Bài KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC MỤC TIÊU Giải thích nguyên tắc số phương pháp sinh học dùng kiểm nghiệm thuốc Viết dự thảo qui trình kiểm nghiệm thuốc phương pháp sinh học: thử độc tính bất thường, thử chất gây sốt, thử vô khuẩn, thử giới hạn nhiễm khuẩn, định lượng kháng sinh Áp dụng qui trình kiểm nghiệm thuốc phương pháp sinh học Dược điển Việt Nam kiểm tra chất lượng thuốc NỘI DUNG ĐẠI CƯƠNG Trong ngành Dược sử dụng nhiều phương pháp khác để kiểm tra chất lượng thuốc: phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp hoá lý… Các phương pháp phân tích hố học, hố lý, vật lý…tiến hành nhanh, xác áp dụng với thuốc có thành phần hố học biết Một số thuốc có yêu cầu kiểm tra hiệu lực tác dụng đặc tính riêng biệt như: hiệu lực độ an tồn vaccin, độc tính bất thường thuốc từ dược liệu, yếu tố gây sốt số loại thuốc… tiêu chuẩn xác định phương pháp hoá học hay hoá lý mà phải dùng phương pháp sinh học 1.1 Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phương pháp sinh học dựa nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng đặc tính riêng chất thử với chất chuẩn tương ứng điều kiện thời gian thí nghiệm Hai loại thử nghiệm áp dụng nhiều kiểm nghiệm thuốc là: - Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật - Kiểm nghiệm thuốc thử nghiệm vi sinh vật 1.2 Chất chuẩn Trong thử nghiệm sinh học chất chuẩn yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng mẫu thử Chất chuẩn chia làm loại: - Chất chuẩn gốc: Là chất đồng có độ tinh khiết cao Chất chuẩn gốc thường sản xuất Viện nghiên cứu quốc gia quốc tế riêng chất chuẩn sinh học - Chất chuẩn thứ cấp: Cũng chất có độ tinh khiết cao, có hoạt tính sinh học xác định theo chất chuẩn gốc quốc tế tương ứng Chất chuẩn phải bảo quản ống thuỷ tinh nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường nhiệt độ Fcrit xác suất P = 0,05 hay có ý nghĩa Fcal > Fcrit xác suất P = 0,01 Bảng 3.2.3.-V – Tính sai số dư Tổng bình phương Nguồn gây sai Bậc tự số (f) Ngẫu nhiên hoàn toàn Ngẫu nhiên theo khối Giữa xử lý k–1 S12  S 22   Z d2  K n S12  S 22   Z d2  K n S12  S 22   Z d2  K n n–1 - R12  R22   Rn2  K k R12  R22   Rn2  K k n–1 - - C12  C22   Cn2  K k Hiệu số * * * N–1  y2  K  y2  K  y2  K Giữa khối (hàng) Giữa khối (cột) Sai số dư Sai số toàn phần Chế phẩm  S U  K 78,026 18 184 Hình vng Latin Hồi qui tuyến tính = Khơng song song = Độ cong =  LS  LU  24 21.004,167 E L2S  LU2  E 2,666 12 QS2  QU2 32  12  0,278 6n 36 Giữa xử lý = Giữa khối = S12  S 22  S32  U12  U 22  U 32  K 21.085,137 R12  R22  R32  R42  R52  R62  K 75,805 Toàn phần =  y  K 21.188,97 Sai số dư = Toàn phần – Giữa xử lý – Giữa khối = 28,03 Bảng 3.2.8.2.-IV – Phân tích phương sai Nguồn gây sai số Bậc tự Tổng bình Bình phương trung bình 78,03 Tỷ số F Xác suất Chế phẩm phương 78,03 Hồi qui tuyến tính 21.004,17 21.004,17 18.737 < 0,01 Không song song 2,67 2,67 2,4 > 0,05 Độ cong 0,28 0,16 0,1 > 0,05 Giữa xử lý 21.085,14 Giữa khối (hộp 75,80 15,16 13,5 < 0,01 Sai số dư 25 28,03 1,121 Sai số toàn phần 35 21.188,97 Petri) Kết phân tích phương sai cho thấy khác có ý nghĩa (P < 0,01) kích thước đường kính vòng vơ khuẩn hộp Petri Nếu thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hồn tồn, sai số khối