Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn cao học nhằm thực hiện một số nhiệm vụ cơ bản sau: Xác định độc tính của chất lỏng từ lên một số dòng tế bào ung thư và Fibroblast; khảo sát khả năng tạo tương phản ảnh của hạt nano từ bằng phương pháp chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI); thử liệu pháp nhiệt trị trên mô hình ung thư thực nghiệm.
Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cố PGS.TS. Trần Cơng n. Mặc dù thầy khơng còn nữa nhưng những lời khun, những bài học mà thầy dạy dỗ sẽ mãi mãi còn trong tâm trí của em Em xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thị Quỳ, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm để giúp em hồn thành luận văn này. Trong q trình làm việc, em ln nhận được những lời nhận xét, góp ý q báu từ cơ để có thể thực hiện tốt nghiên cứu của mình. Khơng những vậy, cơ còn ln dạy em những bài học làm người vơ cùng hữu ích Em xin cảm ơn TS. Hồng Thị Mỹ Nhung, mặc dù cơ ln ln bận rộn nhưng vẫn quan tâm tới em, đưa ra những lời chỉ dẫn trong từng thí nghiệm để giúp em đạt được kết quả tốt nhất. Sự say mê công việc của cô luôn luôn là tấm gương sáng để em mãi noi theo Em xin chân thành cảm ơn CN Bùi Thị Vân Khánh, ThS Phí Thị Xuyến, tồn bộ các em học viên cao học cũng như sinh viên nhóm Ung thư thực nghiệm đã ln ln dành cho em sự quan tâm và giúp đỡ đặc biệt để em có thể hồn thành cơng việc của mình Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới GS.TS. Nguyễn Xn Phúc, TS. Hà Thị Phương Thư, CN. Phạm Hồng Nam, và các anh chị trong nhóm Nghiên cứu Vật liệu Nano Y sinh, viện Khoa học Vật liệu, trung tâm Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ Quốc gia đã cung cấp vật liệu nano từ và nhiệt tình tạo điều kiện giúp em thực hiện các thí nghiệm đốt nhiệt – từ Em xin gửi lời cảm ơn tới TS.BS Lâm Khánh, bệnh viện Qn đội Trung ương 108 đã khơng tiếc thời gian và cơng sức giúp em hồn thành thí nghiệm chụp cộng hưởng từ hạt nhân. Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Em xin cảm ơn các thầy cơ, các bạn sinh viên phòng thí nghiệm của bộ mơn Thổ nhưỡng và Mơi trường Đất, khoa Mơi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã quan tâm và tạo điều kiện để em có thể hồn thành cơng việc của mình Em xin chân thành cảm ơn nhóm Nghiên cứu về Tế bào gốc, thuộc bộ mơn Tế bào – Mơ – Phơi và Lý sinh thuộc Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã cung cấp tế bào Fibroblast để em có thể hồn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cơ cơng tác tại bộ mơn Tế bào, Mơ phơi và Lý sinh cũng như các thầy cơ trong Khoa Sinh học đã truyền đạt cho em những kiến thức cơ sở để em có thể thực hiện được luận văn thạc sỹ cũng như vận dụng trong cơng việc sau này Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân đã quan tâm, động viên tinh thần trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn Để hồn thành luận văn này, em đã nhận được sự hỗ trợ một phần kinh phí từ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu cơng nghệ chế tạo các hạt vơ cơ, hữu cơ được bọc bởi những polymer tương thích sinh học dung trong y học”, mã số 4/2/472/2009 – HDD – ĐTĐL và để tài cấp bộ (VAST) “Nghiên cứu cơng nghệ chế tạo một số vật liệu nano có từ tính nền Fe3O4 theo định hướng ứng dụng trong Y sinh” thực hiện năm 20092010. Nhân dịp này em xin được cảm ơn lãnh đạo các cấp quản lý và chủ nhiệm các đề tài nêu trên Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Những khái niệm hạt nano từ ứng dụng .4 1.1.1 Vật liệu nano .4 1.1.2 Hạt nano từ 1.1.3 Ứng dụng hạt nano từ lĩnh vực sinh y học .6 1.1.3.1 Tách, phân lập tế bào thực thể sinh học khỏi môi trường hỗn hợp 1.1.3.2 Dẫn truyền thuốc, gen nuclide phóng xạ tới mơ đích 1.1.3.3 Tăng độ tương phản ảnh phương pháp chẩn đoán chụp cộng hưởng từ 14 1.1.3.4 Liệu pháp nhiệt – từ điều trị ung thư .14 1.2.Chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 21 1.2.1 Lịch sử phát triển kĩ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân .21 1.2.2 Nguyên lý kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 22 1.2.3 Ưu điểm chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .28 2.1 Đối tượng nghiên cứu .28 2.1.1 Chuột nhắt trắng (Mus muscullus) dòng Swiss 28 2.1.2 Một số dòng tế bào ung thư tế bào lành 28 2.1.2.1 Các dòng tế bào ung thư 28 2.1.2.2 Tế bào lành Fibroblast 29 2.1.3 Vật liệu nano từ (hay chất lỏng từ) 30 2.2 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm .30 2.2.1 Môi trường nuôi cấy 30 2.2.2 Hóa chất 30 2.2.3 Máy móc thiết bị .31 2.2.4 Vật tư tiêu hao 32 2.3 Phương pháp nghiên cứu .32 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm 2.3.1 Phương pháp tạo u rắn da đùi cho chuột nhắt trắng Swiss cấy ghép dòng tế bào Sarcoma 180 32 2.3.1.1 Tạo u rắn da 32 2.3.1.2 Tạo u đùi 33 2.3.2 Phương pháp khảo sát độc tính dung dịch nano từ H01 E6 dòng tế bào ung thư nguyên bào sợi 33 2.3.3 Phương pháp khảo sát khả tạo tương phản ảnh H01 kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 34 2.3.4 Kỹ thuật tiêm tĩnh mạch 35 2.3.5 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt – từ ex vivo 36 2.3.5.1 Khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt - từ mẫu E6 36 2.3.5.2 Phương pháp khảo sát hiệu ứng đốt – nhiệt từ ex vivo 36 2.3.6 Phương pháp khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u chuột Swiss 37 2.3.6.1 Bằng phương pháp đốt nhiệt từ 37 2.3.6.2 Bằng máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) .39 2.3.7 Liệu pháp gia nhiệt in vivo .41 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết gây tạo u rắn da u đùi chuột Swiss 44 3.1.1 Kết gây tạo u rắn da 44 3.1.2 Kết gây u đùi chuột Swiss .45 3.2 Kết khảo sát độc tính chất lỏng nano từ H01 E6 dòng tế bào ung thư nguyên bào sợi .46 3.2.1 Kết xác định độc tính H01 46 3.2.2 Kết xác định độc tính E6 50 3.3 Kết khảo sát khả tạo tương phản ảnh H01 kỹ thuật chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 52 3.4 Kết khảo sát liệu pháp đốt nhiệt từ sử dụng mẫu E6 54 3.4.1 Kết hiệu ứng đốt nhiệt từ mẫu E6 55 3.4.2 Kết gia nhiệt ex vivo hạt từ E6 57 3.4.3 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u 60 3.4.3.1 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan phương pháp đốt nhiệt từ 60 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm 3.4.3.2 Kết khảo sát phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) số quan khối u máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) 62 3.4.4 Kết khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo .64 KẾT LUẬN 71 KIẾN NGHỊ 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm DANH MỤC VIẾT TẮT VIẾT TẮT AAS AEH CHHBM CLT DIH DMEM FBS IH MRI PBS PEG PVA VIẾT ĐẦY ĐỦ Atomic absorption spectrometry Arterial embolization hyperthermia Chất hoạt hoá bề mặt Chất lỏng tử Direct injection hyperthermia Dulbecco's modified Eagle's medium Fetal bovine serum Intracellular