ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG - - PHẠM THỊ XUÂN DIỆU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY MẬT NHÂN (EURYCOMA LONGIFOLIA JACK) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, nhu cầu người nguồn dược liệu ngày tăng Cây dược liệu nguồn cung cấp thuốc chữa bệnh quan trọng cho phần lớn dân số giới [34] Theo ước tính Tổ chức Y tế Thế giới có đến 80% người dân dựa chủ yếu vào phương pháp chữa bệnh truyền thống thảo dược [34] Tuy nhiên, loài dược liệu tự nhiên bị giảm số lượng chất lượng khai thác mức; điều kiện ngày bất lợi mơi trường tự nhiên,… dẫn đến nhiều lồi dược liệu quý bị tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho người [11] Cây mật nhân (Eurycoma longifolia Jack) số loài dược liệu biết đến nhiều Đơng Nam Á đặc tính tăng cường sức khoẻ tình dục có hiệu gây độc tế bào, chống sốt rét, chống lở loét, chống thúc đẩy khối u tác nhân chống ký sinh trùng [21] Tại Việt Nam, gọi “cây bá bệnh” hay “cây mật nhân” có mặt vườn quốc gia Bái Tử Long, số rừng Tây nguyên Bộ phận dùng rễ, vỏ thân dùng để làm thuốc Tuy nhiên, lồi khó trồng, hạt giống có tỷ lệ nảy mầm thấp cần phải có thời gian dài để nảy mầm phơi trạng thái non thời điểm phát tán Mặc khác lồi biến khai thác bừa bãi rễ làm nguyên liệu cho việc sản xuất thuốc Vì vậy, lồi cần phải nhanh chóng nhân lên hàng loạt quy mơ thương mại để đáp ứng với nhu cầu ngành công nghiệp dược phẩm [21] Công nghệ sinh học công cụ quan trọng nhân giống cải thiện di truyền dược liệu cách áp dụng kỹ thuật chẳng hạn tái sinh in vitro biến đổi di truyền, khai thác để sản xuất chất trao đổi thứ cấp nhờ sử dụng thực vật lò phản ứng sinh học [34] Việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật xem phương án có triển vọng để nhân nhanh, bảo tồn phát triển nhiều nguồn gen thuốc quý Hiện nay, giới có số cơng trình nghiên cứu nuôi cấy in vitro đối tượng mật nhân [16, 21] Tuy nhiên, Việt Nam việc nhân giống loài kỹ thuật in vitro chưa có cơng trình cơng bố Xuất phát từ sở chọn đề tài: “ Nghiên cứu nhân giống in vitro mật nhân (Eurycoma longifolia Jack)” Mục đích nghiên cứu Xác định mơi trường thích hợp để tái sinh in vitro hoàn chỉnh từ hạt mật nhân làm sở cho việc nhân nhanh giống loài thuốc quý Nội dung nghiên cứu  Khảo sát hiệu khử trùng dung dịch HgCl2 (0,1%) NaClO (5,25%) hạt mật nhân  Khảo sát ảnh hưởng KIN BA đến khả nảy mầm hạt mật nhân  Khảo sát ảnh hưởng KIN đến khả tái sinh chồi in vitro mật nhân  Khảo sát ảnh hưởng KIN IBA đến khả tạo rễ in vitro mật nhân CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhân giống in vitro thực vật Thuật ngữ nhân giống in vitro hay gọi vi nhân giống sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu nhiều phận khác thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng điều kiện vô trùng ống nghiệm loại bình ni cấy [7] Kỹ thuật nhân giống in vitro nhằm mục đích sau: - Duy trì nhân nhanh kiểu gen quý, nhằm tạo vật liệu cho công tác tạo giống - Nhân nhanh với hiệu kinh tế cao loài hoa, cảnh, ăn không trồng hạt - Nhân nhanh cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống loại rau, cảnh trồng khác - Nhân nhanh kinh tế kiểu gen quý lấy gỗ, làm thuốc, ăn quả, rau xanh - Nhân nhanh điều