TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== VŨ LỆ GIANG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG GIẢI KHÁT TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LONGAN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Hà Nội - 2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN ===o0o=== VŨ LỆ GIANG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN TẠO ĐỒ UỐNG GIẢI KHÁT TỪ NHÃN (DIMOCARPUS LONGAN) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian hoàn thiện đề tài cố gắng nỗ lực thân em nhận giúp đỡ tận tình, quý báu tập thể cá nhân trường Đặc biệt đề tài hoàn thành quan tâm, bảo hướng dẫn tận tình PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo, cán phòng thí nghiệm vi sinh ban chủ nhiệm khoa Sinh- KTNN, ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện giúp đỡ cho em suốt thời gian làm đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người yêu thương em cho em khích lệ, động viên ln bên em suốt q trình học tập hồn thiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn ! Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh Viên Vũ Lệ Giang LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tơi viết khóa luận thật, kết làm Các số liệu bảng biểu hình ảnh tơi thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không trùng với kết tác giả công bố hướng dẫn PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Trong đề tài tơi có sử dụng số dẫn liệu tác giả khác, xin phép tác giả trích dẫn để bổ sung cho khóa luận hồn thiện Hà Nội, tháng 05 năm 2019 Sinh viên Vũ Lệ Giang DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP Adenozin triphotphat Nxb Nhà xuất MT1 Môi trường phân lập giữ giống MT2 Môi trường nhân giống MT3 Môi trường lên men STT Số thứ tự Tb Tế bào TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam Vsv Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có 100g thịt nhãn Bảng 2.2 Hệ số quan trọng tiêu 17 Bảng 2.3 Các tiêu đánh giá mức độ cảm quan nước giải khát 18 Bảng 2.4 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 19 Bảng 3.5 Đặc điểm hình thái kích thước chủng nấm men 21 Bảng 3.6 Hoạt lực lên men chủng nấm men 25 Bảng 3.7 Khả lên men nồng độ cồn khác chủng nấm men 26 Bảng 3.8 Khả đồng hóa lên men đường saccharose đường glucose chủng giống phân lập 28 Bảng 3.9 Xác định khả lên men độ pH khác 29 Bảng 3.10 Khả tạo hương thơm độ sản phẩm chủng nấm men 30 Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết tuyển chọn chủng nấm men 31 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh nhãn Hình 3.2 Chủng nấm men phân lập mơi trường thạch đĩa 22 Hình 3.3 Chủng nấm men môi trường thạch nghiêng 23 Hình 3.4 Ảnh chụp tế bào nấm men kính hiển vi điện tử (× 1000 lần) 23 Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn chiều cao cột kết lắng chủng nấm men 27 Hình 3.6 Thử hoạt tính catalaza 28 Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trưởng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae PI6 32 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Điểm đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nước giải khát lên men 1.2 Tổng quan nguyên liệu 1.2.1 Nguồn gốc, phân loại 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.3 Đặc tính mùa vụ suất 1.2.4 Thành phần dinh dưỡng 1.2.5 Ứng dụng 1.3 Hệ vi sinh vật 1.3.1 Nấm men 1.4 Lịch sử nghiên cứu vấn đề 1.4.1 Trên giới 1.4.2 Ở Việt Nam 10 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.1 Mẫu thực vật 12 2.1.2 Mẫu vi sinh vật 12 2.1.3 Dụng cụ thiết bị 12 2.1.4 Hóa chất loại mơi trường 12 2.1.5 Phạm vi nghiên cứu 13 2.1.6 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 13 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 2.2.1 Phương pháp vi sinh 13 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 17 2.2.3 Phương pháp cảm quan 17 2.2.4 Phương pháp phân tích thống kê 19 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 21 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 24 3.2.1 Đánh giá khả lên men chủng nấm men 24 3.2.2 Khả chịu cồn chủng nấm men 25 3.2.3 Thử nghiệm khả kết lắng 27 3.2.4 Thử nghiệm hoạt tính catalaza 27 3.2.5 Thử khả sử dụng đường glucozo chủng nấm men 28 3.2.6 Khả lên men độ pH khác 29 3.2.7 Khả tạo hương thơm độ sản phẩm 30 3.4 Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn 33 3.4.