hyperthermia Magnetic resonance imaging Phosphate buffered saline Polyethylene glyco Polyvinyl acetate Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm DANH MỤC BẢNG Bảng Một số dòng tế bào ung thư sử dụng luận văn đặc điểm chúng 29 Bảng Nồng độ hạt từ E6 thí nghiệm khảo sát hiệu ứng đốt nhiệt từ in vitro .36 Bảng Bố trí thí nghiệm gia nhiệt ex vivo khối u rắn da chuột Swiss .36 Bảng Bố trí thí nghiệm gia nhiệt in vivo chuột thí nghiệm 41 Bảng Tỷ lệ sống (%) dòng tế bào ung thư tế bào lành sau ủ với hạt từ H01 nồng độ khác .48 Bảng Tỷ lệ sống (%) dòng tế bào ung thư gan HepG2 tế bào lành sau ủ với hạt từ E6 nồng độ (ng/1 tế bào) khác 51 Bảng Giá trị nhiệt độ bão hoà (Tbh) tốc độ tăng nhiệt độ ban đầu (dT/dt) 55 Bảng Nhiệt độ ban đầu nhiệt độ bão hòa khối u trình gia nhiệt 58 Bảng Nhiệt độ bão hòa nội quan chuột A B sau gia nhiệt 30 phút (oC), nhiệt độ ban đầu 30oC 61 Bảng 10 Hàm lượng sắt có 1g mẫu quan tách từ chuột A chuột B (ngFe/1g mẫu) 63 Hình Minh hoạ nguyên lý sử dụng hạt nano từ từ trường để tách thực thể sinh vật [29] Hình Minh hoạ nguyên lý vận chuyển tập trung thuốc [4] .9 Hình Cấu trúc hệ nano – thuốc .10 Hình Minh hoạ trình đốt nhiệt sử dụng hạt nano từ 14 Hình Quá trình phát triển khổi u thể chuột thí nghiệm Yanase cộng [35] .18 Hình Thiết bị MFH-300F (công ty MagForce) dùng nhiệt – từ trị [21] 21 Hình Hình ảnh chụp cộng hưởng từ chẩn đoán ung thư .22 Hình Sự tạo thành vector từ hoá thực 24 Hình Vector từ hố ngang vng góc với Oz 25 Hình 10 Chuột nhắt trắng Swiss .28 Hình 11 Ảnh SEM mẫu E6 – dung dịch hạt nano từ Fe3O4 bọc Copolime poli (axit acrylic – styrene), hạt có kích thước khoảng 100nm 30 Hình 12 Máy chụp cộng hưởng từ 1.5T (MRI 1.5 Gyroscan Philips) 35 Hình 13.Hệ thống máy phát từ trường RDO, moel HFI (Mỹ) 37 Hình 14 Hình ảnh máy quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) (Shimadzu – Nhật Bản) 40 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Hình 15 Hình ảnh khối u rắn da sau ngày (A), 10 ngày (B) 17 ngày (C) cấy truyền 44 Hình 16 Khối u đùi gây chuột Swiss 46 Hình 17 Ảnh hiển vi quang học tế bào MCF7 trước (a) sau bổ sung hạt từ H01 nồng độ 0.1ng/1 tế bào (b) (TK 10 x VK 40 x zoom 5.6) 47 Hình 18 Hình ảnh tế bào HepG2 bổ sung hạt từ H01 nồng độ khác (TK 10 x VK 20 x zoom 5.6) 48 Hình 19 Hình ảnh chuột mang u đùi tiêm tĩnh mạch 150µl hạt từ H01 sau 15 ngày 50 Hình 20 Hình ảnh tế bào HepG2 bổ sung hạt từ E6 với nồng độ khác ủ (TK10 x VK 20 x zoom 4x) 51 Hình 21 Ảnh chụp cộng hưởng từ chuột A, B C, (1) – hình ảnh cắt từ trước sau (2) - hình ảnh cắt từ phải sang trái .53 Hình 22 Hình ảnh khối u chuột B C .54 Hình 23 Các đường tăng nhiệt độ mẫu chất lỏng từ E6 nồng độ khác với cường độ từ trường 60Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz 56 Hình 24 Các đường tăng nhiệt độ khối u ex vivo tách từ chuột TN với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 59 Hình 25 Các đường tăng nhiệt độ quan tách từ chuột thí nghiệm A – 60 phút B – 180 phút với IB = 60 Oe, fx = 236 kHz 61 Hình 26 Hình ảnh chuột A – Đối chứng sinh học .64 Hình 27 Ảnh chuột B - chuột đối chứng ung thư 65 Hình 28 Hình ảnh chuột đối chứng khơng tiêm hạt từ có chiếu từ trường (chuột C) 18 ngày theo dõi .66 Hình 29 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần không dược chiếu từ trường (chuột D) 13 ngày theo dõi .67 Hình 30 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột E) 21 ngày theo dõi .68 Hình 31 Hình ảnh chuột tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x lần điều trị liệu pháp gia nhiệt (chuột F) 22 ngày theo dõi 69 Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm MỞ ĐẦU Ung thư hiện nay đang là mối đe dọa trên tồn cầu, thách thức hệ thống y tế của mọi quốc gia với hàng chục triệu ca mắc bệnh, khoảng 7 triệu người chết mỗi năm. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyến cáo đây là bệnh có khả năng gây tử vong hàng đầu trên thế giới trong thế kỷ XXI. Riêng tại Việt Nam, các chun gia cho biết, ước tính, mỗi năm nước ta có thêm khoảng 200.000 người mắc bệnh này và khoảng 100.000 người sẽ tử vong. Ung thư có thể vẫn sẽ là ngun nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới và Việt Nam trong nhiều thập kỉ tới Chính vì thế việc tìm ra phương pháp chẩn đốn sớm và điều trị ung thư có hiệu quả cao hơn là u cầu cấp bách đặt ra cho tồn thể nhân loại. Các phương pháp điều trị ung thư truyền thống như phẫu thuật, hóa trị, xạ trị, nội tiết điều trị hay miễn dịch điều trị tuy mang lại nhiều kết quả tiêu diệt và hạn chế sự phát triển của khối u nhưng cũng giết chết khơng ít mơ lành gây nguy hại khơng nhỏ đến sức khỏe của người bệnh. Ngun nhân của hiện tượng này là do phần lớn các phương thức điều trị khơng chỉ tác động cục bộ lên khối u mà còn ảnh hưởng đến một bộ phận lớn các mơ và cơ quan lành của cơ thể. Vì vậy nhiệm vụ quan trọng hàng đầu của các nhà khoa học hiện nay là cần tìm ra một phương pháp chữa trị ung thư sao cho vừa hiệu quả mà lại ít gây độc đối với cơ thể. Ngày nay cơng nghệ vật liệu đang thay làm thay đổi cuộc sống của chúng ta nhờ vào khả năng can thiệp của con người tại kích thước nm. Vật liệu nano thể hiện rất nhiều tính chất đặc biệt và lý thú. Một nhánh quan trọng của cơng nghệ nano, đó là lý sinh y học nano, trong đó, vật liệu nano được sử dụng để chẩn đốn và điều trị bệnh. Ở Việt Nam hạt nano có từ tính đang được các nhà khoa học thuộc viện Khoa học Vật liệu chế tạo để ứng dụng vào điều trị ung thư bằng phương pháp gia nhiệt (hyperthermotherapy). Hạt nano từ được làm từ Fe3O4 và thường được Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Nhiệt độ tại cả 5 cơ quan là gan, phổi, lách, u và thận của chuột A và B đều tăng lên, tức là hạt từ đã theo đường tĩnh mạch đi đi đến cả 5 cơ quan này Sau khi gia nhiệt 30 phút, nhiệt độ tại gan của chuột A và B là cao nhất, sau đó đến phổi, lách, u, và thấp nhất là ở thận. Điều đó chứng tỏ khi tiêm ven, hạt từ sẽ tập trung nhiều nhất tại gan và thấp nhất là tại thận. Đặc biệt nhiệt độ tại khối u cũng tăng lên, có nghĩa là hạt từ vẫn có thể theo đường tĩnh mạch đến tập trung tại khối u, tuy khơng nhiều bằng 1 số cơ quan khác như gan hay phổi Điều này giúp chúng ta có hy vọng rằng có thể đưa hạt từ vào những khối u nằm sâu bên trong cơ thể bằng con đường tiêm tĩnh mạch So sánh giữa chuột A và chuột B thì ta thấy sau khi tiêm tĩnh mạch và để thời gian lâu hơn thì nhiệt độ ở gan, lách và u tăng lên, chỉ có ở phổi là giảm đi, còn ở thận là gần như khơng thay đổi chứng tỏ khi để thời gian lâu hơn thì hạt từ vẫn tiếp tục theo đường máu đi đến các cơ quan và sự phân bố hạt từ giữa các cơ quan đã khác đi. Khi để thời gian tăng từ 60 phút lên 180 phút thì nhiệt độ bão hồ tại khối u cũng tăng từ 37.3oC lên 40.04 oC. Nhưng bên cạnh đó thì nhiệt độ ở các cơ quan khác lại khơng giảm đi mà cũng tăng lên. Điều đó có nghĩa là nếu muốn dùng kỹ thuật tiêm tĩnh mạch