BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN CĨ HOẠT TÍNH KEO TỤ SINH HỌC TỪ CÁC AO NUÔI TÔM TẠI TỈNH TRÀ VINH Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS PHẠM MINH NHỰT Sinh viên thực : VÕ LAN HƯƠNG MSSV : 1411100330 Lớp : 14DSH03 TP Hồ Chí Minh, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học ThS Phạm Minh Nhựt Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa công bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, luận văn sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung luận văn Trường đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh khơng liên quan đến vi phạm tác quyền, quyền gây q trình thực (nếu có) Sinh viên Võ Lan Hương LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành báo cáo này, trước tiên em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học Ban Chủ nhiệm Viện Khoa học ứng dụng HUTECH lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào học tập Trường năm qua Bên cạnh đó, để hoàn thành báo cáo này, em xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Minh Nhựt bên cạnh em, cảm ơn thầy tận tình dạy em, cho em thêm động lực niềm tin để phấn đấu hoàn thành tốt đề tài Em xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn làm cơng tác nghiên cứu Phòng thí nghiệm Viện Khoa học Ứng dụng HUTECH giúp đỡ em nhiệt tình suốt trình thực tập trung tâm Cuối em xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, người thân bạn bè em, quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn q trình thực tập hồn thành báo cáo thật tốt Trong q trình hồn thiện báo cáo khơng tránh khỏi thiếu xót định mà em chưa thể khắc phục nên em mong nhận góp ý q thầy để đề tài hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn Sinh viên Võ Lan Hương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BÀNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu ngành nuôi trồng thủy sản 1.2 Khó khăn ngành ni trồng thủy sản 1.2.1 Ảnh hưởng dịch bệnh 1.2.1.1 Bệnh virus 1.2.1.2 Bệnh vi khuẩn 1.2.2 Ảnh hưởng môi trường nước 1.2.2.1 Ô nhiễm từ nguồn nitơ 1.2.2.2 Ô nhiễm từ lớp bùn hình thành 1.2.2.3 Ơ nhiễm từ mơi trường tự nhiên 1.2.2.4 Một số nguyên nhân khác 1.3 Vai trò chế phẩm vi sinh nuôi trồng thủy sản 1.3.1 Khái niệm 1.3.2 Thành phần 10 1.3.2.1 Vi khuẩn Gram dương 10 1.3.2.2 Vi khuẩn Gram âm 10 1.3.2.3 Nấm men 10 1.3.3 Vai trò 10 1.3.3.1 Cạnh tranh vị trí gắn kết 10 1.3.3.2 Sản xuất chất ức chế 10 1.3.3.3 Cạnh tranh nguồn lượng 11 1.3.3.4 Tăng cường hấp thu dinh dưỡng 11 1.3.3.5 Ảnh hưởng đến hệ thống nước xanh 11 1.3.3.6 Nâng cao đáp ứng miễn dịch 11 i 1.3.4 Ứng dụng chế phẩm vi sinh sử lý nước 12 1.4 Vi khuẩn keo tụ sinh hoạt vai trò ni trồng thủy sản .12 1.4.1 Khái niệm keo tụ sinh hoạt 12 1.4.2 Giai đoạn hình thành 12 1.4.3 Vi khuẩn sản xuất keo tụ sinh học 12 CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 2.1.1 Thời gian 14 2.1.2 Địa điểm thu mẫu 14 2.1.3 Địa điểm tiến hành nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu 14 2.2.1 Mẫu 14 2.2.2 Hố chất mơi trường 14 2.2.2.1 Hóa chất 14 2.2.2.2 Môi trường 15 2.3 Dụng cụ thiết bị 15 2.3.1 Dụng cụ 15 2.3.2 Thiết bị 15 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Phương pháp thu mẫu xử lý mẫu 16 2.4.2 Phương pháp phân lập 16 2.4.3 Phương pháp nhuộm Gram 18 2.4.4 Phương pháp nhuộm bào tử 18 2.4.5 Phương pháp bảo quản giữ giống vi sinh vật 20 2.4.5.1 Phương pháp cấy chuyển vi sinh vật 20 2.4.5.2 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 20 2.4.6 Phương pháp tăng sinh, xác định mật độ tế bào vi sinh vật 20 2.4.7 Phương pháp đánh giá hoạt tính keo tụ sinh học 21 2.4.8 Phương pháp định danh 21 ii 2.4.8.1 Định danh phản ứng sinh hóa 21 2.4.8.2 