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ lên men nước giải khát lên men từ nhãn 33 3.4.2 Thuyết minh quy trình cơng nghệ 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài kính quan sát thấy khơng có tượng sủi bọt khí Chứng tỏ chủng nấm men vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy tiện Hình 3.6 Thử hoạt tính catalaza 3.2.5 Thử khả sử dụng đường glucozo chủng nấm men Tiến hành thí nghiệm sau 72h ni cấy môi trường Hansen lỏng điều kiện 28 C, pH = 4,5 quan sát thu kết bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả đồng hóa lên men đường saccharose đường glucose chủng giống phân lập Chủng nấm Khả đồng hóa lên men đƣờng men Saccharose Glucose PI1 Sinh bọt khí, tạo váng Sinh bọt khí, tạo váng PI2 Sinh bọt khí, tạo váng Sinh bọt khí, khơng tạo váng PI3 Sinh bọt khí, tạo váng Sinh bọt khí, tạo váng PI4 Sinh bọt khí, tạo váng Sinh bọt khí, tạo váng PI5 Sinh bọt khí mạnh, tạo váng Sinh bọt khí, khơng tạo váng PI6 Sinh bọt khí mạnh, tạo váng nhiều Sinh bọt khí, tạo váng Từ kết thí nghiệm chúng tơi có nhận xét sau: Qua bảng 3.8 nhận thấy tất chủng nấm men phân lập có khả đồng hóa lên men đường saccharose glucose Qua đánh giá khả lên men đường chúng tơi nhận thấy chủng nấm men PI6 có hoạt tính mạnh so với chủng khác 3.2.6 Khả lên men độ pH khác Một tiêu chí quan trọng tuyển chọn chủng nấm men để lên men khả lên men nấm men mơi trường có pH thấp Dịch thường có pH từ – 4,5 khơng phải chủng nấm men lên men điều kiện pH thấp Để xác định ảnh hưởng độ pH môi trường tới khả lên men chủng nấm men, tiến hành lên men chủng nấm men môi trường lên men (MT3) 28 C với độ pH biến đổi mức 2.5, 3.5, 4, 4.5, ngày, kết thu sau: Bảng 3.9 Xác định khả lên men độ pH khác pH môi trường Hoạt lực lên men tính lượng CO2 (g/100ml) PI1 PI2 PI3 PI4 PI5 PI6 2.5 2.07 2.67 1.9 2.5 2.7 2.9 3.5 3.3 3.7 4.8 4.2 3.8 4.9 5.0 5.5 5.7 5.2 6.3 6.8 4,5 5.2 5.1 6.0 6.4 6.6 6.7 3.5 4.6 4.3 4.5 4.2 5.0 Kết nghiên cứu cho thấy chủng nấm men lên men mạnh độ pH từ – 4.5, độ pH phù hợp với độ pH dịch quả, chủng PI6 có hoạt lực lên men cao Ở độ pH 3,5 hàm lượng CO2 tạo thấp độ pH thấp mơi trường axit ức chế q trình sinh trưởng tế bào nấm men Ở độ pH hàm lượng CO2 tạo thấp tế bào nấm men phát triển chậm môi trường lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hưởng đến chất lượng nước lên men Vậy độ pH thích hợp cho lên men – 4.5 chủng PI6 có hoạt lực lên men cao tất độ pH khác Kết phù hợp với nghiên cứu tác giả Nguyễn Thị Ngọc nghiên cứu số đặc tính sinh học chủng nấm men lên men vang nho (2015) 3.2.7 Khả tạo hương thơm độ sản phẩm Sau lên men ngày, tiến hành xác định khả tạo hương thơm phương pháp cảm quan Chúng thu kết bảng 3.10: Bảng 3.10 Khả tạo hương thơm độ sản phẩm chủng nấm men STT Chỉ tiêu Mẫu đánh giá Độ PI1 PI2 PI3 PI4 PI5 PI6 Ít Khơng Ít Ít Ít Trong Ít thơm Ít thơm Thơm Thơm Hương Ít thơm Ít thơm thơm Kết phân tích cho thấy, hai chủng nấm men PI5, PI6 đạt hương thơm độ tốt PI1, PI2, PI3, PI4 Tổng hợp kết nghiên cứu chủng nấm men thu kết sau: Bảng 3.11 Bảng tổng hợp kết tuyển chọn chủng nấm men STT Chỉ tiêu đánh giá Chủng PI1 PI2 PI3 PI4 PI5 PI6 + + + + + + - - - + + + + + + + + + - - - - - + Khả lên men Khả chịu nồng độ cồn cao Khả kết lắng