15.24 XÁC ĐỊNH CƠNG HIỆU THÀNH PHẦN HO GÀ TỒN TẾ BÀO TRONG VẮC XIN PHỐI HỢP, HẤP PHỤ Công hiệu vắc xin ho gà vắc xin DTP xác định cách so sánh liều hữu hiệu 50% (ED50) vắc xin mẫu chuẩn so với vắc xin mẫu thử Kết tính phương pháp Probit analysis (phần mềm WHO program) Pha vắc xin Vắc xin mẫu chuẩn Lấy ống vắc xin mẫu chuẩn, hồn ngun nước muối sinh lý vơ khuẩn tiếp tục pha loãng tuỳ theo số đơn vị ghi nhãn, dùng nước muối sinh lý pha thành độ pha loãng bậc thành độ pha cho sau thử thách ED 50 nằm độ pha lỗng, ví dụ theo sơ đồ đây: A = 1/30 = ống mẫu chuẩn + 30 ml NMSL B = 1/150 = ml A + 20 ml NMSL C = 1/750 = ml B + 20 ml NMSL Vắc xin DTP mẫu thử A = 1/5 = ml vắc xin mẫu thử + 20 ml NMSL B = 1/ 25 = ml dung dịch A + 20 ml NMSL C = 1/125 = ml dung dịch B + 20 ml NMSL Tiêm miễn dịch Chọn chuột nhắt trắng có trọng lượng 14 - 18 g, chuột thử nghiệm không chênh lệch trọng lượng 4g Dùng chuột giới, khác giới phải chia số chuột đực, vào nhóm nhốt riêng Chuột tiêm miễn dịch sau ăn uống đầy đủ Tiêm ổ bụng 0,5 ml/1 chuột Mỗi độ pha vắc xin tiêm cho nhóm chuột, số lượng chuột nhóm tuỳ theo kết thẩm định thử nghiệm khơng 20 chuột Tiêm miễn dịch theo thứ tự từ độ pha loãng (từ độ pha C đến A) cho loạt vắc xin mẫu thử mẫu chuẩn Bốn nhóm chuột đối chứng: nhóm 10 con, ni song song với nhóm chuột miễn dịch dùng để kiểm chứng độc lực chủng thử thách Trong thời gian miễn dịch (14 - 17 ngày), chuột phải khoẻ tăng trọng bình thường, 94% số chuột MD độ pha vắc xin mẫu chuẩn vắc xin thử nghiệm phải sống sót ngày thử thách Tiêm thử thách Sau 14 - 17 ngày miễn dịch, chuột thử thách với chủng B pertussis 18323 Chủng thử thách dùng chủng tươi chủng dạng huyền dịch (10 tỷ vi khuẩn ho gà) bảo quản nitơ lỏng Chủng thử thách pha dung dịch casein 1% LD 50 chủng thử thách phải nằm khoảng 100 - 1000 vi khuẩn (vk) Cách pha dung dịch casein 1% Hoà tan 10 g bột casein 1% 1000 ml nước cất lần, cho thêm 2,3 g NaCl Điều chỉnh đến pH - 7,2 dung dịch NaOH HCl loãng Hấp 121 C 30 phút Dung dịch casein 1% phải kiểm tra an toàn cách tiêm vào não cho chuột nhắt, 0,02 ml Theo dõi ngày, tồn chuột thí nghiệm phải sống Nếu có chuột chết phải pha lại dung dịch Cách pha hỗn dịch vi khuẩn để kiểm tra liều LD50 để thử thách Chủng B.pertussis 18323 cấy truyền đời đời môi trường Bordet - Gengou có chứa 15% máu cừu ngựa, huyền dịch vi khuẩn ho gà gặt từ nuôi cấy 20 – 22 dùng để pha thành hỗn dịch thử thách sử dụng huyền dịch vi khuẩn ho gà đậm độ 10 tỷ vi khuẩn/ml bảo quản nitrogen lỏng để pha dung dịch thử thách Trong pha tiêm thử thách, hỗn dịch vi khuẩn ho gà phải giữ đá lạnh Thời gian bắt đầu pha đến tiêm xong hỗn dịch vi khuẩn thử thách không 150 phút Xác định đậm độ vi khuẩn ho gà mắt thường so với ống độ đục chuẩn quốc tế 10 IOU đo OD máy quang phổ kế để tính số vi khuẩn ho gà hỗn dịch gặt Pha loãng huyền dich vi khuẩn ho gà casein 1% để có nồng độ 10 x10 vi khuẩn /ml (*) Nếu sử dụng chủng ho gà bảo quản nitơ lỏng phải làm tan băng nhanh trước thử thách Các độ pha loãng chủng ho gà pha theo sơ đồ dung dịch casein 1%: Ví dụ: Chủng B pertussis 18323 giữ nitrogen lỏng 10 10 /ml ( * ) = A0 A1 = 5.10 / ml = ml A0 + 1ml đệm Casein 1% A2 = 5.10 / ml = 1ml A1 + 1ml đệm Casein 1% A3 = 5.10 6/ 0,02 ml = 1ml A2 + ml đệm Casein 1% A4 = 5.10 / 0,02 ml = 1ml A3 + ml đệm Casein 1% A5 = 100.000/0,02 ml = ml A4 + 12 ml đệm Casein 1% A6 = 10.000/0,02 ml = 1ml A5 + m Casein 1%l đệm A7 = 2000/0,02 ml = 1ml A6 + ml đệm Casein 1% A8 = 400/0,02 ml = 1ml A7 + ml đệm Casein 1% A9 = 80/0,02 ml = 1ml A8 + ml đệm Casein 1% Tiêm chuột Sau 14-17 ngày, toàn chuột miễn dịch vắc xin mẫu chuẩn mẫu thử tiêm thử thách vào