`HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME PROTEASE VÀ β- GLACTOSIDASE Người thực : NGUYỄN THỊ THOA Lớp : CƠNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Khóa : 58 Giáo viên hướng dẫn : TS.NGUYỄN THỊ LÂM ĐOÀN Địa điểm : TRUNG TÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Hà Nội - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu Khóa luận trung thực Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực Khóa luận cám ơn thông tin trích dẫn chuyên đề ghi rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên NGUYỄN THỊ THOA i LỜI CÁM ƠN Trong qúa trình thực khóa luận phòng thí nghiệm Bộ mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm, giúp đỡ tận tình thầy giáo, cán phòng thí nghiệm mơn, cố gắng nỗ lực thân tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Lâm Đồn – Bộ mơn Hóa sinh – Cơng nghệ sinh học thực phẩm, Khoa công nghệ thực phẩm người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện mặt tốt cho tơi suốt q trình thực đề tài hồn thiện khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ts Nguyễn Hoàng Anh, Th.s Phạm Thị Dịu, KS Nguyễn Thị Hồng cán phòng Thí nghiệm Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam giúp đỡ tơi tận tình suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ, bảo ân cần thầy giáo, giáo Bộ mơn Hóa sinh – Công nghệ sinh học thực phẩm, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam suốt thời gian hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè giúp đỡ động viên, khích lệ cho tơi thời gian Với quỹ thời gian có hạn hiểu biết nhiều hạn chế nên q trình thực khóa luận tơi khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót Kính mong có góp ý kiến thầy bạn để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Sinh viên Nguyễn Thị Thoa ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii PHẦN THỨ NHẤT-MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II -TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme protease 2.1.1 Enzyme protease 2.1.2 Nguồn thu nhận protease 2.1.3 Ứng dụng protease 2.2 Enzyme β-galactosidase 2.2.1 Nguồn thu nhận 2.2.2 Ứng dụng enzyme β-galactosidase 2.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất protease β-galactosidase nước.10 2.4 Vi khuẩn lactic 12 2.4.1 Đặc điểm chung .12 2.4.2 Phân loại 13 2.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng 13 2.4.4 Ảnh hưởng yếu tố môi trường tới trình trao đổi chất vi khuẩn lactic 14 iii 2.4.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic việc thu nhận enzyme .15 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu 16 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 3.1.2 Môi trường ni cấy, thí nghiệm 16 3.1.3 Thiết bị dụng cụ: 17 3.2 Nội dung nghiên cứu 18 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp hoạt hóa giữ giống 19 3.3.2 Phương pháp xác định khả sinh enzyme protease, β-galactosidase 20 3.3.3 Xác định hoạt độ protease, enzyme β-galactosidase chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn .21 3.3.4 Xây dựng đường cong sinh trưởng chủng lactic có hoạt độ enzyme cao 24 3.3.5 Xây dựng đường cong hoạt độ chủng lactic .25 3.3.6 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu nhiệt độ thấp .25 3.3.7 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme chịu pH thấp 25 3.3.8 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme bền pH thấp 25 PHẦN IV :KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Tuyển chọn chủng lactic có hoạt tính protease, β-galactosidase 26 4.1.1 Kết chủng lactic có hoạt tính protease 26 4.1.2 Khả sinh enzyme β – galactosidase .28 4.2 Hoạt độ enzyme protease, β-galactosidase vi khuẩn lactic 30 4.2.1 Hoạt độ enzyme protease 30 4.2.2 Hoạt độ enzyme β – galactosidase 31 4.3 Đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic có hoạt độ βgalactosidase cao .32 iv 4.4 Đường cong hoạt độ enzyme có hoạt độ cao .33 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu nhiệt độ thấp .34 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu acid thấp 35 4.7 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme bền với acid thấp.35 PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 41 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Chủng vi khuẩn lactic dùng thí nghiệm 17 Bảng 3.2 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS 17 Bảng 3.3 Môi trường để xác định khả sinh protease .17 Bảng 3.4 Danh sách thiết bị sử dụng để nghiên cứu đề tài 18 Bảng 3.5 Danh sách hóa chất .18 Bảng 3.6 Số liệu dựng đường chuẩn oNP 24 Bảng 4.1 Đường kính vòng phân giải casein 11 chủng có vòng phân giải lớn .27 Bảng 4.2 Mức độ màu sắc vi khuẩn có khả sinh enzyme β- .29 Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme protease 11 chủng vi khuẩn 31 Bảng 4.4 Hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn lactic .31 Bảng 4.5 Hoạt độ enzyme nhiệt độ 35 Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme hai pH 35 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Phản ứng thủy phân enzyme protease Hình 2.2 Sơ đồ thủy phân lactose enzyme β-galactosidase Hình 3.1 Đường chuẩn oNP 24 Hình 4.1: Vòng phân giải casein enzyme protease số chủng lactic 28 Hình 4.2 Xác định khả sinh enzyme β-galactosidase phương pháp đĩa thạch 29 Hình 4.3 Thể đường cong sinh trưởng vi khuẩn lactic .33 Hình 4.4 Đường cong hoạt độ enzyme 34 Hình 4.5 Hoạt độ tương đối enzyme BE 1.9 36 vii DANH MỤC VIẾT TẮT Kí Hiệu Tên Đầy Đủ CS NXB Cs Nhà xuất oNPG ortho-Nitrophenyl-β-galactoside KH&CN Khoa học Công nghệ A Aspergillus B Bacillus S Actinomycetes F-C Folin TCA Tricloacetic acid viii Hình 4.2 Xác định khả sinh enzyme β-galactosidase phương pháp đĩa thạch Xác định khả sinh Enzyme β-galactosidase phương pháp cấy chấm điểm đĩa thạch Từ việc tiến hành khả sinh Enzyme β-galactosidase phương pháp thu kết bảng 4.2 29 Bảng 4.2 Mức độ màu sắc vi khuẩn có khả sinh enzyme βgalactosidase STT Nguồn phân lập TÊN CHỦNG MỨC ĐỘ MÀU SẮC 10 11 12 13 14 Dưa muối cải bắp BA 2.11 BA 2.12 BA 2.3 BA 3.11 BA 3.2 BA2.1 BA2.6 BE 1.9 BE 2.6 BE 3.1 BE 3.2 RGD1.3 RGH 7.1 RGH 8.8 Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Xanh đậm Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Xanh nhạt Xanh nhạt Xanh đậm Dưa muối cải bẹ Ruột gà di Ruột gà Hồ Tiến hành kiểm tra 28 chủng phương pháp phần 3.3.2 chúng tơi thu kết có 14 chủng có khả Enzyme β-galactosidase, enzyme