khơng tách khỏi sai số tồn phần, sai số dư s2 lớn hơn, dẫn đến khoảng tin cậy rộng Đây ưu điểm bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên theo khối so với bố trí thí nghiệm kiểu ngẫu nhiên hồn tồn Kiểm tra giá trị định lượng Hồi qui tuyến tính có ý nghĩa (P < 0,01), đại lượng không song song độ cong khơng có ý nghĩa (P > 0,05), định lượng có giá trị thống kê Tính hoạt lực giới hạn tin cậy U  S  53 yU  yS   3n 18 185 Tỷ lệ nồng độ 2,0, đó: I ln 2 0,69315 Với P = 0,95 f = 25, t = 2,06 (Bảng 5.1) b LS  LU 710  42,6797 Inh 24 I M  yU  yS  0,0690 b M M  ln AU   0,0690  ln1.500 7,2442 Hoạt lực chế phẩm U R = antiln(M) = 1.400 IU/ml C E 21.004,17  1,0002 2 E s t 21.004,17  1,1212,06 H E 21.004,17  0,640605 b dn (42,6797) 3 6  C  1CM 2  H  1,0002  11,0002   0,0690   0,640605 0,00026 Các ln(giới hạn tin cậy) bằng: ln  AU   CM   0,00026 ln1.500   1,0002   0,0690   0,00026 7,2442 0,0160 Các giới hạn tin cậy 1.378 1.423 IU/ml Nếu phân tích máy tính, kết là: C 1,000227  C  1CM 2  H  0,00029128 Khoảng tin cậy: 1.376,3 – 1.424,1 IU/ml Phương pháp đo độ đục Pha dung dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử Dung dịch dịch thử nghiệm chuẩn mẫu thử pha dung mơi thích hợp pha loãng dung dịch đệm phosphat có pH thích hợp cho từng kháng sinh theo dẫn bảng Để đảm bảo giá trị hiệu lực phép thử, làm thử nghiệm liều thích hợp Pha song song độ hồ lỗng gồm liều chuẩn (S1, S2, S3) liều thử (U1, U2, U3) Chế tạo canh thang để cấy truyền Để có độ đục thích hợp dùng dịch cấy truyền, pha dịch cấy truyền mô tả phần chế tạo nhũ dịch cấy truyền dùng Chủng thị điều kiện thử nghiệm từng kháng sinh sử dụng phương pháp Tiến hành Các ống nghiệm xếp thành từng nhóm, nhóm - ống, thêm vào ống ml dung dịch từng độ pha loãng dung dịch chuẩn mẫu thử Đặt ống nghiệm vào giá ống nghiệm theo quy tắc ngẫu nhiên theo khối 186 theo hình vng latinh Trong giá có ống dùng kiểm tra khơng thêm kháng sinh, ống chứa ml dịch pha lỗng, ống chứa ml dịch pha loãng 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) Thêm vào ống ml canh thang cấy truyền Đặt giá chuẩn bị xong vào tủ ấm cách thuỷ, giữ nhiệt độ thích hợp, khống chế nhiệt độ mức sai số  0,50C so với nhiệt độ cần ủ (theo bảng 2) - Sau ủ, làm ngừng phát triển vi khuẩn cách thêm vào ống 0,5 ml dung dịch formaldehyd 12% (tt/tt) trừ ống kiểm tra thêm formaldehyd 12% trước nhúng giá có ống nghiệm ủ vào nước sôi Lấy từng giá ống nghiệm khỏi nơi ủ, xác định độ truyền qua độ hấp thụ dung dịch máy đo quang 530 nm Đánh giá hoạt lực: Kiểm tra tính có giá trị định lượng, tính hoạt lực giới hạn tin cậy hoạt lực kháng sinh theo phụ lục 13.10 Phương pháp đường chuẩn Hoà tan lượng cân xác chất đối chiếu chất chuẩn sinh học kháng sinh cho dung mơi thích hợp, phải làm khơ trước Pha lỗng với dung mơi qui định để dãy chuẩn có nồng độ Tỷ lệ tăng nông độ nên 1: 1,25 (xem hướng dẫn bảng 2) Tiến hành Khi tiến hành xây dựng đường chuẩn, khảo sát 12 hộp Petri Khi xác định hàm lượng kháng sinh dùng hộp Petri Đổ vào hộp Petri 21 ml môi trường đun chảy, đợi thạch đông cứng lại tạo thành lớp có độ dày đồng bề mặt phẳng để làm (Riêng với amphotericin B, nystatin khơng dùng lớp nền) Đối với bleomycin, cycloserin, mithramycin mytomycin dùng 10 ml làm lớp