BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG I HC Y H NI H MAI LINH ĐáNH GIá HIệU QUả CủA BA PHƯƠNG PHáP KHử PROTEIN TRONG XƯƠNG Bß LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ Hà Nội - Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI HÀ MAI LINH ĐáNH GIá HIệU QUả CủA BA PHƯƠNG PHáP KHử PROTEIN TRONG XƯƠNG Bò Chuyờn ngnh: Mụ- phụi Mó s : 62720101 LUẬN VĂN BÁC SỸ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Ngơ Duy Thìn Hà Nội - Năm 2017 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALP : Alkaline Phosphate API : Atmospheric Pressure Ionization BMP : Bone Morphogenetic protein BSE : Bovine Spongiform Encephalopathy CBFA- : Core Binding Factor Alpha- GTR : Guided Tissue Regeneration HA : Hydroxyapatite HLA : Human Leukocyte Antigen HPLC : High Performance Liquid Chromatography IGFs : Insulinlike growth factors IL : Interleukin MGP : Matrix Gla- protein MHC : Major Histocompatibility Complex MS : Mass Spectrometry OP- : Osteogenic protein PDGFs : Platelet- derived Growth Factors SEM : Scan Electron Microscopy TCA : Tricloacetic acid TGF- β : Transforming Growth Factor β ĐẶT VẤN ĐỀ Ghép xương phương pháp phổ biến để sửa chữa khuyết tật xương phẫu thuật chỉnh hình tái tạo [1] Ứng dụng dựa ba chế hỗ trợ hàn gắn tổn thương mơ ghép, là: khả cảm ứng tạo xương, khả dẫn xương khả tạo xương Trong đó, khả cảm ứng tạo xương khả kích thích tế bào tạo xương thể nhận biệt hóa thành tế bào xương; khả dẫn xương mảnh ghép đóng vai trò khung cho hình thành xương khả tạo xương khả mảnh ghép cung cấp cho tổn thương tế bào cần thiết cho tạo xương, khả có xương ghép tự thân [2] Ghép xương tự thân tiêu chuẩn vàng cho tái tạo xương [3], nhiên, nguồn xương ghép tự thân hạn chế, đồng thời, việc lấy mảnh mô ghép đòi hỏi phẫu thuật thứ hai gây tổn thương vị trí lấy mảnh ghép, kéo dài thời gian phẫu thuật nâng giá thành [4] Do đó, việc tìm phát triển nguyên liệu ghép xương thay cần thiết May mắn xương lồi động vật khác có thành phần hóa học cấu trúc mô học tương tự xương người [5],[6] thêm vào đó, chúng bộc lộ khả dẫn xương cảm ứng tạo xương [6], có khả thỏa mãn yêu cầu vật liệu ghép lý tưởng Năm 1668, ca phẫu thuật ghép xương dị loài người thực thành công nhà phẫu thuật người Hà Lan Job Janszoon van Meekeren Trong nhiều năm qua, mô xương từ nhiều loài động vật khác nghiên cứu để ghép người Trong số đó, xương bò loại vật liệu ưa thích nguồn nguyên liệu phong phú việc sử dụng xương bò khơng gặp phải trở ngại đạo đức y học [5] Ghép xương dị loài khắc phục hạn chế ghép xương tự thân nhiên việc ghép xương dị lồi có nguy gây phản ứng miễn dịch lây truyền bệnh truyền nhiễm cho người nhận [7],[8] Do đó, xây dựng quy trình loại bỏ kháng ngun có khả tạo phản ứng miễn dịch mảnh ghép quan trọng phát triển vật liệu thay sử dụng xương dị lồi Xương bò khử protein chứng minh loại bỏ nguy kích thích phản ứng miễn dịch mà giữ lại khả cảm ứng tạo xương dẫn xương [2], nhờ đó, kích thích hàn gắn tái tạo xương sau phẫu thuật Tuy nhiên nay, ứng dụng xương bò khử protein phẫu thuật chỉnh hình hạn chế trình khử protein làm giảm sức mạnh học xương [9] Ngược lại, bột xương bò khử protein ngày ưa chuộng nha