đưa hạt từ đến khối u để có thể gia nhiệt thì phải tìm biện pháp ngăn cản khơng cho hạt từ đi đến những cơ quan khác nữa, như vậy thì khi gia nhiệt mới khơng làm ảnh hưởng đến các tế bào lành 3.4.3.2. Kết quả khảo sát sự phân bố ngun tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Phương pháp khảo sát sự phân bố nguyên tố sắt (nguồn gốc vật liệu từ) trong một số cơ quan và khối u của chuột Swiss bằng đốt nhiệt từ chỉ có thể cho biết nhiệt độ bão hồ mà khơng thể biết được chính xác hàm lượng sắt có trong từng nội quan. Chính vì vậy sau khi làm thí nghiệm ở mục 2.3.6.1 chúng tơi tiến hành thí nghiệm xác định hàm lượng sắt có trong khối u và một số cơ quan bằng máy quang phổ hấp thụ ngun tử (AAS) Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 62 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Sau khi gây u rắn dưới da thành cơng trên chuột Swiss, tới ngày thứ 8 chọn 2 chuột có kích thước khối u tương đồng nhau, chuột A đối chứng ung thư, chuột B – tiêm ven 2000µg hạt từ E6, sau 60 phút tách lấy 5 cơ quan là gan, phổi, lách, u, và thận. Tiến hành tro hóa 5 nội quan này, thu được 1 dung dịch trong suốt, lấy 1ml dung dịch này đo bằng máy quang phổ hấp thụ ngun tử sẽ xác định được hàm lượng sắt có trong mẫu. Tính tốn theo cơng thức đã được trình bày trong mục 2.3.6.2, thu được kết quả trong bảng 10: Bảng 10. Hàm lượng sắt có trong 1g mẫu của 5 cơ quan tách ra từ chuột A và chuột B (ngFe/1g mẫu) Chuột A đối chứng ung B tiêm ven 2000µg thư hạt từ E6, để 60 phút Gan 0.15 Phổi 0.06 Lách 0.03 U 0.015 Thận 0.000012 Cơ quan Nhìn bảng 10, ta thấy sau khi tiêm ven 60 phút, lượng hạt từ E6 có mặt nhiều nhất trong gan, sau đó tới phổi, lách, khối u và thấp nhất là thận. Điều này hồn tồn phù hợp với kết quả được trình bày mục 3.4.3.1, theo đó khi đốt – nhiệt từ thì nhiệt độ ở gan là cao nhất, sau đó tới phổi, lách, khối u và thấp nhất là ở thận. Hàm lượng hạt từ có trong 1g khối u là 0.015 ng, tuy lượng này là rất nhỏ nhưng cũng đã chứng tỏ là có thể đưa được hạt từ đến khối u bằng kỹ thuật tiêm tĩnh mạch. Điều quan trọng là phải tìm ra những phương pháp nhằm đưa được số lượng hạt từ đến khối u là lớn nhất, và lượng hạt từ đến các cơ quan khác là Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 63 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm khơng đáng kể, có như vậy thì khi chiếu từ trường mới khơng làm ảnh hưởng tới các tế bào lành 3.4.4. Kết quả khảo sát liệu pháp đốt – nhiệt từ in vivo Mục đích cuối cùng và quan trọng nhất của tồn bộ những nghiên cứu này là khi tiêm hạt từ E6 vào khối u, gia nhiệt thì khối u tiêu giảm. Từ thí nghiệm gia nhiệt ex vivo, chúng tơi nhận thấy sau khi tiêm trực tiếp 300 400µg hạt từ E6 vào khổi u (đã tách rời cơ thể) và tiến hành gia nhiệt (60 Oe, 236 kHz) nhiệt độ trong khối u đã tăng lên 11 oC (từ 31 lên 42 oC). Nhiệt độ này đủ giết chết tế bào ung thư mà khơng làm ảnh hưởng tới các tế bào lành xung quanh. Kết quả này tạo tiền đề để chúng tơi tiến hành thí nghiệm gia nhiệt in vivo trên chuột Swiss mang u rắn dưới da. Tồn bộ kết quả của thí nghiệm đều được ghi lại bằng hình ảnh. Gọi ngày gia nhiệt đầu tiên là ngày 1 Hình 26. Hình ảnh chuột A – Đối chứng sinh học Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 64 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Ngày 0 Ngày 1 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 7 Ngày 11 Ngày 14 Ngày 18 Hình 27. Ảnh chuột B chuột đối chứng ung thư