TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(4): 469-476 TỐI ƯU HĨA THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG TẠO KHÍ HYDRO SINH HỌC CỦA CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau Dat PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT (RSM) Nguyễn Thị Yên1, Lại Thúy Hiền1, Nguyễn Thị Thu Huyền1,2* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *huyen308@gmail.com Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, thành phố Hồ Chí Minh TĨM TẮT: Thế kỷ 21 kỷ nguyên nguồn lượng tái tạo, lượng hydro sinh học lựa chọn sáng giá thay nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày cạn kiệt Hydro sinh học nhiều nước quan tâm, có nhiều ưu điểm tạo ñường lên men vi sinh vật Chủng vi khuẩn Trau DAt phân lập Việt Nam có khả tạo khí H2 sinh học điều kiện lên men kị khí Thể tích khí thành phần khí tạo chủng vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào yếu tố dinh dưỡng điều kiện mơi trường nuôi cấy Khi nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng môi trường nuôi cấy cho thấy glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O có tác động mạnh đến q trình tạo khí H2 chủng vi khuẩn Trau DAt Sử dụng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm ñáp ứng bề mặt dựa kiểu tâm phức hợp với biến glucose, cao nấm men FeSO4.7H2O, ñã xác ñịnh ñược tương tác yếu tố nêu tác động đến thể tích khí hydro sinh học chủng Trau DAt tạo Phương pháp qui hoạch thực nghiệm xác ñịnh ñược hàm lượng tối ưu yếu tố cho q trình tạo khí hydro glucose 12 g/l; cao men 2,5 g/l; FeSO4.7H2O 400 mg/l Thể tích khí thu ñược lên men chủng Trau DAt với thông số tối ưu nói 176,02 ml/150ml mơi trường Lên men theo mẻ với thể tích 600 ml mơi trường ñiều kiện tối ưu thu ñược 420 ml khí hydro Từ khóa: Hydrogen sinh học, RSM, vi khuẩn, Việt Nam MỞ ĐẦU Hydro sinh học ñược coi nguồn lượng thay tương lai ñốt cháy sinh lượng lớn, không tạo khí CO2, vậy, khơng gây nhiễm mơi trường Nghiên cứu sản xuất hydro sinh học ñã ñược nhiều quốc gia giới quan tâm, có q trình sản xuất khí hydro sinh học từ vi khuẩn kị khí [1, 6, 10] Các kết nghiên cứu q trình lên men thu khí hydro từ vi khuẩn kị khí cho thấy q trình bị ảnh hưởng nhiều yếu tố dinh dưỡng yếu tố mơi trường Do đó, tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao khả tạo khí hydro chủng vi khuẩn quan trọng [1, 2, 3, 6, 11] Gần ñây, nghiên cứu tối ưu yếu tố mơi trường để lên men tạo khí hydro sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm ñáp ứng bề mặt ñược nghiên cứu nhiều [7, 8, 12] Sử dụng phương pháp toán học qui hoạch thực nghiệm cho phép xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu đa yếu tố cách xác mức ñộ ảnh hưởng yếu tố đến q trình tạo khí hydro thời điểm Thêm vào đó, phương pháp cho thấy vai trò tác động qua lại yếu tố thời gian nuôi cấy với số lần thí nghiệm ít, đánh giá sai số lần thực nghiệm theo tiêu chuẩn thống kê, xem xét ảnh hưởng yếu tố với mức ñộ tin cậy cần thiết, tiết kiệm thời gian chi phí mà đem lại hiệu mong muốn Bằng việc sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm, nhiều tác giả ñã tương tác qua lại yếu tố mơi trường có tác động đến q trình tạo khí hydro Đồng thời, sử dụng phương pháp ñã xác ñịnh ñược nồng ñộ tối ưu cho yếu tố dinh dưỡng môi trường cho q trình lên men tạo khí hydro chủng vi khuẩn [7, 8, 9, 12] Trong cơng trình này, chúng tơi trình bày kết tối ưu hóa ba yếu tố glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O môi trường lên men tạo khí hydro sinh học từ chủng vi khuẩn kị khí Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau DAt phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology-RSM) kết phân tích thành phần khí lên men thể tích 600 ml dịch ni cấy điều kiện tối ưu tìm 469 Nguyen Thi Yen, Lai Thuy Hien, Nguyen Thi Thu Huyen VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng giống mơi trường ni cấy Chủng vi khuẩn kị khí Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau DAt phân lập mơi trường chọn lọc NMV từ mẫu phân trâu Đông Anh, Hà Nội [4] Môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn Trau DAt môi trường NMV [4] Phương pháp Nuôi cấy vi khuẩn kị khí mơi trường chọn lọc NMV Sử dụng phương pháp qui hoạch hóa thực nghiệm đáp ứng bề mặt ñể thiết kế ma trận thực nghiệm [4] Xác định thể tích khí