thủy phân X-gal tạo thành khuẩn lạc có màu xanh Các chủng lại khơng thủy phân X-gal tạo khuẩn lạc màu xanh nên khơng có khả sinh Enzyme βgalactosidase So với đề tài nghiên cứu phân lập, tuyển chọn nghiên cứu vi khuẩn Enzyme β-galactosidase từ sáp ong Trần Thị Thúy, Nguyễn Thị Vân, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khi nuôi mơi trường có chất thị X-Gal, số chủng có khuẩn lạc chuyển mầu xanh thời gian hình thành khuẩn lạc ngắn (sau 6- nuôi cấy); số chủng lại có khuẩn lạc chuyển mầu xanh chậm (sau 24 nuôi cấy).Căn vào thời gian xuất màu xanh khuẩn lạc, độ đậm nhạt mầu xanh khuẩn lạc cho biết dự đoán phần hoạt độ enzyme Mầu xanh khuẩn lạc đậm có khả sinh enzyme cao, dự đốn chủng có màu xanh đậm có hoạt độ enzyme cao Chúng tơi tiếp tục tiến hành xác định hoạt độ enzyme 30 4.2 Hoạt độ enzyme protease, β-galactosidase vi khuẩn lactic 4.2.1 Hoạt độ enzyme protease Dựa kết đo vòng phân giải casein 11 chủng vi khuẩn lactic chúng tơi tiến hành xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp xác định hoạt độ enzyme Sigma trình bày phần 3.3.3, kết tính theo cơng thức mục 3.3.3 hệ số góc lấy đường chuẩn Tyrosine phụ lục Kết thể bảng 4.3 Bảng 4.3: Hoạt tính enzyme protease 11 chủng vi khuẩn STT 10 11 Nguồn Phân Lập Dưa muốí cải bắp Dưa muối cải bẹ Ruột gà di Ruột gà Hồ Tên BA 2.12 BA1.10 BA1.3 BA2.11 BE 2.6 BE 3.2 BE 3.7 BE1.9 RGD 5.5 RGD 8.1 RGH 7.1 Hoạt tính (U/ml) 0.008 0.0066 0.0020 0.0205 0.0120 0.0096 0.0163 0.0018 0.0066 0.0083 0.0024 Dựa vào bảng 4.3 xác định hoạt độ protease 11 chủng vi khuẩn Nhận thấy hoạt độ enzyme protease thấp so với nghiên cứu hoạt tính protease nghiên cứu Ở giá trị pH với pH chúng tôi, pH 6-6,5, hoạt độ protease trung bình (0,5U/ml) theo đề tài nghiên cứu hoạt tính protease Võ Hồng Thi cs 2012, nên hoạt tính enzyme chúng tơi tìm khơng có tính ứng dụng cao Chính chúng tơi tập trung vào nghiên cứu enzyme β- galactosidase 4.2.2 Hoạt độ enzyme β – galactosidase Dựa vào kết định tính chúng tơi tiến hành bước xác định βgalactosidase chủng lactic sinh enzyme Kết xác định hoạt độ β-galactosidase 14 chủng thể bảng 4.4 Bảng 4.4 Hoạt độ β-galactosidase vi khuẩn lactic STT TÊN NGUỒN TÊN CHỦNG Hoạt độ (U/l) 31 PHÂN LẬP BA 2.11 29.45 BA 2.12 21.89 BA 2.3 23.56 BA 3.11 27.15 BA 3.2 47.61 BA2.1 24.84 BA2.6 18.55 10 BE 1.9 BE 2.6 BE 3.1 42.51 17.13 24.76 BE 3.2 55.65 RGD 1.3 16.88 RGH 7.1 22.13 Dưa muốí cải bắp Dưa muối cải bẹ 11 12 13 Ruột gà di Ruột gà Hồ 14 RGH 8.8 28.34 Dựa vào bảng 4.4 nhận thấy 14 chủng lactic sinh enzyme β-galactosidase, chủng BE3.2 cho hoạt tính cao nhất, trội nhất, đạt 55.65 U/l Để so sánh hoạt độ chủng với tơi lấy chủng BE 3.2 có giá trị cao 100% để so sánh với chủng khác Nhận thấy hai chủng BA 3.2 BE 1.9 có giá trị cao enzyme chủng lại chiếm 66.82 % 58.84 % Do yếu tố ứng dụng enzyme ngoại bào dễ ứng dụng công nghiệp, không thời gian công sức chi phí phá vỡ tế bào, nên nội dung khóa luận nghiên cứu enzyme ngoại bào, hoạt tính hoạt tính ngoại bào Nhận thấy chủng xanh nhạt có hoạt độ enzyme thấp Như kết định tính định lượng có tính tương đồng 4.3 Đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic có hoạt độ βgalactosidase cao Sau xác