Những hình ảnh trên cho thấy chuột B ở ngày thứ 6 sau khi cấy truyền tế bào ung thư (được đánh dấu ngày 0) có khối u phát triển lồi, tròn dưới da, kích thước 6.0x6.0mm, bắt đầu xuất hiện lõi màu hồng (dấu hiệu u sắp bị hoạt tử) Các ngày sau khối u to dần cùng với lõi hoại tử dần hiện rõ, lan rộng và sâu hơn Đến ngày thứ 18 thì khối u phát triển rất to, kích thước lên tới 23.0x21.0 (mm) Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 65 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Ngày 0 Ngày 7 Ngày 1 Ngày 11 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 14 Ngày 18 Hình 28. Hình ảnh chuột đối chứng khơng tiêm hạt từ nhưng có chiếu từ trường (chuột C) trong 18 ngày theo dõi Với kích thước khối u ban đầu tương tự như chuột B, chuột C khơng được tiêm hạt từ vào u nhưng được chiếu từ trường 3 lần với cường độ từ trường 60 Oe, tần số dòng xoay chiều 236 kHz, ngày 1, ngày 4 và ngày 7 lần lượt là ngày chiếu lần 1, lần 2 và lần 3. Song kích thước khối u khơng giảm và cũng khơng nhỏ hơn kích thước khối u chuột đối chứng B. Tới ngày thứ 18 thì khối u đã rất lớn, lõi hoại tử và u lan rộng gần như hết cả vùng bụng chuột. Điều này cho Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 66 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm thấy nếu khơng tiêm hạt từ thì gia nhiệt cũng khơng có tác dụng làm tiêu giảm khối u Ngày 0 Ngày 1 Ngày 7 Ngày 8 Ngày 4 Ngày 11 Ngày 5 Ngày 13 Hình 29. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần nhưng khơng dược chiếu từ trường (chuột D) trong 13 ngày theo dõi Quan sát trên hình ảnh chúng tơi nhận thấy sau lần thứ nhất tiêm trực tiếp 400µg hạt từ E6 vào khối u (ngày 1), trên bề mặt khối u cũng xuất hiện 1 lớp vảy đen tương tự như trên những khối u được tiêm trực tiếp hạt từ E6 và có gia nhiệt. Nhưng nếu quan sát kỹ hơn thì lớp vảy đen này khơng có màu đen hồn tồn, khơ cứng, và đặc biệt khơng lan rộng ra như lớp vảy đen trên khối u được tiêm trực tiếp hạt từ và có gia nhiệt. Sau đó mặc dù tiêm thêm 2 lần nữa, vào ngày thứ 4 và thứ 7 những lớp vảy đen này vẫn giữ ngun như ban đầu, vành khối u vẫn tiếp tục mở rộng, kích thước khối u tăng lên rất nhanh. Điều này cho thấy nếu chỉ có tiêm trực tiếp hạt từ E6 vào khối u mà khơng gia nhiệt thì cũng khơng có tác dụng làm teo giảm khối u Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 67 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Ngày 0 Ngày 8 Ngày 1 Ngày 11 Ngày 4 Ngày 14 Ngày 6 Ngày 18 Ngày 7 Ngày 21 Hình 30. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 300µg/lần x 3 lần điều trị bằng liệu pháp gia nhiệt (chuột E) trong 21 ngày theo dõi Hình 30 là những hình ảnh của chuột E chuột tiêm trực tiếp hạt từ E6 vào khối u với lượng 300µg/lần x 3 lần vào các ngày 1, 4 và 7 sau cấy truyền tế bào ung thư. Ngay sau ngày gia nhiệt đầu tiên (ngày 1), trên bề mặt khối u xuất hiện 1 vảy đen khơ cứng, khối u khơng gia tăng kích thước. Sau khi gia nhiệt lần thứ 2 (ngày 4) thì vảy đen này lan rộng ra, khối u có dấu hiệu xẹp xuống và khơng lan rộng thêm ra . Đặc biệt sau lần gia nhiệt thứ 3 (ngày 7), vảy đen đã lan rộng khắp khối u, khối u khơng còn lồi tròn như ban đầu mà xẹp dần xuống và Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 68 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm đến ngày thứ 8 thì khối u đã hồn tồn xẹp xuống. Điều này chứng tỏ rằng khi tiêm hạt từ và gia nhiệt, nhiệt độ trong khối u tăng lên đã giết chết