kiện vô trùng, cách ly tái nhiễm kết hợp với làm bệnh virus - Bảo quản tập đồn giống vơ tính loài giao phấn ngân hàng gen 1.1.1 Các giai đoạn q trình nhân giống in vitro  Giai đoạn chuẩn bị Mục đích giai đoạn tạo nguồn mẫu để phục vụ cho bước Giai đoạn coi bước hố vật liệu để ni cấy Cây giống đưa khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi trường mới, đồng thời giảm bớt khả nhiễm bệnh mẫu nuôi cấy chủ động công tác nhân giống Trong trường hợp cần thiết làm trẻ hố vật liệu giống  Giai đoạn cấy khởi động Mục đích giai đoạn tạo chồi từ mơ ni cấy Khi có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu xử lý điều kiện vô trùng Người ta thường dùng số hoá chất HgCl2, Ca(OCl)2, NaOCl, H2O2, để khử trùng mẫu cấy Tuỳ thuộc vào loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng thích hợp Về nguyên tắc, mơ ni cấy phận (thân, rễ, lá, hoa, quả…) theo Blatt mơ lấy từ phần non có khả ni cấy thành cơng cao mơ lấy từ phận trưởng thành khác (Blat K M Hwanok Ma, 2004) Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro Ngồi ra, lựa chọn mơ ni cấy cần ý tuổi sinh lý mơ thấp độ trẻ hố cao, ni cấy dễ thành cơng Các mô lấy thời kỳ sinh trưởng mạnh mùa sinh trưởng cho khả tái sinh tốt (Anoleson, 1980) Đối với mẫu dễ bị hoá nâu ni cấy bổ sung than hoạt tính polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trường [5] Giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Kết giai đoạn phụ thuộc vào việc chọn phận nuôi cấy, lấy mẫu cần đảm bảo nguyên tắc nêu Giai đoạn thường kéo dài từ - tuần  Giai đoạn nhân nhanh Một ưu điểm phương pháp nhân giống in vitro so với phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao Vì vậy, coi giai đoạn then chốt tồn q trình nhân giống Hệ số nhân giai đoạn biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào lồi cây, mơi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp Trong giai đoạn vai trò chất điều hồ sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) quan trọng để sản sinh lượng tối đa mà đảm bảo sức sống chất di truyền Theo nguyên tắc chung mơi trường có nhiều Cytokinin kích thích tạo chồi Chế độ ni thường 25-270C 10-16h/ngày, cường độ chiếu sáng 1000 lux Yêu cầu giai đoạn tạo số lượng tối đa thời gian ngắn đảm bảo sức sống chất di truyền  Tạo hoàn chỉnh (ra rễ) Đây giai đoạn chuẩn bị cho chuyển hệ thống vơ trùng đạt kích thước định, chồi chuyển từ giai đoạn sang môi trường tạo rễ Thường sau 2-3 tuần chồi xuất rễ trở thành hoàn chỉnh Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin tăng lượng Auxine để tạo điều kiện cho rễ chồi Người ta thường dùng chất NAA (Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) nồng độ 1mg/L - 5mg/L để tạo rễ cho hầu hết loại trồng phương pháp nuôi cấy mô Giai đoạn thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau chuyển sang mơi trường Auxin để rễ phát triển Ở giai đoạn nhạy cảm với ẩm độ bệnh tật hoạt động rễ phát sinh yếu, chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng  Đưa môi trường tự nhiên Đây giai đoạn chuyển dần in vitro nhà kính ngồi trời Cây mơ chuyển từ mơi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, nên phải tập cho quen dần với môi trường tự nhiên, tránh thay đổi đột ngột làm bị