Khả tạo hương thơm độ sản phẩm Ghi chú: + Kết dương tính - Kết âm tính Tổng hợp kết nghiên cứu mẫu nấm men chúng tơi nhận thấy mẫu nấm men PI6 có khuẩn lạc tròn, màu trắng nhẵn bóng, mép khơng rắng cưa, tế bào có dạng hình trứng sinh sản nảy chồi nhiều phía đạt tiêu đưa mức cao nhất: có hoạt lực lên men cao, khả chịu nồng độ cồn cao, khả lên men độ pH – 4,5 tạo sản phẩm có nhiều ưu điểm Vì chúng tơi định chọn chủng nấm men Saccharomyces cereviae PI6 cho nghiên cứu 3.3 Nghiên cứu động thái lên men chủng Saccharomyces cereviae PI6 Trong trình sản xuất nước giải khát, giai đoạn nhân giống chiếm thời gian ngắn 24 – 48h lại có vai trò vơ quan trọng q trình nhân nhanh số lượng tế bào nấm men Việc nghiên cứu động thái sinh trưởng, phát triển chủng Saccharomyces cerevisiae phần khơng thể thiếu q trình sản xuất nước giải khát Để xác định động thái sinh trưởng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae, tiến hành cấy giống vào môi trường nhân giống với số lượng tế bào ban đầu 3,5 × 10 tế bào/ml Sau khoảng thời gian định sẵn, tiến hành đếm số lượng tế bào dịch nuôi cấy sau 12h kiểm tra lại lần Kết thu hình 3.7: 140 số lượng tế bào x106 120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Thời gian (h) Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn động thái sinh trưởng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae PI6 Qua trình nghiên cứu động thái phát triển chủng nấm men PI6 thấy phát triển tuân theo quy luật pha bao gồm pha tiềm phát, pha log, pha cân pha suy vong Pha tiềm phát: từ – 12h, giai đoạn tế bào vừa bắt đầu thích nghi với mơi trường, kích thước tế bào tăng dần lên, tế bào nấm men phát triển chậm Pha log từ 12h – 48h, tế bào nấm men phát triển nhanh lượng vật chất tích lũy pha tiềm phát Pha cân 48h – 60h số lượng tế bào nấm men không tăng Pha suy vong: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm nhanh nấm men bị chết nhiều Kết nghiên cứu phù hợp với kết Đinh Thị Kim Nhung (2007) Đối với chủng nấm men PI6 48 số lượng tế bào đạt cực đại sau giảm dần Vậy chuyển chủng nấm men sang mơi trường lên men chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae PI6 thu sinh khối thời điểm 48 số lượng tế bào đạt cực đại 3.4 Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn 3.4.1 Sơ đồ quy trình cơng nghệ lên men nước giải khát lên men từ nhãn Nấm men Thu nhãn, tách hạt Ép dịch từ thịt nhãn Môi trường nhân giống Giống Bổ sung đường theo tỉ lệ 1:1 Dịch siro nhãn Môi trường lên men Lên men Xử lý sau lên men Lọc Đóng chai Thanh trùng, làm nguội Sản phẩm 3.4.2 Thuyết minh quy trình cơng nghệ - Ngun liệu Ngun liệu dùng để sản xuất nước giải khát nhãn (Democarpus longan) Chất lượng nguyên liệu có ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng sản phẩm trước tiến hành sơ chế cần loại bỏ hết thối nát, dập hỏng bị sâu bọ non trước Quả chọn đem loại bỏ vỏ hạt, lấy phần thịt nhãn cho vào bình Xay nhuyễn phần thịt nhãn máy, dùng giấy lọc, lọc bỏ phần cặn lấy nước nhãn Sau cho nhãn vào nồi bổ sung đường theo tỉ lệ 1:1 (500ml nước nhãn : 500g đường) đun sôi Sau đun sôi ta để nguội ta thu dịch siro nước nhãn Cho dịch vào bình đậy kín bảo quản tủ lạnh - Mơi trường lên men Môi trường lên men dịch nhãn bổ sung thêm nước theo tỉ lệ 200ml dịch nhãn: 1000ml nước - Thanh trùng o Thanh trùng môi trường lên men điều kiện nhiệt độ 110 C 30 phút để diệt khuẩn tạo điều kiện cho q trình hòa tan chất dùng điều chỉnh thành phần vào dịch lên men - Lên men Sau trùng dịch ép làm nguội cho lên men Dịch ép lên men bình tam giác 250ml, thực lên men yếm khí ngày - Xử lý sau lên men Sau kết thúc lên men nước giải khát lắng gạn sau lọc o vải lọc Rồi lại đem trùng 100 C để đình trình lên men tiêu diệt vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic Tiếp đến đem