ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ma cy ,V NU KHOA Y DƯỢC ne an dP r NGUYỄN THỊ CHUYÊN ici BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN fM ed TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM Sc h oo lo (Salvia miltiorrhiza Bunge) Co py rig ht © KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ma cy ,V NU KHOA Y DƯỢC dP r NGUYỄN THỊ CHUYÊN an BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN ici ne TANSHINON IIA TỪ ĐAN SÂM lo fM ed (Salvia miltiorrhiza Bunge) Khóa: QH.2013.Y Người hướng dẫn: TS NGUYỄN HỮU TÙNG Co py rig ht © Sc h oo KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Hữu Tùng – giảng viên ma cy ,V NU mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc - Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ cho em suốt thời gian thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa tồn thể thầy giáo Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội nói chung thầy cô, cán dP r thuộc Bộ mơn Hóa dược Kiểm nghiệm thuốc nói riêng dạy dỗ, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian học tập Khoa thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn anh Trần Đức Bình anh chị lớp Dược an K57QH.2012.Y, đặc biệt chị Bích, chị Huệ, chị Ngần ln động viên, giúp đỡ ne cho em nhiều ý kiến giá trị q trình hồn thành khóa luận ici Em xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn Nhóm nghiên cứu ed đóng góp nhiều nhận xét bổ ích cho em q trình thực khóa luận suốt thời gian qua fM Cuối em xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên em Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Sinh viên Co py rig ht © Sc h oo lo Em xin chân thành cảm ơn! Nguyễn Thị Chuyên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Buthanol Sắc kí cột 13C-NMR DAD DĐVN IV EtOAc EtOH GC GLP HPLC Hex Phổ cộng hưởng từ hạt nhân C13 Đầu dò UV Dược điển Việt Nam IV Etyl acetat Ethanol Sắc kí khí Thực hành phịng thí nghiệm tốt Sắc ký lỏng hiệu cao Hexan dP r Phổ cộng hưởng từ proton Phổ hồng ngoại Tên hợp chất Lipoprotein tỉ trọng thấp Phổ khối Nhiệt độ nóng chảy Methanol Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Phụ lục Co py rig ht © Sc h ne ici ed fM lo oo Rf RSD SKC TLC UV-VIS UV v/v Φ an H-NMR IR IUPAC LDL MS Mp MeOH NMR PL ma cy ,V NU BuOH CC Hệ số lưu giữ Độ lệch chuẩn tương đối Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Phổ hấp thụ phân tử Tử ngoại Thể tích/thể tích Đường kính cột MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ma cy ,V NU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Tổng quan thiết lập chất chuẩn đối chiếu 1.2 Tổng quan đan sâm .4 1.2.1 Đặc điểm thực vật .4 1.2.2 Phân bố, sinh thái .5 dP r 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng sinh học 1.2.5 Tác dụng công dụng theo y học cổ truyền an 1.3 Tổng quan tanshinon IIA 10 ne 1.3.1 Cấu trúc hóa học .10 ici 1.3.2 Đặc điểm tanshinon IIA 10 ed CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 fM 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 12 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 12 lo 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 12 oo 2.1.3 Thiết bị dụng cụ dùng nghiên cứu 13 Sc h 2.2 Phương pháp nghiên cứu .13 2.2.1 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập tinh chế 13 © 2.2.2 Phương pháp thiết lập chất chuẩn đối chiếu 14 rig ht 2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 15 py 2.3 Sơ đồ nội dung nghiên cứu .16 Co 2.4 Địa điểm nghiên cứu 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Chiết xuất tinh chế tanshinon IIA từ đan sâm 18 3.1.1 Phương pháp xử lý mẫu chiết xuất 18 3.1.2 Phương pháp phân lập tinh chế 18 3.2 Xác định cấu trúc tanshinon IIA 20 ma cy ,V NU 3.2.1 Tính chất vật lý .20 3.2.2 Các phương pháp phổ: phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 20 3.2.3 Xác định cấu trúc 22 3.2.4 Đánh giá sơ độ tinh khiết 23 3.3 Thiết lập chất chuẩn đối chiếu 24 dP r 3.3.1 Xây dựng liệu nhận dạng tanshinon IIA 24 3.3.2 Đánh giá độ tinh khiết phân tích tạp chất 24 3.4 Bàn luận 28 an 3.4.1 Về phân lập xác định cấu trúc tanshinon IIA 28 ne 3.4.2 Về phân tích HPLC 28 ici KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 