định ba chủng BA3.2, BE1.9, BE3.2 có hoạt độ enzyme cao Ni cấy chủng vi khuẩn lactic điều kiện tối thích cho sinh trưởng vi khuẩn Sau đo OD600 để xây dựng đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic chọn, nhằm tìm thời điểm vi khuẩn cho nhiều sinh khối, sinh trưởng 32 mạnh (Trần Quốc Việt cs, 2009) Hình 4.3 Thể đường cong sinh trưởng vi khuẩn lactic Như vậy,nhìn vào đồ thị đường cong sinh trưởng chủng vi khuẩn lactic ta thấy giai đoạn đầu khoảng 0-12h số lượng vi khuẩn tăng chủng vi khuẩn chuyển sang mơi trường chưa kịp thích nghi với điều kiện môi trường, tế bào cần thời gian định để tổng hợp enzyme nhằm sử dụng chất dinh dưỡng Các tế bào bị tổn thương cần thời gian để phục hồi (pha lag) Sau thích nghi với điều kiện mơi trường mới, vi khuẩn bắt đầu sinh trưởng phát triển mạnh mẽ khoảng thời gian 12-24h (pha log) Khoảng thời gian 24-36h nồng độ vi khuẩn giữ mức độ tương đối ổn định (pha cân bằng) Trong giai đoạn số lượng tế bào sống không thay đổi nhiều, số lượng tế bào sinh cân với số tế bào chết đi, tế bào ngừng phân cắt mà giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất Nguyên nhân dẫn đến nồng độ vi khuẩn khơng tăng mạnh trước nhiều yếu tố như: Sự giảm chất dinh dưỡng mơi trường, bị đình sinh trưởng gặp tích lũy sản phẩm trao đổi chất có hại Sau khoảng thời gian 36h ta thấy nồng độ tế bào giảm mạnh việc tiêu 33 hao chất dinh dưỡng việc tích lũy chất độc hại làm tổn thất đến môi trường sống vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống (pha suy vong) Để xác định thời gian lên men thu hồi sinh khối thích hợp, ta chọn thời điểm dừng đầu pha cân (tức24h), khoảng thời gian vi khuẩn lactic thời kì chuyển từ sinh trưởng phát triển mạnh sang pha cân 4.4 Đường cong hoạt độ enzyme có hoạt độ cao Ba chủng BE 3.2; BA 3.2 BE 1.9 nuôi cấy môi trường MRS điều kiện 340C, lắc 200 vòng/phút Trong vòng 72 thời điểm ni cấy định, dịch nuôi cấy lấy để xác định hoạt độ phương pháp Sigma Kết Hình 4.4 Đường cong hoạt độ enzyme Dựa vào đồ thị hình 4.4 phụ lục , hoạt độ enzyme bắt đầu tăng nhanh sau 12 nuôi cấy đạt mức cao sau nuôi 36h Hoạt độ enzyme chủng giảm nhanh sau 48h giai đoạn vi khuẩn bắt đầu pha suy vong Qua kết luận thời gian nuôi cấy thu enzyme cao 36 Đây khoảng thời gian ni cấy thường tìm thấy số nghiên cứu S Sharmin cs, 2005; W Shumi cs, 2004 Theo tác giả này, cuối pha sinh tổng hợp tế bào bắt đầu tự phân tốc độ enzyme bị chậm lại Như lựa chọn thời gian thích hợp để thu enzyme 36 để tiến 34 hành thí nghiệm xác định đặc tính enzyme 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu nhiệt độ thấp Enzyme chịu nhiệt độ thấp bảo quản lâu, thích hợp bảo quản enzyme thời gian định vây hướng đề tài nhằm vào nhiệt độ thấp 80c ,nhiệt độ mát thích hợp bảo quản enzyme Bảng 4.5 Hoạt độ enzyme nhiệt độ Tên chủng BA3.2 BE 3.2 BE 1.9 Hoạt độ ( 80 ) Hoạt độ ban đầu Phần trăm hoạt 36.46 35.19 36.62 ( 300 ) 47.61 55.65 42.51 độ so với ban đầu 76.58% 63.23% 86.14% Qua bảng ta nhận thấy chủng BE 1.9 có hoạt độ thấp hai chủng lactic lại, có khả chịu nhiệt độ thấp cao Hoạt độ enzyme giảm 13,86% so với hoạt tính ban đầu Theo Nguyễn Thị Hải Yến với khảo sát đặc tính khả thu nhận enzyme -galactosidaza từ vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis, nghiên cứu cho thấy với chủng vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis hoạt độ enzyme nhiệt độ 80c giảm 12,54% so với hoạt độ enzyme ban đầu Như nghiên cứu chúng tơi có tương tự, chênh lệch không đáng kể so với nghiên cứu từ chủng vi khuẩn khác 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu acid thấp Khả chịu pH thấp từ 2-3 có ứng dụng quan trọng việc hấp thu đường lactose thể Trong thể, dày có pH2 đến pH3, muốn bổ sung enzyme vào thể để phân giải lactose tránh tượng khơng dung nạp đường sữa enzyme phải chịu pH dày Đây hướng đề tài hướng tới với khả chịu pH=2 pH=3 enzyme Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme hai pH Tên Hoạt độ Phần trăm hoạt độ so với 35 BA 3.2 BE 3.2 BE 1.9 pH=2 pH=3 pH=6.5 31.84 33.36 33.51 38.53 33.51 39.41 47.61 55.65 42.51 ban đầu pH=2 66.87% 59.94% 78.82% pH=3 80.92% 60,21% 92.70% Qua bảng 4.6 ta nhận thấy chủng lactic BE 1.9 có enzyme β-galactosidase chịu pH thấp tốt pH=2 pH=3 Ở pH=2 enzyme có hoạt độ 33,51 pH=3 enzyme có hoạt độ 39.41, hoạt độ pH =2 giảm 14,97% so với pH =3 Đây số nhỏ chứng tỏ enzyme chịu pH cao So với nghiên cứu khả chịu pH enzyme β-galactosidase vi khuẩn lactic từ sáp ong Trần Thị Thúy, Nguyễn Thị Vân, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội hoạt độ enzyme chủng vi khuẩn lactic có pH=3 giảm so với pH ban đầu 27.95% nghiên cứu 22.1% Như chủng BE1.9 chủng cần tìm 4.7 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme bền với acid thấp Nhờ vào kết trên, nhận thấy chủng BE1.9 chịu pH thấp tốt Từ tơi tiến hành thí nghiệm kiểm tra khả bền acid enzyme Enzyme chủng BE1.9 ủ pH=2 pH=3, nhiệt độ 30 0c với tỉ lệ enzyme đệm Britton robinson pH=2 pH=3 1:1 Tại thời điểm khác enzyme lấy để xác định hoạt độ Đến hoạt độ giảm xuống gần 50% dừng Hình 4.5 Hoạt độ tương đối enzyme BE 1.9 36 Nhìn vào đồ thị ta thấy enzyme BE 1.9 có khả giữ hoạt tính pH2 pH3 khoảng thời gian Hoạt tính tương đối chủng sau 50% Theo công bố khoa học y tế cho biết khả tiêu hóa thức ăn dày từ đến tiếng ,như khoảng thời gian từ đến tiếng enzyme trì hoạt độ 86.85% với pH=2 90.18% với pH=3 so với ban đầu Điều quan trọng việc nghiên cứu ứng dụng enzyme lĩnh vực sản xuất chế phẩm bổ sung vào thể giúp phân giải đường lactose 37 PHẦN V - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau xác định khả sinh enzyme protease 28 chủng vi khuẩn lactic ta thu 11 chủng có khả sinh protease, có 14 chủng có khả Enzyme βgalactosidase, chủng sinh hai enzyme - Trong 11 chủng có khả sinh protease có hoạt độ enzyme protease thấp -Trong 14 chủng sinh enzyme β-galactosidase có chủng có hoạt độ enzyme βgalactosidase cao BA 3.2; BE 3.2; BE 1.9 - Xác định thời điểm thu enzyme thích hợp ni vi khuẩn 36h -Xác định khả chịu nhiệt độ lạnh pH acid chủng lactic tuyển chọn ba chủng BA3.2; BE3.2 BE 1.9 -Xác định chủng BE 1.9 có khả bền pH thấp vòng 8h ứng dụng tốt cơng nghiệp chế biến 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu bị giới hạn, chúng tơi có số kiến nghị cho nghiên cứu sau: - Định tên chủng BE 1.9 phương pháp sinh học phân tử; - Tinh xác định đặc tính enzyme để có định hướng