nhƣ không ảnh hƣởng đến phát triển phơi sau Sinh thiết phôi giai đoạn phân chia kịp thời gian để PGD/PGS chuyển phơi tƣơi vào ngày [3, 5] Geber Sampaio (1999) sinh thiết 66 phơi ngày 3, tiếp tục theo dõi thấy có 33 phôi phát triển đến giai đoạn phôi túi đạt tỷ lệ 50% [2] Nghiên cứu chúng tơi có kết đáng khả quan với 32/50 (64%) đạt đến phôi túi sau sinh thiết phôi ngày Gần đây, nhiều trung tâm bỏ sinh thiết phôi giai đoạn phân chia vấn đề thể khảm dao động 40 - 60%, nên kết chẩn đốn khơng xác Sinh thiết - 10 tế bào ni từ phơi túi có số lƣợng xấp xỉ 100 tế bào không ảnh hƣởng đến phát triển phôi thai mà hạn chế vấn đề thể khảm, cho kết xác [4] Tuy nhiên, phôi túi phát triển không thời gian, nên việc sinh thiết thực thời điểm Cần cân nhắc tạo lỗ thủng màng suôt để sinh thiết phôi túi thời điểm phôi ngày sáng ngày Việc sử dụng laser để tạo lỗ thủng màng suốt phôi ngày ảnh hƣởng đến phơi bào tạo thuận lợi sinh thiết tế bào nuôi [3] Tuy nhiên, vị trí lỗ thủng màng suốt trùng với vị trí khơi tế bào phơi túi, q trình sinh thiết ảnh hƣởng đến phơi túi TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 Chúng sử dụng phƣơng pháp thuỷ tinh hố để đơng lạnh phơi túi sau sinh thiết Sau sinh thiết, phôi túi làm cho phôi túi xẹp xuống dịch xoang phôi túi ngồi Do vậy, làm cho phơi túi sau rã đơng có tỷ lệ phơi túi sống tƣơng đối cao (95%), kết tƣơng tự nghiên cứu Zhang (2009) với tỷ lệ phôi túi sinh thiết sống sau rã đông 95,6% [6] assessment proceedings of an expert meeting Human Reproduction 2011, 26 (6), pp.1270-1283 KẾT LUẬN Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag M, Lemmen J, Harper JC ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Group best practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation gennetic diagnosis/screening (PGD/PGS) Human Reproduction 2011, 26 (1), pp.41-46 Qua nghiên cứu cho thấy phát triển 50 phôi ngày sau sinh thiết phôi bào không ảnh hƣởng đến phát triển phôi ngày 20 phôi túi sau sinh thiết đƣợc đông lạnh phƣơng pháp thuỷ tinh hố có tỷ lệ sống cao sau rã đông TÀI LIỆU THAM KHẢO Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryo The Istabul consensus workshop on embryo Geber S, Sampaio M Blastomere development after embryo biopsy: a new model to predict embryo development and to select for transfer Human Reproduction 1999, 14 (2), pp.782-786 Gardner D, Veissman A, Howles C.M, Shoham Z Textbook of Assisted Reproductive Technologies: laboratory and clinical perspectives Third edition on the United Kingdom 2004 Kahraman S, Candan ZN Outcomes of vitrified - warmed day-4 embryos after-3 cleavage-stage biopsy Reprod Biomed Online 2010, 21, pp.636-641 Zhang X, Trokoudes KM, Pavlides Vitrification of biopsied embryos at cleavage, morula and blastocyst stage Reprod Biomed online 2009, 19, pp.526-531 49 ... phát triển phôi ngày sau sinh thiết THỜI ĐIỂM ĐÁNH GIÁ PHÔI Ngày Phôi không Phôi phát triển: phát triển: 45 (90%) (10%) * Thời m đánh giá chất lượng phôi sau sinh thiết: Phôi ngày sau sinh thiết: ... phơi ảnh hƣởng đến phát triển phôi sau sinh thiết Do vậy, tiến hành nghiên cứu nhằm: Khảo sát phát tri n phôi sau sinh thiết ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 70 phơi ngƣời... Reproduction 2011, 26 (1), pp.41-46 Qua nghiên cứu cho thấy phát triển 50 phôi ngày sau sinh thiết phôi bào không ảnh hƣởng đến phát triển phôi ngày 20 phôi túi sau sinh thiết đƣợc đơng lạnh phƣơng pháp