ed TÀI LIỆU THAM KHẢO Co py rig ht © Sc h oo lo fM PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Kết phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR tanshinon IIA 22 Bảng 3.2 Chương trình gradient 30 phút 25 Bảng 3.3 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký định lượng tanshinon IIA tinh chế 25 Bảng 3.4 Kết phân tích độ tinh khiết tanshinon IIA tinh chế 26 Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici ne an dP r ma cy ,V NU Bảng 3.1 DANH MỤC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang Cây đan sâm Hình 1.2 Cấu trúc số abietane diterpenoid Hình 1.3 Cấu trúc số acid phenolic Hình 1.4 Cấu trúc số triterpenoid có chi Salvia L Hình 1.5 Cấu trúc hóa học tanshinon IIA 10 Hình 2.1 Một số hình ảnh đan sâm huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai 12 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất, phân lập tinh chế tanshinon IIA 19 Hình 3.2 Tanshinon IIA tinh chế 20 Hình 3.3 Phổ1H-NMR (CDCl3,400MHz) và13C-NMR (CDCl3,100MHz) tanshinon IIA phân lập 21 Hình 3.4 Cấu trúc hóa học tanshinon IIA 23 Hình 3.5 Sắc ký lớp mỏng khảo sát tanshinon IIA tinh chế 23 Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC tanshinon IIA 27 dP r an ne ici ed fM lo oo Sc h © ht rig py Co ma cy ,V NU Hình 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ma cy ,V NU Đan sâm nước ta biết đến thuốc quý có nguồn gốc từ Trung Quốc trồng nhiều sinh trưởng tốt vùng Tây Bắc nước ta Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) rễ phơi khô sấy khô đan sâm, thường dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm thuốc tăng cường tuần hồn máu, chữa đau nhói ngực bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ [7,25] dP r Ở nước ta, nghiên cứu đan sâm quan tâm để phát triển ứng dụng loại dược liệu quý y học đại Nghiên cứu Viện Dược liệu cho thấy đan sâm trồng Sapa có hàm lượng tanshinon IIA cao bên cạnh số thành phần tanshinon khác [15,21] Gần đây, tác giả Nguyễn Thanh Hải an cộng công bố phân lập thêm số thành phần tanshinon [23] hai hợp chất triterpen acid ursoli acid 2β-hydroxypomolic [23] ici ne Các kết nghiên cứu hóa thực vật cho thấy đan sâm có thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester, trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA tanshinon I,….Trong đó, tanshinon IIA thành ed phần tanshinon chính, hoạt chất đan sâm dùng làm chất chuẩn đánh fM dấu đánh giá dược liệu đan sâm Cho đến thời điểm chưa có nhiều nghiên cứu chiết xuất, tinh chế tanshinon IIA làm chất chuẩn đối chiếu nước ta oo lo Nhìn chung với sản phẩm từ dược liệu nay, tiêu chuẩn sở phần lớn dựa việc định lượng hỗn hợp toàn phần cao dược liệu nhóm chất © Sc h phương pháp không đặc hiệu mà không định lượng hợp chất đặc trưng, coi hợp chất có hoạt tính sinh học thiếu chất chuẩn đối chiếu Do đó, việc thiết lập chất chuẩn đối chiếu từ dược liệu ngày trở nên cần thiết công tác đảm bảo chất lượng thuốc sản phẩm từ dược liệu, từ py rig ht giai đoạn lựa chọn nguyên liệu đầu vào, đến việc xây dựng tiêu chuẩn sở, giám sát chất lượng thuốc lưu hành quan quản lí Ở nước ta đan sâm trồng ngày nhiều tập trung Hà Giang, Lào Cai, Tam Đảo, Co Lâm Đồng, nhiên chưa thể đáp ứng nhu cầu ngày cao dược liệu có giá trị Đan sâm bán thị trường thiếu đảm bảo chất lượng bị nhầm lẫn chưa có tiêu chuẩn đánh giá thành phần hoạt chất Theo khảo sát thị trường công ty dược phẩm, phần lớn đan sâm phải nhập từ Trung Quốc nhiều dược liệu khác, vấn đề kiểm soát chất lượng cần quan tâm, kiểm soát dược liệu chất lượng tràn lan ma cy ,V NU Trên sở thực tiễn kế thừa, tiếp nối nghiên cứu trước đan sâm, bước đầu tiến hành “Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA từ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng Việt Nam” Kết đề tài góp phần cung cấp chất chuẩn tanshinon IIA dùng phân tích kiểm nghiệm dược liệu đan sâm sản phẩm chứa đan sâm Mục tiêu đề tài khóa luận: dP r Xây dựng quy trình chiết xuất, phân lập tinh chế tanshinon IIA có độ tinh khiết 95% từ rễ đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) trồng Sapa để sử dụng làm chất chuẩn đối chiếu Co py rig ht © Sc h oo lo fM ed ici ne