sản phẩm chiết chai, đóng nắp bảo quản sử dụng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Phân lập nấm men môi trường Haxen, dựa vào hình thái, màu sắc kích thước khuẩn lạc đặc tính sinh học nấm men chúng tơi sơ tuyển chủng nấm men; tuyển chọn chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae PI6 lên men tạo sản phẩm nước giải khát thơm, ngon, đặc trưng phù hợp với mục đích nghiên cứu 1.2 Đã nghiên cứu động thái sinh trưởng chủng nấm men tuyển chọn Saccharomyces cerevisiae PI6 Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae PI6 sinh trưởng mạnh 48h sau đưa vào mơi trường nhân giống Kiến nghị Vì điều kiện thời gian khả có hạn nên nhiều vấn đề chưa thực được, chúng tơi đề nghị tiếp tục tuyển chọn chủng nấm men khiết, có hiệu suất lên men cao, cho sản phẩm thơm ngon bổ dưỡng TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt [1] Đỗ Bá Dương ( 2011), “Phân lập chủng nấm men có ý nghĩa sản xuất rượu cần”, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Đà Lạt [2] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2010), “Vi sinh vật học”, Nxb Giáo dục [3] Nguyễn Lân Dũng (1976), “Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học”, tập 1- 2- 3, Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội [4] Nguyễn Thành Đạt (1999), “Cơ sở vi sinh vật”, Nxb Giáo dục [5] Vũ Thị Minh Đức (2001), “Thực tập vi sinh vật”, Nxb ĐHQG Hà Nội, tr.1- 50 [6] Lâm Thị Hồng Liên (2013), “Nghiên cứu số chủng nấm men lên men Kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang”, Luận văn Thạc sĩ sinh học, Đại học sư phạm Hà Nội [7] Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), “Thực hành vsv học”, Nxb Đại học Sư phạm Hà nội [8] Đinh Thị Kim Nhung (2007), “Ảnh hưởng số yếu tố tới trình lên men vang táo mèo (Docynia indica)”, Tạp chí khoa học cơng nghệ, tr.87-92 [9] Lê Văn Nhương, Nguyễn Văn Cách (2009), “Cơ sở công nghệ sinh học tập 4”, Nxb Giáo dục ( tr.91- 92- 93- 94- 95) [10] Đặng Hừng Thắng (1999), “Thống kê ứng dụng”, Nxb Giáo dục [11] Đinh Thị Tuyết (2015), “Tuyển chọn vi sinh vật có khả lên men kombucha từ chè Ngọc Thanh”, Khóa luận tốt nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội [12] Hà Duyên Tư (2006), “Kỹ thuật phân tích đánh giá cảm quan thực phẩm”, Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội [13] Trần Linh Thước (2006), “Phương pháp phân tích vi sinh vật”, Nxb giáo dục, tr 1-29, 40- 69 Tài liệu Tiếng Anh [14] Amerine.M.A, and Cruss.M.V (1960), “The teachnology of wine making”, The Avi Publishing Company, Inc, pp.144 - 150, 136 - 203 Tài liệu mạng [15] http://doan.edu.vn/-nghien-cuu-san-xuat-nuoc-uong-va-mut-4953/ [16] https://www.2lua.vn/article/khai-quat-chung-ve-cay-nhan-6769.html [17] http://www.kombuchacultures.com/kombucha.html [18] http://123doc.vn/document/208029-cnsx-kombucha-tra-giam.htm [19] http://www.dainong.com/kien_thuc_nha_nong/articletype/articlev iew/articleid/8562/trong-va-cham-soc-cay-nhan PHỤ LỤC Hình 3.8 Hình thái tế bào học chủng nấm men Saccharomyces cereviae PI6 Hình 3.9 Kích thước khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cereviae PI6 thạch đĩa Bảng 3.12 Quá trình sinh trưởng chủng nấm men PI6 Thời gian SLTB × 10 TB/ML δ 3,5 ± 0,008 0,005 12 33 ± 0,1 0,03 24 47 ± 1,1 0,001 36 84 ± 2,3 0,035 48 123 ± 4,5 0,064 60 90 ± 4,5 0,064 72 62± 2,4 0.042 39 ... Phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 3.2 Tuyển. .. 21 3.1 Phân lập chủng vi sinh vật có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 21 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn ... nhãn 3.2 Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả lên men tạo sản phẩm đồ uống giải khát từ nhãn 3.3 Nghiên cứu động thái lên men chủng tuyển chọn 3.4 Lên men tạo đồ uống giải khát từ nhãn Ý nghĩa khoa