hydro phương pháp chỗ nước (water displacement method) [4] Phân tích chất lượng hàm lượng khí hydro máy sắc kí khí GC-TCD (Thermo Trace GC-Thermo Electro-USA) với phương pháp thử EDC VI-003 GC [4] Thiết kế thí nghiệm xử lý số liệu Phương pháp qui hoạch thực nghiệm Xác ñịnh hàm lượng tối ưu yếu tố ảnh hưởng glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O cách sử dụng qui hoạch trực giao ñối xứng, yếu tố tiến hành mức (-1, 0, +1) bảng Qui hoạch thực nghiệm ñưa bảng ma trận thực nghiệm gồm 20 thí nghiệm, đó: 16 thí nghiệm tâm (qui hoạch tồn phần 24), thí nghiệm điểm (2 thí nghiệm cho biến) có thí nghiệm lặp tâm, với hàm mục tiêu thể tích khí tổng thể tích mơi trường ni cấy Các thí nghiệm cho nghiên cứu tối ưu tiến hành với thể tích dịch mơi trường 150 ml bình ni tích 150 ml điều kiện kị khí, nhiệt độ 55oC với tỷ lệ tiếp giống (giống ñang pha sinh trưởng) 10% (v/v), tuổi giống ñang pha sinh trưởng Xử lý số liệu Xử lí số liệu thực nghiệm phần mềm thống kê Design-Expert 7.1 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA) để phân tích hệ số hồi qui, bề mặt đáp ứng tối ưu hóa với thuật tốn hàm mong đợi KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Chọn miền khảo sát Khi nghiên cứu điều kiện mơi trường phù hợp cho tạo khí hydro chủng Thermoanaerobacterium aciditolerans Trau DAt cho thấy, trình phụ thuộc vào nhiều yếu tố tỷ lệ tiếp giống, nguồn cacbon, nguồn nitơ, hàm lượng FeSO4.7H2O, pH Trong đó, ba yếu tố glucose, cao nấm men sắt ảnh hưởng mạnh đến khả sinh khí chủng Trau DAt (kết chưa cơng bố) Vì vậy, nghiên cứu này, chọn miền khảo sát ba yếu tố để tiến hành tối ưu điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn Trau DAt sau: glucose 8-12 g/l, cao nấm men 2,5-3,5 g/l, FeSO4.7H2O 400600 mg/l với hàm mục tiêu thể tích khí tạo thể tích dịch ni cấy Mối tương quan giá trị mã hóa giá trị thực bảng phương trình (1) Bảng Giá trị mã hóa giá trị thực nghiệm yếu tố thực nghiệm Biến số Ký hiệu Đơn vị Ký hiệu giá trị mã hóa -1 +1 Glucose (A) X1 g/l 10 12 Cao nấm men (B) X2 g/l 2,5 3,5 FeSO4.7H2O (C) X3 mg/l 400 500 600 xi=(Xi-Xo)/∆Xi (1) Trong đó, xi giá trị mã hóa yếu tố biến thiên thứ i, Xi giá trị thật yếu tố thứ i, Xo giá trị thật Xi ñiểm trung tâm, ∆Xi bước nhảy Thiết lập mơ hình Giá trị mã hóa, kết thiết kế với ma trận kế hoạch thực nghiệm trình bày bảng 470 Bảng gồm 20 thí nghiệm tương ứng 20 giá trị khác ba yếu tố glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O thể tích khí thu TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(4): 469-476 tương ứng với giá trị ba yếu tố Ảnh hưởng yếu tố glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O tương tác yếu tố ñến hàm mục tiêu (thể tích khí thu được) tiến hành xây dựng hàm hồi qui bậc cho hàm mục tiêu (thể tích khí chủng Trau DAt tạo thành) sau: Yi=βo + ∑ki=0 βixi + ∑ βiixi^2 + ∑ βijxixj (1) Trong đó, Yi hàm mục tiêu, βo hệ số tự do, βi, βii, βij vectơ tham số mơ hình xác định qua thực nghiệm Mơ hình thống kê có ý nghĩa ñược sử dụng sau thỏa mãn tiêu chuẩn thống kê (Fisher) Bảng Ma trận thực nghiệm với yếu tố glucose, cao nấm men, FeSO4.7H2O kết thí nghiệm Glucose Cao nấm men FeSO4.7H2O Thể tích Ký hiệu khí* Nồng độ Ký hiệu Nồng ñộ Ký hiệu Nồng ñộ STT mức (ml/150ml Glucose mức tiến cao nấm mức tiến FeSO4.7H2O tiến dịch nuôi) (g/l) hành men (g/l) hành (mg/l) hành 6,64 -1 3,00 500,00 71,00 10,00 3,00 500,00 90,00 8,00 -1 2,50 -1 400,00 -1 65,68 8,00 -1 3,50 +1 400,00 -1 68,98 10,00 3,00 500,00 90,00 8,00 -1 3,50 +1 600,00 +1 80,00 12,00 +1 2,50 -1 600,00 +1 86,60 10,00 3,00 500,00 90,00 10,00 3,84 +1 500,00 89,00 10 10,00 3,00 331,82 -1 54,90 11 12,00 +1 3,50 +1 600,00 +1 88,60 12 10,00 3,00 500,00 90,05 13 8,00 -1 2,50 -1 600,00 +1 71,08 14 10,00 3,00 668,18 +1 73,00 15 13,36 +1 3,00 500,00 88,42 16 10,00 2,15 -1 500,00 85,00 17 12,00 +1 3,50 +1 400,00 -1 74,00 18 10,00 3,00 500,00 91,00 19 10,00 3,00 500,00 90,05 20 12,00 2,50 -1 400,00 -1 75,55 Phân tích có nghĩa mơ hình với thực nghiệm Phân tích phù hợp mơ hình có nghĩa mơ hình đánh giá qua phân tích phần ANOVA (bảng 3) số tương quan (bảng 4) Sự có nghĩa hệ số hồi qui kiểm ñịnh chuẩn F, với giá trị p< 0,05 cho biết hệ số hồi qui có nghĩa Như vậy, bảng cho thấy giá trị “Model-F-value” 994,2388 mơ hình hồn tồn có ý nghĩa thống kê với ñộ tin cậy 99,99% (p