khoa gia tăng nhu cầu tái tạo ổ xương hàm [5] Phương pháp khử protein xương lần đề xuất Bauermeister cộng từ năm 1957 cách ngâm mảnh xương H2O2 [10] Cho đến nay, giới có nhiều phương pháp khử protein xương bò nghiên cứu ứng dụng, tạo nhiều sản phẩm thương mại bột xương bò khử protein khác [5] Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu phương pháp khử protein xương bò ứng dụng y học Vì vậy, tiến hành nghiên cứu đề tài “Đánh giá hiệu ba phương pháp khử protein xương bò” với hai mục tiêu: So sánh hiệu khử protein xương bò từ ba phương pháp khử protein khác Nhận xét khả dung nạp xương bò khử protein thỏ thực nghiệm Chương I TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu tạo mơ học xương Mơ xương hình thái thích nghi đăc biệt mô liên kết [11] Giống loại mô liên kết khác, mô xương bao gồm tế bào chất ngoại bào [12] Tuy nhiên, khác với loại mô liên kết khác, thành phần ngoại bào mơ xương bị calci hóa làm cho chất trở nên cứng rắn, phù hợp với chức chống đỡ bảo vệ xương [12] 1.1.1 Chất ngoại bào Chất ngoại bào xương bao gồm thành phần hữu cơ, chủ yếu collagen thành phần vô cơ, chủ yếu hydroxyapatite (HA) muối khác calci phosphate Các sợi collagen tạo cho xương sức bền trước lực kéo tinh thể HA tạo cho xương sức bền trước lực ép Ở loài động vật có vú, thành phần vơ chiếm khoảng 65%, thành phần hữu nước chiếm 25% 10% trọng lượng mơ xương Xương người có 50 – 75% trọng lượng thành phần vô cơ, 20 – 40% thành phần hữu – 10% nước [13] Ở xương bò, protein chiếm khoảng 38% trọng lượng mô xương [6] 1.1.1.1 Thành phần hữu 85 – 90% Lượng protein chất ngoại bào xương collagen, chủ yếu collagen type I lượng nhỏ collagen type V [14] Môt số type collagen khác collagen type III, XI XIII tìm thấy chất ngoại bào xương dạng vết [12] Collagen typ I khơng tạo khung cho khống hóa xương mà có vai trò quan trọng q trình gắn tăng sinh tế bào Trong loại vật liêu sử dụng ghép xương, collagen cho gây phản ứng miễn dịch [15], hỗ trợ gắn phát triển tế bào xương tái tạo mô xương [16] Chất ngoại bào xương chứa loại protein khác, chúng tạo nên chất xương chiếm khoảng 10 – 15% lượng protein chất ngoại bào [14] Các protein đóng vai trò quan trọng trình tăng trưởng, phát triển, sửa chữa đổi xương Ở mô xương, collagen chất bị khống hóa [12] Bốn nhóm protein khơng phải collagen chất xương bao gồm: - Các đại phân tử proteoglycan: bao gồm lõi protein gắn với nhiều chuỗi bên glycosaminoglycan liên kết cộng hóa trị Các glycosaminoglycan chủ yếu gồm hyaluronan, chondroitin sulfat keratin sulfat Chúng giúp làm tăng sức chịu nén xương đồng thời có vai trò gắn với yếu tố tăng trưởng ức chế khống hóa [12] - Các glycoprotein kết nối: có chức gắn tế bào xương sợi collagen với chất khống hóa Một số glycoprotein quan trọng osteonectin (có vai trò lớp keo gắn collagen tinh thể HA) sialoprotein osteopontin (trung gian gắn kết tế bào với chất nền), sialoprotein I II (trung gian gắn kết tế bào khởi phát hình thành canxi phosphate q trình khống hóa) [12] - Các protein phụ thuộc vitamin K đặc biệt xương: bao gồm osteocalcin (giữ calci từ hệ tuần hoàn, thu hút cảm ứng hủy cốt bào trình tu sửa xương), protein S (hỗ trợ việc loại bỏ tế bào thông qua apoptosis), Gla- protein chất (MGP) (tham gia vào vơi hóa mạch máu) [12] - Các yếu tố tăng trưởng cytokines: chúng protein điều hòa nhỏ bao gồm yếu tố tăng trưởng giống insulin (IGFs), yếu tố hoại tử khối u α (TNF- α), yếu tố tăng trưởng biến đổi β (TGF- β), yếu tố tăng trưởng có nguồn gốc từ tiểu cầu (PDGFs), protein tạo hình xương (BMP), interleukin (IL- 1, IL- 6) Đáng ý nhóm BMP, chúng kích thích tế bào trung mơ biệt hóa thành tạo cốt bào tế bào tạo xương [12] 1.1.1.2 Thành phần vô Thành phần vô xương chủ yếu HA Ca 10(PO4)6(OH)2) lượng nhỏ muối carbonate, magnesium acid phosphate Các tinh thể HA hoàn thiện xương có hình đĩa, kích thước dài rộng trung bình đĩa 50 x 25nm, chiều dày khoảng – nm [17] Khoảng – 6% nhóm PO42- thay nhóm CO32- Các tinh thể carbonate apatite nhỏ (kích thước tinh thể 10 – 60nm) dễ hòa tan, cho phép chúng dễ dàng tham gia vào q trình chuyển hóa chất khống thể [14] Trong đó, magnesium chứng minh ức chế trình hình thành tinh thể HA dung dịch, thay cho calci cấu trúc tinh thể HA chủ yếu hấp thu bề mặt tinh thể, magnesium giúp ổn định cấu trúc tinh thể HA [18] Các tinh thể HA chứng minh có khả tương thích sinh học cao, phân hủy chậm, khả dẫn xương khả cảm ứng tạo xương tốt [17],[19], đó, sản phẩm HA tự nhiên tổng hợp ngày ứng dụng rộng rãi để kích thích tạo xương, bao bọc implant sử dụng chất làm đầy xương [20],[21] 1.1.2 Các tế bào Trong xương hoạt động phát triển tích cực, phân biệt loại tế bào: tiền tạo cốt bào, tạo cốt bào, tế bào xương hủy cốt bào [11] Ngoại trừ hủy cốt bào, tế bào lại xem dạng biệt hóa khác dòng tế bào, chúng trải qua q trình biến đổi từ dạng biệt hóa sang dạng biệt hóa cao hơn, kèm theo biến đổi mặt chức Ngược lại, hủy cốt bào có nguồn gốc từ dòng tế bào khác có chức hủy muối khoáng protein chất ngoại bào, chức có vai trò quan trọng trình sửa chữa tái tạo xương [12] 1.1.2.1 Tiền tạo cốt bào Tiền tạo cốt bào có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mơ Chúng thường xuất lớp màng xương, lợp mặt ống Havers Tiền tạo cốt bào tế bào có nhân hình bầu dục dài, bào tương bắt màu acid kém, ưa base Các tế bào hoạt động tích cực trình phát triển bình thường xương, thể trưởng thành, chúng tích cực tham gia vào sửa chữa xương hàn gắn xương gãy Khi thực chức này, tiền tạo cốt bào tăng nhanh số lượng cách gián phân biệt hóa thành tạo cốt bào [11] Yếu tố khởi phát q trình biệt hóa tiền tạo cốt bào yếu tố phiên mã core binding factor alpha- (CBFA- 1) Protein kích thích biểu gen quy định đặc tính tạo cốt bào Như trình bày trên, BMP có vai trò biệt hóa tiền tạo cốt bào [12] 1.1.2.2 Tạo cốt bào Tạo cốt bào tế bào đa diện, nhân lớn hình cầu, bào tương ưa base có nhánh nối với với tê bào nằm tủy xương, chúng thường xếp thành hàng mặt bè xương hình thành [11] Nơi có tạo xương nơi tạo cốt bào xuất [11] Chúng tạo collagen type I protein chất Tạo cốt bào tham gia vào q trình calci hóa chất ngoại bào Osteocalcin sialoprotein khác tạo cốt bào tiết có vai trò gắn Ca 2+ làm tăng nồng độ chỗ ion Nồng độ cao Ca 2+ kích thích tạo cốt bào tiết alkaline phosphate (ALP), enzyme làm tăng nồng độ chỗ ion PO42- Nồng độ ion PO42- cao lại kích thích làm