ứng dụng enzyme - Sản xuất chế phẩm enzyme dạng bổ sung vào sữa viên uống giúp phân giải tốt đường sữa 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng (2003), Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinase cellulase Trichoderma harzianum ảnh hưởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 321-324 Đỗ Q Hai (2012), Giáo trình cơng nghệ enzyme, Đại Học Khoa Học Huế Lê Thanh Hải (2013), Công nghệ enzyme, Trường cao đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM, tr 10-11 Lương Đức Phẩm (2006), Công nghệ sinh học bảo quản chế biến thực phẩm, Tài liệu dùng lớp cao học sinh học, Viện khoa học công nghệ Việt Nam Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh học, Nhà xuất Đại học Trung học chuyên nghiệp Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzyme protease từ Bacillus subtilis S5, Luận án tiến sĩ, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, tr 10-22 Trần Ngọc Hùng (2010), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis để sử dụng chế biến thức ăn gia cầm, Luận văn tiến sĩ, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, tr 36 - 42 10 Lê Ngọc Tú (chủ biên), Lê Văn Chứ, Phạm Trân Châu Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Giáo trình cơng nghệ ứng dụng emzyme, NXB Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội, tr 12 – 88 11 Lê Ngọc Tú cộng sự, Hóa sinh cơng nghiệp, Nxb Khoa học vả Kỹ thuật Hà Nội, tr 92-94, 109-112 12 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007), Tương lai ứng dụng enzyme xử lý 39 chất thải, Tạp chí khoa học ĐH Quốc gia Hà Nội, Khoa học kỹ thuật công nghệ, tr 75-85 13 Phạm Thị Trân Châu (1993), Công nghệ ứng dụng proteinase công nghiệp chế biến, Tạp chí thủy sản, số 14 Nguyễn Văn Cách, Bùi Thị Hải Hòa, Đặng Thị Thu (2008), Tách, tinh chế xác định đặc tính β-galactosidase từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 3, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 287-289 15 Trần Thị Thúy, Nguyễn Thị Vân, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội(2013), Phân lập, tuyển chọn chủng lactic sinh enzyme β-galactosidse từ sáp ong, 6-10 Tài liệu nước Davail, S.; Feller, G.; Narinx, E.; Gerday, C (1994) Cold adaptation of protein J Biol Chem, 269 Genckel H and Tari C (2006), “Alkaline protease production from alkalophillic bacillus sp isolated from nature habitats”, Enzyme and Microbial tehnology 39, pp 703-710 Al Shehri Abdulrahman MM Yasser S (2004), “Production of protease produced by B licheniformis isolated from Tihamet Aseer Saudi Arabia Pak” J Biol Sci 7(9), pp 121-135 Ling Lin Liu and Geogre M Pigott (1988), “Preparation and use of inexpensive crude pepsin for enzyme hydrolysis of fish” Journal of food science, pp 15691572 Mabrouk, Y., L Zourgui, P Delavault, P Simier and O Belhadji (2007), “Some compatible Rhizobium leguminosrum strain in peas decrease in fection when parasitized by Orobanche crenata”, Weed Res, 47, pp 44-53 Alagarsamy sumanth (2005), “Microbiology and Industrial biotechnology of food - Grade Protease”, Aperspective, Food technol Biotechnol, Vol.44, pp 211 - 212 Kerry T Yasunobu and James Mc Corn (1970), “Bacillus subtilis neutral