tế bào ung thư. Vảy đen khơ cứng đó có thể là do tế bào ung thư chết tạo thành. Khi theo dõi những ngày tiếp theo thì khối u vẫn xẹp xuống, khơng tăng kích thước, vảy đen ngày càng thu hẹp và đến ngày 21 thì bong hồn tồn, để lại 1 vết sẹo nhỏ trên da bụng chuột. Tiếp tục theo dõi đến ngày thứ 35 thì thấy chuột vẫn hồn tồn khỏe mạnh, khối u khơng tái phát, chỉ còn lại vết sẹo nhỏ trên da Ngày 0 Ngày 1 Ngày 4 Ngày 8 Ngày 11 Ngày 14 Ngày 6 Ngày 18 Ngày 7 Ngày 22 Hình 31. Hình ảnh chuột được tiêm hạt từ E6 liều 400µg/lần x 3 lần điều trị bằng liệu pháp gia nhiệt (chuột F) trong 22 ngày theo dõi Hình 31 là những hình ảnh của chuột F – tiêm trực tiếp 400µg hạt từ E6 vào khối u và gia nhiệt 3 lần. Trước khi điều trị thì chuột F có khối u lồi tròn, kích thước 6.5x6.5 (mm), sau khi gia nhiệt lần đầu tiên (ngày 1), trên khối u cũng xuất hiện 1 vảy đen nhưng nhỏ, khối u chưa có dấu hiệu xẹp xuống. Nhưng sau khi Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 69 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm gia nhiệt lần thứ 2 (ngày 4) vảy đen trên đầu khối u đã lan rộng hơn, tới ngày thứ 6 thì khối u đã xẹp xuống rất nhiều, khơng còn lồi tròn như ban đầu nữa. Sau khi gia nhiệt lần thứ 3 thì khối u đã xẹp hồn tồn, những ngày sau đó vảy đen ngày càng khơ cứng và thu nhỏ dần lại, đến ngày 22 thì bong hồn tồn, để lại vết sẹo trên da bụng chuột. Chúng tơi cũng theo dõi đến ngày thứ 35 mà chưa phát hiện chuột D bị tái phát lại. Chuột hoạt động ăn uống bình thường, khỏe mạnh và trên da chỉ có 1 vết sẹo nhỏ So sánh giữa chuột E – tiêm trực tiếp với lượng 300µg và chuột F – tiêm trực tiếp với lượng 400µg dung dịch hạt từ E6 chúng tơi thấy khơng có sự khác biệt nhiều. Ở cả hai trường hợp, khối u đều tiêu giảm, xẹp hẳn và chỉ để lại vết sẹo nhỏ trên da, khơng phát hiện bị tái phát sau 4 tuần kể từ lần điều trị gia nhiệt cuối cùng. Từ những kết quả khả quan trên, chúng tơi đã lặp lại thí nghiệm gia nhiệt in vivo, để khẳng định chắc chắn khối u chuột E, F tiêu giảm là do tác dụng của hạt từ E6, khi tiêm trực tiếp vào khối u và chiếu từ trường. Kết quả thí nghiệm lặp lại cũng tương tự như thí nghiệm lần 1. Từ đó chúng tơi đưa ra được những kết luận sau: Hạt từ E6 khi được tiêm trực tiếp vào khối u rắn Sarcoma dưới da chuột nhắt trắng Swiss khơng gây ảnh hưởng đến hoạt động, trạng thái sinh lí của chuột mang u Hạt từ E6 khi được tiêm liều 300400μg trực tiếp vào khối u và áp dụng liệu pháp gia nhiệt (60 Oe, 236kHz) có tác dụng làm teo hồn tồn khối u thực nghiệm trên chuột Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 70 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được, chúng tơi đưa ra một số kết luận như sau: 1. Đã khảo sát độc tính in vitro của H01 và E6 trên một số dòng tế bào ung thư và tế bào lành. Nồng độ độc ngưỡng của H01 đối với tế bào dòng H358 là 0.2ng/1 tế bào, H460 là 0.4 ng/1 tế bào, MCF7 là 0.2 ng/1 tế bào, HepG2 là 0.3 ng/1 tế bào và Fibroblast là 0.4 ng/1 tế bào. Nồng độ độc ngưỡng của E6 đối với tế bào dòng HeG2 là 0.5 ng/1 tế bào, Fibroblast là 1.0 ng/1 tế bào 2. Sự có mặt của H01 làm tăng độ tương phản ảnh khối u đùi trên chuột thực nghiệm trong chụp cộng hưởng từ hạt nhân (MRI) 3. Mẫu hạt từ E6 khi được chiếu từ trường ngồi (60 Oe, 236 kHz) có khả năng làm gia tăng nhiệt độ. Nồng độ E6 càng cao, tốc độ gia tăng nhiệt độ ban đầu càng lớn và nhiệt độ bão hoà càng cao Khi E6 có mặt khối u thực nghiệm cách tiêm trực tiếp 