não, nhận 0,02 ml hỗn dịch chứa 100.000 vi khuẩn (độ pha A5) bơm tiêm bán tự động Hamilton Nhóm chuột đối chứng, nhóm 10 tiêm với độ pha từ A6 – A9 tương ứng với hỗn dịch chứa 10.000 vi khuẩn ; 2000 vi khuẩn ; 400 vi khuẩn 80 vi khuẩn Độ pha hỗn dịch chứa 80 vi khuẩn cấy đĩa thạch Bordet Gengou sau pha xong hỗn dịch sau kết thúc tiêm thử thách Ủ đĩa thạch 35 C - ngày, đếm số khuẩn lạc mọc Thông thường số khuẩn lạc đạt khoảng 30 % Cần lưu ý: - Trong trình pha tiêm thử thách, dung dịch chủng phải giữ đá lạnh - Thời gian tính từ bắt đầu pha chủng đến kết thúc thử nghiệm không 2,5 - Tất vật liệu chứa chủng ho gà phải tiệt trùng nồi hấp 121 0C/15-20 phút luộc sôi 30 phút trước rửa dụng cụ - Những chuột chết ngày đầu sau tiêm thử thách coi chuột chết khơng mang tính đặc hiệu ho gà Do chuột chết từ ngày thứ đến ngày 14 tính kết - Ngày thứ 14 sau thử thách: Tất chuột chết, hay có dấu hiệu liệt rõ sưng phồng tấy đầu tính chuột chết Tính kết Dựa vào số chuột sống sót nhóm chứng, dùng phương pháp Reed Muench để tính LD 50 chủng thử thách Xem ví dụ đây: Số Vi khuẩn 10 000 000(B) 400(A) 80 Số Chuột 10 10 10 10 Số Sống Số Chết Số tích lũy Sống Chết 22 13 10 Tổng số % chết 23 17 16 20 95 76(b) 37(a) 10 Theo thí dụ trên, LD50 nằm khoảng liều 2000 400 vi khuẩn, số % chuột chết tương ứng với liều sát 50% 76%, số % chuột chết tương ứng liều sát 50% 37% Tính LD50 theo công thức sau : 50 - a Log LD 50 = Log A [ ] x Log b -a Trong đó: A : Liều gây chết vừa sát 50% ( thí dụ 400 ) a :% chết tương ứng với A ( thí dụ 37% ) B - Liều gây chết vừa sát 50% ( thí dụ 2000) b :% chết tương ứng với B ( thí dụ 76% ) Thay số cụ thể là: 50 - 37 Log LD 50 = Log 400 [ ] x log 76 - 37 LD50 = 680 vi khuẩn Dùng phương pháp Probit analysis chương trình phần mềm WHO program để tính công hiệu vắc xin ho gà Thử nghiệm coi có giá trị khi: - ED50 vắc xin chuẩn ED 50 vắc xin thử nghiệm nằm độ pha loãng độ pha đặc vắc xin - Trong suốt thời gian miễn dịch ngày thử thách số chuột độ pha không chết 6% - Liều thử thách phải chứa 100 – 1000 LD50, liều LD50 phải chứa 100 - 1000 vi khuẩn - Thử nghiệm phải đạt đựơc tiêu chuẩn chương trình Probit Analysis đặt đường thẳng đường song song mối tương quan đáp ứng liều Nếu kết công hiệu thành phần ho gà vắc xin DTP hấp phụ không đạt yêu cầu, thử nghiệm phải nhắc lại: - Nếu lần không đạt yêu cầu cơng hiệu thử nghiệm khơng có giá trị (invalid test) cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu lần Kết lần thử nghiệm nhắc lại đạt yêu cầu loạt vắc xin coi đạt cơng hiệu thành phần ho gà Nếu kết khơng đạt u cầu loạt vắc xin phải bị huỷ bỏ - Nếu thử nghiệm lần không đạt yêu cầu thử nghiệm có giá trị (valid test) phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu gấp đôi Trong trường hợp loạt vắc-xin đạt yêu cầu cơng hiệu kết trung bình nhân tất thí nghiệm cơng hiệu có giá trị khơng thấp tiêu chuẩn cho phép Tiêu chuẩn chấp thuận Vắc xin đạt u cầu cơng hiệu khơng IU liều đơn vắc xin cho người giới hạn 95 % khoảng tin cậy cơng hiệu tìm khơng IU liều đơn vắc xin cho người ... tiêu chuẩn cho phép Tiêu chuẩn chấp thuận Vắc xin đạt yêu cầu cơng hiệu khơng IU liều đơn vắc xin cho người giới hạn 95 % khoảng tin cậy công hiệu tìm khơng IU liều đơn vắc xin cho người ... trình phần mềm WHO program để tính cơng hiệu vắc xin ho gà Thử nghiệm coi có giá trị khi: - ED50 vắc xin chuẩn ED 50 vắc xin thử nghiệm nằm độ pha loãng độ pha đặc vắc xin - Trong suốt thời gian... khoảng 30 % Cần lưu ý: - Trong trình pha tiêm thử thách, dung dịch chủng phải ln giữ đá lạnh - Thời gian tính từ bắt đầu pha chủng đến kết thúc thử nghiệm không 2,5 - Tất vật liệu chứa chủng ho