sốc chết Khi cứng cáp đạt tiêu chuẩn định chiều cao, số số rễ đưa ngồi giá thể Giá thể tiếp nhận in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước bệnh Phải giữ ẩm cho đưa từ bình ni ra, cần trì độ ẩm >50% để không nước làm giàn che để tránh ánh sáng mạnh Sau 2-3 ngày đưa ngồi mơ sinh trưởng ổn định, chăm sóc mơ tương tự chế độ chăm sóc hom từ hạt Tóm lại, q trình nhân giống in vitro chia thành giai đoạn kết giai đoạn khơng tách biệt mà có kế thừa giai đoạn trước Trong giai đoạn giai đoạn chuẩn bị mơi trường đặc biệt quan trọng, giai đoạn ảnh hưởng xuyên suốt định thành công hay thất bại q trình nhân giống 1.1.2 Ảnh hưởng mơi trường điều kiện nuôi cấy  Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro, môi trường nuôi cấy điều kiện bên xem vấn để định thành bại q trình ni cấy Mơi trường nuôi cấy xem phần đệm để cung cấp chất dinh dưỡng cần thiết cho tăng trưởng phân hố mơ suốt q trình ni cấy in vitro Cho đến nay, có nhiều mơi trường dinh dưỡng tìm (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng mục đích ni cấy Vấn đề lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng phát triển tối ưu giai đoạn nuôi cấy mô quan trọng Môi trường nuôi cấy hầu hết lồi thực vật bao gồm muối khống đa lượng, vi lượng, nguồn bon, acid amine chất điều hồ sinh trưởng (cũng bổ sung thêm số chất phụ gia khác than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ lồi, giống, nguồn gốc mẫu, chí quan thể mà dinh dưỡng cần cho sinh trưởng tối ưu chúng khác Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn mơi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho giai đoạn hệ mô nuôi cấy mô quan trọng, số lượng loại hố chất phải cần độ xác cao phù hợp cho giai đoạn, đối tượng cụ thể + Nguồn bon: nuôi cấy mô, tế bào chưa có khả quang hợp để tổng hợp nên chất hữu người ta phải đưa vào môi trường lượng hợp chất bon định để cung cấp nượng cho tế bào mô (Debengh, 1991) Nguồn cácbon loại đường khoảng 20-30 mg/L có tác dụng giúp mơ tế bào thực vật tổng hợp hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngồi đóng vai trò chất thẩm thấu mơi trường Người ta thường sử dụng loại đường saccarose glucose + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài trạng thái phát triển mô Thông thường, nguồn nitơ đưa vào môi trường hai dạng HN4+ NO3 (nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3 tế bào thực vật tỏ có hiệu so với NH4 Nhưng đơi NO3 gây tượng “kiềm hóa” mơi trường giải pháp sử dụng phối hợp nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý sử dụng rộng rãi  Các chất kích thích sinh trưởng Các Phytohormon chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng phát triển thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng q trình sinh trưởng phát triển thực vật như: phân chia, biệt hố tế bào… ngồi có ảnh hưởng đến q trình lão hố mơ nhiều q trình khác Các phytohormon chia thành nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid Chúng yếu tố quan trọng môi trường định đến thành công kết ni cấy + Auxin: Nhóm gồm có chất là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… nuôi cấy mô thực vật Auxin thường sử dụng để kích thích phân chia tế bào, biệt hố rễ, hình thành callus, kìm hãm phát triển