Lớp nuôi cấy dùng ml cho hộp, đổ láng sau lớp đông cứng, đặt lên mặt thạch đĩa ống trụ thép không rỉ ống chất liệu khác quy định phần dụng cụ Các ống trụ tạo thành hình lục giác cách tâm khoảng 2,8 cm Chia 12 hộp Petri để xây dựng đường chuẩn thành nhóm, nhóm hộp Dung dịch có nồng độ trung gian lấy làm nồng độ kiểm tra dùng hiệu chỉnh giá trị đo nhóm Đổ đầy dung dịch kiểm tra vào ống trụ, bố trí xen kẽ hộp Petri Các ống trụ lại đổ đầy dung dịch có nồng độ nhóm Sau ủ hộp nhiệt độ thích hợp 32 - 35 0C (theo dẫn bảng 2) khoảng 16 - 18 đo giá trị đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra theo nhóm Tổng số nhóm đo 36 giá trị đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra Độ xác kết đo  0,1 mm Cách tính Giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ a, b, d, e; giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm hộp (9 kết quả) Ca, Cb, Cd, Ce giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra tất 12 hộp (ký hiệu C), gồm 36 kết 187 So sánh giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm với giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra 12 hộp(C) Hiệu chúng (C - C a; v v ) số hiệu chỉnh dùng để điều chỉnh giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm Cộng đại số giá trị hiệu chỉnh đạt vào giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm ta giá trị trung bình đường kính vòng vô khuẩn hiệu chỉnh nồng độ a, b, d, e Thí dụ: Giá trị trung bình đường kính 36 vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra tính 19,2 mm; giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ kiểm tra nhóm nồng độ a Ca = 19,0 mm Số hiệu chỉnh 19,2 - 19,0 = 0,2 mm Giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm 17,9 mm Vậy giá trị trung bình đường kính vòng vơ khuẩn nồng độ nhóm sau hiệu chỉnh a = 17,9 + 0,2 = 18,1 mm Trên hai chu kỳ giấy bán logarit vẽ đường chuẩn qua điểm giá trị trung bình hiệu chỉnh Trên trục tung (chia theo thang logarit) lấy nồng độ kháng sinh àg đơn vị hoạt lực ml Trên trục hoành (chia theo thang số học) lấy giá trị đường kính vòng ức chế Như đường chuẩn vẽ qua điểm tương ứng với giá trị đường kính vòng ức chế cao thấp tính phương trình sau: Trong đó: L: Đường kính vòng vơ khuẩn tính cho nồng độ thấp đường chuẩn H: Đường kính vòng vơ khuẩn tính cho nồng độ cao đường chuẩn C: Đường kính trung bình 36 kết nồng độ kiểm tra a, b, d, e: Những giá trị đường kính trung bình hiệu chỉnh cho từng dung dịch lại xếp theo thứ tự từ nồng độ thấp tới nồng độ cao Ba hộp Petri dùng cho mẫu thử nghiệm tiến hành đồng thời xây dựng đường chuẩn Trong ba hộp nhỏ xen kẽ nồng độ trung gian dung dịch chuẩn với nồng độ mẫu thử pha lỗng với dung dịch đệm thích hợp để có nồng độ giả định tương đương nồng độ trung gian chuẩn Sau đo đường kính vòng vơ khuẩn mẫu thử, tính trung bình hiệu chỉnh theo giá trị đường kính nồng độ trung gian đường kính chế phẩm thử Trên trục hồnh ứng với giá trị đường kính vừa tìm mẫu thử, kẻ đường vng góc với trục hồnh cắt đường đường chuẩn vừa vẽ điểm từ điểm đường chuẩn hạ vng góc với trục tung tìm giá trị nồng độ ứng với đường kính mẫu thử 188 Hoạt lực chế phẩm tính phần trăm so với chuẩn theo cơng thức sau: R% = Hoạt lực tìm thấy chế phẩm  100 Hoạt lực tìm