Định danh sinh học phân tử 31 2.4.9 Phương pháp xử lý số liệu 31 2.5 Bố trí thí nghiệm 31 2.5.1 Sơ đồ thí nghiệm 31 2.5.2 Quy trình phân lập 31 2.5.3 Sàn lọc hoạt tính keo tụ sinh học chủng sau định danh sơ .32 2.5.4 Định danh chủng vi khuẩn sau sàng lọc 32 2.5.4.1 Định danh phản ứng sinh hóa 32 2.5.4.2 Định danh sinh học phân tử 33 2.5.5 Bước đầu khảo sát quy trình thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ vi khuẩn 34 2.5.5.1 Sơ đồ quy trình thu hồi 34 2.5.5.2 Thuyết minh quy trình 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu nước ao nuôi 36 3.2 Kết sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập có hoạt tính keo tụ sinh học 43 3.3 Kết định danh chủng 9.4 45 3.3.1 Định danh thử nghiệm sinh hóa 45 3.3.2 Kết định danh chủng 9.4 phương pháp giải trình tự rDNA 16S 46 3.4 Kết bước đầu tách triết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 53 iii PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỈ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 55 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỪ GENE 61 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TSA : Tryptic Soya Agar TSB : Trypto-casein soy broth COD : Chemical Oxygen Demand DO : Dessolved Oxygen BOD : Biochemical oxygen Demand TSS : Turbidity & suspendid solids DNA : Deoxyribonucleic acid PCR : Polymerase Chain Reaction NCBI : National Center for Biotechnology Information SAS : Statistical Analysis Systems RNA : Ribonucleic acid v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu nước ao nuôi 46 Bảng 3.4: Kết định danh sinh hóa chủng vi khuẩn 9.4 55 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mẫu lấy từ ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh 26 Hình 2.2: Mẫu để lắng bình chiết lê 27 Hình 2.3: Thử nghiệm Catalase 31 Hình 2.4: Thử nghiệm Voges Proskauer 32 Hình 2.5: Thử nghiệm khả thủy phân tinh bột 33 Hình 2.6: Thử nghiệm TSI 35 Hình 2.7: Thử nghiệm Citrate 36 Hình 2.8: Thử nghiệm thủy phân Casein 37 Hình 2.9: Thử nghiệm Nitrate 39 Hình 2.10: Mơi trường TSB có bổ sung NaCl 40 Hình 2.11: Mơi trường TSB 500C 600C 40 Hình 2.12: Quy trình tinh chất kết tụ sinh học 44 Hình 3.1: Hoạt tính keo tụ sinh học 22 chủng vi khuẩn phân lập 28 Hình 3.2: Kết định danh chủng 9.4 phương pháp giải trình tự rDNA .31 Hình 3.3: Kết tách chiết hoạt tính keo tụ sinh học từ chủng 9.4 32 vii 57 chủng vi khuẩn Trong 57 chủng vi khuẩn có 39 chủng vi khuẩn Gram dương 18 chủng vi khuẩn Gram âm từ 39 chủng vi khuẩn Gram dương 22 chủng vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử chọn để khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học nhằm mục đích chọn chủng có hoạt tính keo tụ sinh học cao Sau sàng lọc chủng vi khuẩn phân lập chủng 9.4 cho tỷ lệ keo tụ tốt (75,83%) đồng thời qua bước định danh thử nghiệm sinh hóa phương pháp giải trình tự rDNA 16S, chúng tơi xác định chủng 9.4 chủng vi khuẩn Bacillus subtilis Với kết đạt chủng vi khuẩn 9.4 hứa hẹn mở hướng giải khó khăn mà ngành ni trồng thủy sản nước ta gặp phải mà thúc đẩy phát triển kinh tế ngành nuôi trồng thủy sản Trà Vinh nói riêng Việt Nam nói chung 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.1 Kết luận Từ 13 mẫu nước ao Hòa Minh, xã Long Hưng 1, huyện Châu Thành, thành phố Trà Vinh thu kết sau: − Phân lập 57 chủng vi khuẩn có 22 chủng vi khuẩn Gram dương có sinh bào tử, 17 chủng vi khuẩn Gram dương không sinh bào tử 18 chủng vi khuẩn Gram âm − Tiến hành khảo sát hoạt tính keo tụ sinh học 22 chủng vi khuẩn Gram dương, có khả sinh bào tử với chất dịch kaolin cho thấy chủng MS 9.4 có tỷ lệ keo tụ cao (75,83%) − Định danh sơ định danh sinh học phân tử xác định chủng vi khuẩn Bacillus subtilis − Bước đầu thu hồi hợp chất keo tụ sinh học từ Bacillus subtilis đạt tỷ lệ 0,088% với tỷ lệ cao tụ đạt 83,56% nồng độ 20 mg/ml 4.2 Kiến nghị −Tối ưu hóa mơi trường nuôi cấy vi khuẩn Bacillus subtilis −Thiết lập thơng số cho quy trình thu hồi hợp chất keo tụ vào thực tế − Ứng dụng trình nuôi tôm quy mô nhỏ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO Desouky, A.M., Abd El-Haleem, Roda, F.A., Thourya, A., Sidra, A and Fatima, H., (2008): Isolation and characterization of extracellular bioflocculant produced by bacteria isolated from Qatari Ecosystems Polish J Microbiol 57(3): 231-239 Irianto A and Austin , 2002 Probiotics in aquaculture Journal of Fish Diseases 25 : 633 -642 Liang Luo, Zhigang Zhao, Xiaoli Huang, Xue Du, Chang’an Wang, Jinnan Li, Liansheng Wang, and Qiyou Xu, 2016 Isolation, Identification, and Optimization of Culture Conditions of a Bioflocculant-Producing Bacterium Bacillus megaterium SP1 and Its Application in Aquaculture Wastewater Treatment Moriaty D J W., 1999 Disease Control in Shrim Aquaculture with prioviotics bacteria Microbial Interactions in Aquaculture Rajkumar, M., Pandey, P.K., Aravind, R., Venilla, A., Bharti, V., and Purushothaman, C.S (2015) Effect of different biofloc system on water quality, biofloc composition and growth performance in Litopenaeus vannamei Aqua Res.1-13 Tinh N T N., Dierckens K., Sogerloos P and Bossier P., 2007 A review of the fuctionality of probitics in the laeviculture food chain Marine Biotechnology 10: – 12 Tinh N T N., Gunasekara A., Boon N., Dierckens K., Sogerloos P and Bossier P., 2007 N – acyl homoserine lactone-def grading microbial enrichment cultures isolated from Penaeus vannamei shrimp gut and their probiotic properties in Brachionus plicatilis culture FEMS Microbiol Ecol 62: 45 – 53 Viraj Krishan Mishra, Geeta Sharma, 2010 Effect of Factors on Activity of Bioflocculant Produced by Bacterial Strain Isolated from Waste Water Sample Venkat H K., Sahu N P and Jain K K., 2004 Effect of feeding Lactobacillus – based probiotics on the gut microflora, groeth and survival of postlarvae of Macrobrachium rosenbergii ( de Man ) Aquaculture Research 35 : 501 – 507 50 10 Verschuere L., Rombaut G., Sogerloos P and Verstraete W., 2000 Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture Microbiology and Molecu;ar Biology Reviews 64: 655 – 671 51 PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC MƠI TRƯỜNG DINH DƯỠNG 1.1 Thành phần mơi trường Tryptone Soya Agar (g/l) TSA (g/l) Tryptone Soy peptone 15 Sodium Chloride Agar 15 1.2 Thành phần môi trường Tryptone Soya Broth (g/l) TSB (g/l) Tryptone Soya peptone 17 Glucose 2.5 Dipotassium phosphate 2.5 1.3 Thành phần môi trường nuôi cấy (theo Deng cộng sự, 2004) Môi trường nuôi cấy (g/l) Beef extract Peptone 10 NaCl Agar 18% 52 1.4 Thành phần môi trường lên men (theo Deng cộng sự, 2004) Môi trường lên men (g/l) Glucose KH2PO4 20 K2HPO4⋅3H20 0.5 MgSO4⋅7H2O (NH4)2SO4 0.2 NaCl 0.1 Urea 0.5 Yeast extract 0.5 53 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ TỶ LỆ HOẠT TÍNH KEO TỤ XỬ LÝ BẰNG CHƯƠNG TRÌNH SAS 9.0 Kết xử lý thống kê SAS 9.1 TY LE KEO TU 21:03 Wednesday, May 26, 2018 The ANOVA Procedure 11 Class Level Information Class MS Levels 42 Values MS1.1 MS1.2 MS1.3 MS1.4 MS1.5 MS1.6 MS1.7 MS10.1 MS10.2 MS11.1 MS11.2 MS12.1 MS12.2 MS12.3 MS13.1 MS13.2 MS13.3 MS2.1 MS2.2 MS3.2 MS3.3 MS3.4 MS4.1 MS4.2 MS4.3 MS5.1 MS5.3 MS5.4 MS5.5 MS5.6 MS5.7 MS5.8 MS5.9 MS6.1 MS6.2 MS7.1 MS7.2 MS8.2 MS8.3 MS9.1 MS9.2 MS9.4 Number of Observations 126 TY LE KEO TU 21:03 Wednesday, May 26, 2018 11 The ANOVA Procedure Dependent Variable: TyLeKeoTu Source Pr>F Model F 14137.01809 344.80532 9.04