chồi tạo rễ phụ [14] + Cytokinin: Được bổ sung vào mơi trường chủ yếu để kích thích phân chia tế bào định phân hoá chồi bất định từ callus quan Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong chất Kinetin BAP sử dụng phổ biến chúng có hoạt tính cao giá thành rẻ Tuỳ vào hệ mô mục đích ni cấy mà Cytokinin sử dụng nồng độ khác Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích phân bào, nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích phân hố chồi Trong ni cấy mơ để kích thích nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 106 - 10-4 [3]  Điều kiện nuôi cấy + Ánh sáng: Đây yếu tố cần thiết cho phát triển phát sinh hình thái mơ ni cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng q trình phát triển mơ ni cấy Với đa số lồi cây, thời gian chiếu sáng thích hợp 8-12 h/ngày Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến trình phát sinh hình thái mơ ni cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng callus cường độ thấp gây nên tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mơ ni cấy từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974) Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng chất lượng ánh sáng ảnh hưởng rõ tới phát sinh hình thái mơ ni cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi so với ánh sáng trắng, ánh sáng xanh ức chế vươn cao chồi lại ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng callus Chính mà phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux + Nhiệt độ: nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến phân chia tế bào trình trao đổi chất mơ ni cấy, đồng thời có ảnh hưởng tới hoạt động Auxin, làm ảnh hưởng đến khả rễ mô Theo kết nghiên cứu Vonanorld (1982) nhiệt độ ngày/đêm 200 C/150C 200C/180C tỷ lệ rễ đạt khoảng 33%, chí thấp Ở nhiệt độ trung bình hoạt động trao đổi chất tốt Còn nhiệt độ cao lại kích thích nhiều tế bào khơng có tổ chức Trong ni cấy mơ, nhiệt độ thường trì ổn định, ban ngày từ 25 - 300C ban đêm từ 17 - 200C 1.1.3 Các nghiên cứu nhân giống in vitro dược liệu  Trên giới Nuôi cấy mô tế bào thực vật hình thành phát triển từ năm 80 kỉ XX ứng dụng chủ yếu lĩnh vực: Nhân giống vơ tính in vitro, nuôi cấy mô phân sinh đỉnh sinh trưởng để tạo bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro, tạo phơi vơ tính hạt nhân tạo… [2] Kỹ thuật nuôi cấy mô 600 công ty lớn giới áp dụng nhân khoảng 500 triệu giống năm công ty giống trồng khác Dự kiến thị trường giống, kỹ thuật nuôi cấy mô thu khoảng 15 tỉ USD/năm tốc độ tăng trưởng thị trường hàng năm vào khoảng 15% [2] Trong năm gần đây, quy trình nhân giống kỹ thuật nuôi cấy in vitro nhiều sở khoa học nghiên cứu hoàn thiện đối tượng khác như: rừng, lương thực, thực phẩm, ăn quả, hoa, cảnh, dược liệu… Gần đây, việc ứng dụng thành tựu công nghệ sinh học nhân giống, tạo dược liệu in vitro loài thuốc quý quan tâm đạt số thành tựu, chẳng hạn như: G Rout cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh Lài tàu (Nyctanthes arbortristis) - họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae) từ chồi nách Tỷ lệ vi chồi/mẫu cấy lớn (6,65 chồi/mẫu) mơi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA, 50 mg/L Ads 0,1 mg/L IAA sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ rễ lớn môi trường MS bổ sung 0,25 mg/L IBA; 0,1 mg/L IAA 2% sucrose Khoảng 70% rễ sống sót nhà kính [31] Sharma Neetu (2007) áp dụng phương pháp nhân giống vơ tính in vitro để bảo tồn Rau đắng (Bacopa monnieri L Penn) loài thảo dược thuộc họ Scrophulariaceae Đây thuốc bỗ não tốt phương thuốc Ấn Độ phương thuốc truyền thống khác, có tác dụng bổ thần kinh, trị chứng ngủ tình trạng bồn chồn, lo lắng Kết nghiên cứu cho thấy môi trường MS có bổ sung mg/L BA 0,4 mg/L NAA mơi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L NAA tốt để cấy gây nhân nhanh chồi in vitro từ chồi nách Môi trường MS bổ sung mg/L agar 20 mg/L đường môi trường MS bổ sung mg/L agar 20 mg/L đường môi trường tái sinh rễ tốt [33] Nadha cs (2007) nghiên cứu nhân nhanh dầu dài Ấn Độ (Tylophora indica) thuộc họ Thiên lý (Asclepiadaceae) Các tác giả nghiên cứu khả tái sinh chồi in vitro từ đoạn mắt thân dầu dài Ấn Độ môi trường MS bổ sung BA (10-6 - 4x10-6 mg/L), CM (15%) Kết tốt đạt 45 - 50 chồi mơi trường MS có bổ sung 2x10-6mg/L BA sau - tuần nuôi cấy Khi tăng thêm nồng độ BA số chồi bị suy giảm Sau chồi cấy mơi trường MS bổ sung IBA IAA để tạo rễ, kết tổt môi trường MS bổ sung 4x10-6 mg/L IBA [26] Nhóm tác giả Animesh cs (2007) tái sinh in vitro Cam thảo dây (Abrus precatorius L.) thuộc họ Cánh bướm (Papilionaceae) từ callus môi trường MS có bổ sung 3,0 mg/L BA + 5mg/L KIN + 0,5 mg/L NAA Cây có tác dụng chữa nóng sốt, chữa say, giải độc thể, rễ dùng làm thuốc nhầy để chữa bệnh lậu, kinh nguyệt nhiều [15] Theo nghiên cứu nhóm tác giả người Ấn Độ Panda MK cs (2007) nghệ (Curcuma longa) phần trăm mẫu bật chồi cao đạt 85,8% nồng độ mg/L BA tỉ lệ chồi/mẫu cao (7,6 chồi/mẫu) [28] Năm 2008, Khalafalla M M Daffalla H M nhân giống thành công Keo (Acacia Senegal (L.) Wild) thuộc họ Trinh nữ, vỏ chứa tanin dùng để trị vết thương, vết loét Sau tuần nuôi cấy môi trường MS, có bổ sung 1,0 mg/L BA cho tỉ lệ bật chồi cao (5,3 chồi /mẫu) tỉ lệ rễ đạt 25% mơi trường có 1,0 mg/L IBA [22] U Salma cs (2008) nghiên cứu Bangladesh nhân giống Ba gạc Ấn Độ (Rawolfia serpentien L Benth) có chứa 28 alkaloid khác có tác dụng hạ huyết áp, an thần, gây ngủ… tổ hợp BA NAA Sau thời gian nuôi cấy thu số chồi/mẫu cao tổ hợp 1,5 mg/L BA 0,2 mg/L 10 a b Hình 3: (a): Hình thái hạt nảy mầm mơi trường MS; (b): Hình thái hạt nảy mầm môi trường bổ sung 5,0 mg/L KIN Như dựa vào tỉ lệ nảy mầm, thời gian nảy mầm hình thái chồi mầm chúng tơi chọn mơi trường MS mơi trường thích hợp cho khả nảy mầm hạt mật nhân Chan LK cs (2002) nghiên cứu nảy mầm in vitrro hạt mật nhân Malaysia nhận thấy hạt nảy mầm tốt môi trường MS không bổ sung chất KTST [16] 3.3 Ảnh hưởng KIN đến khả nhân chồi in vitro Chồi in vitro dài khoảng 0,5cm cấy mơi trường MS có bổ sung KIN (1,0-5,0 mg/L) để khảo sát khả nhân chồi in vitro Sau tuần nuôi cấy, kết trình bày bảng Bảng Ảnh hưởng KIN đến khả nhân chồi in vitro mật nhân sau tuần nuôi cấy KIN Khả nhân chồi in vitro Số Chiều cao chồi/mẫu chồi (cm) - 1,00b 0,49b 0.94b 1,0 1,00b 0,50b 1,00b 2,0 1,50b 0,75b 1,00b 3,0 1,00b 1,00ab 1,00b 4,0 2,00b 1,40ab 2,20b 5,0 3,60a 2,30a 4,60a (mg/L) Số Chú thích: Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu với p