thấy nồng độ TỰ LƯỢNG GIÁ Chọn câu trả lời cách khoanh tròn vào chữ đầu câu: Câu Phép thử chất gây sốt KHÔNG ĐƯỢC áp dụng để kiểm tra chất lượng chế phẩm đây: A Thuốc tiêm truyền B Thuốc tiêm truyền tĩnh mạch C Thuốc tiêm D Thuốc tiêm tích lần ≥15ml Câu Môi trường nuôi cấy vi sinh vật phải thỏa mãn điều kiện sau NGOẠI TRỪ: A Được pha chế từ hóa chất tinh khiết B Có pH khoảng qui định C Vơ khuẩn D Đầy đủ chất dinh dưỡng Câu Phương pháp pha loãng ống nghiệm để đếm tổng số vi khuẩn sống lại thử giới hạn nhiễm khuẩn áp dụng khi: A Chế phẩm không chứa chất ức chế B Chế phẩm chứa chất ức chế C Chế phẩm hòa lẫn với dung mơi thành dung dịch đục D Chế phẩm hòa lẫn với dung mơi thành dung dịch Câu Kỹ thuật dùng màng lọc để thử vô khuẩn áp dụng A Chế phẩm có chất ức chế B Chế phẩm khơng có chất ức chế C Chất ức chế chế phẩm hòa lỗng D Chất ức chế chế phẩm bị trung hòa Câu Nhiệt độ thích hợp để ủ ống mơi trường ni cấy vi khuẩn kỵ khí phép thử Vơ khuẩn kỹ thuật nuôi cấy thực tiếp là: A 20 – 280C vòng 14 ngày B 30 – 350C vòng 14 ngày C 20 – 250C vòng ngày D 30 – 350C vòng ngày Câu Động vật sử dụng kiểm tra chất lượng thuốc phải thỏa mãn điều kiện sau NGOẠI TRỪ: A Được cung cấp từ nguồn xác định B Đồng trọng lượng, độ tuổi, giống, loài C Mắc bệnh tình trạng sinh lý khác D Được nuôi dưỡng điều kiện 189 Câu Phép thử Giới hạn nhiễm khuẩn áp dụng để kiểm tra chất lượng dạng bào chế: A Viên nén, viên nang, viên bao tan ruột B Thuốc có thành phần nguyên liệu dược liệu C Dung dịch thuốc D Siro thuốc Câu Phương pháp lựa chọn thử vơ khuẩn chế phẩm có chứa chất kháng sinh là: A Phương pháp dùng màng lọc B Phương pháp đo độ đục C Phương pháp ni cấy trực tiếp D Phương pháp hòa lỗng ống nghiệm Câu Phương pháp đĩa thạch để đếm tổng số vi khuẩn sống lại thử giới hạn nhiễm khuẩn áp dụng A Chế phẩm không chứa chất ức chế B Chế phẩm chứa chất ức chế C Chế phẩm không chứa chất ức chế hòa lẫn với dung mơi thành dung dịch đục D Chế phẩm có chứa chất ức chế hòa lẫn với dung môi thành dung dịch Câu 10 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng KT chất lượng thuốc phương pháp thử vi sinh vật phải thỏa mãn điều kiện sau NGOẠI TRỪ: A Vô khuẩn B Đầy đủ chất dinh dưỡng C Có hạn dùng vòng 30 ngày D Có pH nằm khoảng qui định Câu 11 Phép thử Giới hạn nhiễm khuẩn áp dụng để kiểm tra chất lượng dạng bào chế: A Viên nén, viên nang, viên bao tan ruột B Thuốc có thành phần nguyên liệu dược liệu C Dung dịch thuốc D Siro thuốc Câu 12 Phương pháp lựa chọn thử vô khuẩn chế phẩm không chứa chất ức chế là: A Phương pháp nuôi cấy trực tiếp B Phương pháp đo độ đục C Phương pháp dùng màng lọc D Phương pháp hòa lỗng ống nghiệm Câu 13 Trong định lượng kháng sinh phương pháp khuếch tán, khoảng cách nồng độ liều thử nghiệm phù hợp A S2 = S1 x B S2 = S1 x C S2 = S1 x 190 D S2 = S1 x Câu 14 Khi thử giới hạn nhiễm khuẩn cần thực thử nghiệm sau NGOẠI TRỪ: A Đếm tổng số vi khuẩn kỵ khí, hiếu khí sống lại B Phân lập tìm vi khuẩn điểm vệ sinh khơng phép có thuốc C Đếm tổng số nấm mốc, nấm men sống lại D Ni cấy vi khuẩn điểm vệ sinh không phép có thuốc Câu 15 Phép thử Vơ khuẩn áp dụng để kiểm tra chất lượng sản phẩm sau NGOẠI TRỪ A Thuốc tiêm B Bông, băng, gạc dùng phẫu thuật C Thuốc đặt D Thuốc cấy da 191