an Xây dựng liệu nhận dạng chất xác định độ tinh khiết - Detecter DAD với bước sóng phát hiện: 270 nm Lọc qua màng lọc 0,45 µm ma cy ,V NU - Dung môi pha mẫu: methanol - Nồng độ tiêm sắc kí khoảng 0,5 mg/ml - Mẫu: Cân khoảng mg tanshinon IIA tinh chế vào cốc có mỏ, sau thêm ml methanol Dùng máy siêu âm để hịa tan tanshinon IIA methanol Bảng 3.2 Chương trình gradient 30 phút A (%) Acid formic 0,2%/nước B (% ) Acetonitril 30 70 5-15 70-100 15-20 100 20-25 100-70 25-30 70 30-0 0-30 30 ne an 0-5 dP r Thời gian (phút) ici 3.3.2.2 Đánh giá tính thích hợp hệ thống fM ed Trước tiến hành sắc ký định lượng tanshinon IIA tinh chế được, chúng tơi tiến hành xác định tính thích hợp hệ thống sắc ký bảng sau: oo lo Tiêm lần dung dịch mẫu chuẩn bị vào hệ thống HPLC tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn Ghi kết thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký thể Sc h Bảng 3.3 Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký để định lượng tanshinon IIA tinh chế Diện tích pic (mAU.min) Số đĩa lý thuyết 14,920 2620,09 59535 14,987 2610,81 59181 15,007 2625,29 60031 15,000 2623,23 59367 15,003 2628,39 59654 15,005 2623,99 59323 TB 14,987 2621,9667 59511 RSD (%) 0,20 0,21 0,51 © Thời gian lưu (phút) Co py rig ht TT 25 Nhận xét: ma cy ,V NU Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) thời gian lưu diện tích pic phép thử 0,20 0,21 nhỏ 2%, số đĩa lý thuyết trung bình 59323 thể khả tách tốt cột sắc ký Như chứng tỏ hệ thống HPLC sử dụng thích hợp để định tính, định lượng tanshinon IIA tinh chế 3.3.2.3 Xác định độ tinh khiết tạp chất Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính tốn độ tinh khiết mẫu phân dP r tích Tiến hành sắc ký lần theo chương trình mục 3.3.2.1, phân tích pic phụ (tạp chất) sắc ký đồ (Hình 3.6) Tính tổng diện tích tất pic phụ thu sắc kí đồ dung dịch mẫu, không kể pic phụ có diện tích pic nhỏ 0,025 lần diện tích pic ici ne an thu sắc kí đồ dung dịch thử So sánh tổng giá trị diện tích pic phụ với diện tích pic dung dịch mẫu, từ kết luận giới hạn tổng cộng tạp chất liên quan tanshinon IIA tinh chế Kết thể Bảng 3.4 ed Bảng 3.4 Kết phân tích độ tinh khiết tanshinon IIA tinh chế Tỷ lệ (%) 14,919 2,604 2,932 13,919 15,007 2,608 2,943 13,344 15 2,611 2,946 13,336 2620,08 51,29 16,71 24,85 2625,29 49,12 18,59 25,35 2623,23 50,03 18,36 25,14 96,58 1,89 0,62 0,92 96,58 1,81 0,68 0,93 96,56 1,84 0,68 0,93 fM Diện tích pic (mAU.s) Pic lo STT Thời gian lưu (phút) rig oo ht © Sc h Tanshinon IIA Pic phụ pic phụ pic phụ Tanshinon IIA Pic phụ Pic phụ Pic phụ Tanshinon IIA Pic phụ Pic phụ Pic phụ Co py Giới hạn tổng cộng tạp chất liên quan (%) 3,42 3,42 3,44 Nhận xét: Kết thực nghiệm cho thấy tanshinon IIA tinh chế có độ tinh khiết cao (>95%) Các pic phụ (tạp chất) tách rõ ràng khỏi pic chất Sản phẩm tanshinon IIA tinh chế nghiên cứu có giới hạn tổng cộng 26 tạp chất liên quan không 5,0 % phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn oo lo fM ed ici ne an dP r ma cy ,V NU đối chiếu Sc h Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC tanshinon IIA Thiết lập chất chuẩn tanshinon IIA tinh chế làm chất chuẩn đối chiếu: © - Cảm quan: Bột màu cam ht - Nhiệt độ nóng chảy: 202 – 204oC py rig - Phổ khối lượng ESI-MS với xuất pic ion phân tử m/z 295, M=294 trùng khớp với công thức phân tử C19H18O3 liệu công bố [21-22] Co - Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) cho thấy tín hiệu (H, ppm): ): δ 7,63 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6), 7,56 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7), 7,23 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-16), 3,19 (2H, t, J = 6,4 Hz, H-1), 2,27 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-17), 1,79 (2H, m, H-2), 1,66 (2H, m, H-3), 1,31 (6H, s, H3-18,19) - Phổ 13 C-NMR (100 Hz, CD3OD) cho thấy tín hiệu (C, ppm): δ 29,9 (C-1), 27 19,2 (C-2), 37,9 (C-3), 34,7 (C-4), 150,2 (C-5), 133,5 (C-6), 120,3 (C-7), 127,5 (C-8), 126,5 (C-9), 144,5 (C-10), 183,7 (C-11), 175,8 (C-12), 121,2 (C-13), 161,8 (C-14), 141,3 (C-15), 120,3 (C-16), 8,8 (C-17), 31,8 (C-18), 31,8 (C-19) ma cy ,V NU - Độ tinh khiết: 96,57% (>95%) - Tạp chất liên quan: 3,43% (