400µg, chiếu từ trường ngồi ex vivo 30 phút, nhiệt độ trong u tăng từ 31oC lên 42 o C 5. Mẫu E6 khi được tiêm tĩnh mạch cho chuột mang u rắn dưới da liều 2000µg sau 60 phút được phát hiện có mặt các cơ quan sau (sắp xếp theo thứ tự nhiều đến ít nhất): gan, phổi, lách, u, thận bằng phương pháp đốt – nhiệt từ và kỹ thuật quang phổ hấp thụ ngun tử 6. Mẫu E6 khi được tiêm liều 300 – 400 µg trực tiếp vào khối u và chiếu từ trường ngồi (60 Oe, 236 kHz) 30 phút, lặp lại 3 lần có tác dụng là teo hồn tồn khối u rắn dưới da trên chuột nhắt trắng dòng Swiss Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 71 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm KIẾN NGHỊ Khảo sát lại sự phân bố của hạt từ E6 tại các cơ quan trong cơ thể chuột khi tiêm tĩnh mạch, tìm ra các biện pháp nhằm tập trung hạt từ tại khối u là chủ yếu, ở các nội quan khác là khơng đáng kể Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 72 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 73 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Phan Hà Châu, Ngun lý và kĩ thuật chụp cộng hưởng từ, Khoa chẩn đốn hình ảnh – Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh 2. Nguyễn Hồng Hải, Chế tạo và ứng dụng hạt nano từ tính trong Y sinh, Báo cáo hội nghị Vật lý tồn quốc (2007) 3. Trần Đức Quang, Ngun lý và kĩ thuật chụp cộng hưởng từ (2007), NXB ĐHQG TP Hồ Chí Minh TÀI LIỆU TIẾNG ANH 4. Alexiou C. and Jurgons R. (2007), “Magnetic drug targeting”, Magnetism in medicine: a handbook, second edition, edited by W. Andra and H. Howak, Willey, Berlin, pp. 597605 Alexiou C., Arnold W., Klein R J., Parak F G., Hulin P., Bergemann C., Erhardt W., Wagenpfeil S., and Lubbe A S (2000), “Locoregional cancer treatment with magnetic drug targeting”, Cancer Res., 60, pp. 6641–6648 6. Allen L. M., Kent J., Wolfe C., Ficco C., and Johnson J. (1997), “MTC TM: a magnetically targetable drug carrier for paclitaxel”, Scientific and clinical applications of magnetic carriers, edited by Hafeli U., Schutt W., Teller J., and Zborowski M., Plenum Press, New York, London, pp. 481494 7. Chan D.C.F., Kirpotin D.B., Bunn P.A. (1993), “Synthesis and evaluation of colloidal magnetic iron oxides for the sitespecific radiofrequencyinduced hyperthermia of cancer”, J. Magn. Magn. Mater., 122, pp. 374378 8. Gilchrist R.K., Medal R., Shorey W.D., Hanselman R.C., Parrot J.C., and Talor C.B. (1957), “Sellective inductive heating of lymph nodes”, Ann Surgery, 146, Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 74 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 75 Luận văn Thạc sỹ Khoa học Sinh h ọc th ực nghiệm Phạm Thị Hà Giang Cao học 17 (2008 2010) 76 ... thuộc vào từng vật li u cụ thể), tính sắt từ biến mất, chuyển động nhiệt sẽ thắng thế và làm cho vật li u trở thành vật li u si u thuận từ. Đối với vật li u si u thuận từ, từ dư và lực kháng từ bằng ... sản xuất tại Việt Nam vào ứng dụng trong đi u trị ung thư, chúng tơi nhận để tài Nghiên c u ứng dụng vật li u nano từ trong chẩn đốn và đi u trị khối u thực nghiệm làm đề tài luận văn cao học nhằm thực hiện một số nhiệm vụ cơ bản sau: 1. Xác định độc tính của chất lỏng từ. .. Những khái niệm cơ bản về hạt nano từ và ứng dụng 1.1.1 Vật li u nano Vật li u nano là vật li u trong đó ít nhất một chi u có kích thước nm. Dựa vào hình dáng vật li u, người ta phân chia thành các loại sau: Vật li u nano khơng chi u (cả ba chi u đ u có kích thước nano, khơng