protease” Proteolytic enzyme, Method in enzyme mology volume XIX, 40 Academie Press, pp 529-577 Alagarsamy sumanth (2005), “Microbiology and Industrial biotechnology of food - Grade Protease”, Aperspective, Food technol Biotechnol, Vol.44, pp 211 - 212 10 Wang Jet.al, Biotechnology and Bioengineering - 1999 11 Harju M, Kallioinen H, Tossavainen O (2012), Lactose hydrolysis and other 12 conversions in dairy products: technological aspects, Int Dairy J, 22, 104-109 Park AR, Oh DK (2010), Galacto-oligosaccharide production using microbial beta-galactosidase: current state and perspectives, Appl Microbiol Biotechnol 13 85, 1279-1286 Parmjit S Panesar, Shwta Kumari and Reeba Panesar (2010), Protential Applications of Ininiobilized β-galactosidase in Food Prossesing Industries, SAGEHindawi Access to Research, Enzyme Research, Article ID473/37, 16 page 14 S Nizamuddin, A Sridevi and G Narasimha (2008), Production of βgalactosidase by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation, African Journal of Biotechnology, vol (8), pp 1096-1100 15 Skovbjerg H, Sjöström H, Norén O (Mar 1981), Purification and characterisation of amphiphilic lactase/phlorizin hydrolase from human small intestine, European Journal of Biochemistry / FEBS, 114 (3), 653–61 16 Toru Nakayama, Teruo Amachi (1996), beta–galactosidaza enzymology Encyclopaedia of Food science, food technology and nutrion Vol.3 Academic Press, 1291 – 1305 17 Zuzana mlichová, Michal rosenberg (2006), Current trends of β-galactosidase application in food technology, Journal of Food and Nutrition Research, Vol 45, No 2, pp 47-54 41 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết đo OD đường chuẩn Tyrosine Thể tích Tyrosin 0.05 0.1 0.2 0.4 0.5 µM Abs Tyrosine ( 660nm) 0.055 0.111 0.221 0.442 0.553 0.08 0.173 0.359 0.7 0.86 Phụ lục 2: Đồ thị đường chuẩn Tyrosine Phụ lục : Kết đo OD chủng vi khuẩn lactic qua mốc thời gian Thời 12 18 24 36 gian BA1.9 0.0102 0.0583 1.6725 2.6248 1.818 5.2471 BE3.2 0.0123 0.546 1.6325 2.8898 3.9071 4.2733 BA3.2 0.0074 0.5123 1.6641 2.8404 3.8391 4.3878 Phụ lục 4: kết đo OD hoạt tính enzyme tời thời điểm Thời gian BE 3.2 Hoạt độ (U/l) BA 3.2 48 72 4.8679 2.8972 3.0142 0.523 0.1001 0.1010 BE 1.9 42 12 24 36 48 72 15.92 49.6 60.34 41.63 11.94 31.84 63.85 75.23 47.92 17.35 24.84 59.86 60.66 41.48 11.78 Phụ lục 5: Hoạt độ enzyme chủng BE1.9 thời điểm khác Thời Hoạt độ enzyme Hoạt độ enzyme điểm(h) t=0 pH=2 (U/l) 27.46 pH=3 (U/l) 28.58 t=2 25.67 27.43 t=4 22.03 24.12 t=6 20.21 21.45 t=8 14.14 15.02 43 ... cong hoạt độ enzyme có hoạt độ cao .33 4.5 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu nhiệt độ thấp .34 4.6 Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme chịu... lồi vi khuẩn khác, có khả sinh acid nên có khả sinh trưởng bình thường mơi trường có pH thấp, hướng nghiên cứu nhằm chọn chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme protease, β-galactosidase có đặc tính sinh. .. chủng vi khuẩn, giữ giống - Tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả sinh enzyme protease, βgalactosidase - Xác định hoạt độ protease, β-galactosidase vi khuẩn đươc tuyển chọn - Xây dựng đường cong sinh