tăng nồng độ ion Ca 2+ vị trí xảy khống hóa chất Ở giai đoạn nồng độ Ca 2+ PO42- ngoại bào cao, tạo cốt bào giải phóng túi tiết nhỏ (đương kính 50 – 200nm) vào chất Các túi giàu ALP pyrophosphatase, hai enzyme có tác dụng tách PO 42- khỏi phân tử khác chất Sự tích tụ Ca2+ PO42- chỗ tạo điểm đẳng điện, dẫn đến hình thành tinh thể CaPO4 xung quanh túi tiết Các tinh thể CaPO gây khống hóa chất cách hình thành lắng đọng tinh thể hydroxyapatite chất xung quanh tiền tạo cốt bào [12] Trong trình tạo xương mới, số tạo cốt bào tự vùi chất chúng tạo trở thành tế bào xương [11] 1.1.2.3 Tế bào xương Trong xương hình thành hồn thiện, tế bào xương tế bào chủ yếu [11] Thân tế bào xương dài khoảng 20 – 30µm, nằm hốc gọi ổ xương Từ thân tế bào có nhiều nhánh bào tương nhỏ, nhánh bào tương tiểu quản xương tới tiếp xúc với nhánh bào tương tế bào bên cạnh liên kết khe Dưới kính hiển vi quang học khơng thể quan sát hình ảnh nhánh bào tương này, để quan sát chúng phải sử dụng kính hiển vi điện tử [11] Các tế bào xương có ảnh hưởng rõ ràng đến đặc tính chất [11] Chúng đảm nhận vai trò đáp ứng với lực học tác dụng lên xương hoạt động hóa học (mechanotransduction) Các kích thích học khác (như trạng thái khơng trọng lực tình trạng tăng chịu lực) khơng ảnh hưởng đến biểu gen mà làm thay đổi chế chết theo chương trình tế bào xương Tế bào xương tổng hợp chất tham gia vào trình phân hủy chất nền, hoạt động giúp trì cân nồng độ calci nội mơi [12] Các tế bào xương chết 51 hiệu nhiễm trùng thải ghép Nếu mô ghép dung nạp, phản ứng viêm mạn tính tiến triển tới hình thành mô hạt với xuất đại thực bào, nguyên bào sợi hình thành tân mạch Các nguyên bào sợi tích cực tổng hợp collagen thành phần chất làm tiền đề cho xơ hóa Cuối lành hóa vết thương, vị trí tổn thương cấy ghép thay mô liên kết không viêm bao phủ lớp thượng bì nguyên vẹn [4] Theo Therin (1991), vật liệu coi có tính tương đồng sinh học sau cấy ghép tuần vào thể sống, mô xung quanh không phản ứng viêm [5] Như vậy, sơ đánh giá khả dung nạp vật liệu thời điểm tuần sau ghép thông qua đánh giá hình thái đại thể vi thể vị trí ghép Để đánh giá khả dung nạp mơ ghép, có nhiều phương pháp nghiên cứu, ghép vật liệu da, gép ghép vị trí nhận vật liệu thường sử dụng Trong mơ loại mơ đồng nhất, đó, việc đánh giá biến đổi hình thái sau trình ghép vật liệu dễ dàng Tuy nhiên, mô thường tương đối sâu, q trình bóc tách lớp khơng tiến hành cẩn thận gây tổn thương vị trí nhận ghép làm ảnh hưởng đến kết nghiên cứu Ghép mẫu mô xương đánh giá khả dung nạp mảnh ghép mà đánh giá khả kích thích tạo xương mảnh ghép Tuy nhiên, phương pháp tiến hành phức tạp Mô da mô liên kết tương đối lỏng lẻo, giàu mạch máu, đó, phản ứng viêm hay thải loại mảnh ghép diễn rõ ràng Ghép mảnh ghép da thuận lợi cho trình theo dõi tiến triển tổn thương phát sớm tượng chảy máu, nhiễm trùng vị trí ghép Tuy nhiên, mơ da có nhiều thành phần tế bào, nữa, tình trạng mơ da dễ dàng bị ảnh hưởng nhiều tác động ngoại cảnh, ảnh hưởng tới kết nghiên cứu Ở nghiên cứu chúng tôi, mục tiêu nghiên cứu dùng lại bước nhận 52 xét khả dung nạp xương bò khử protein động vật thực nghiệm thời gian theo dõi tương đối ngắn Do đó, chúng tơi lựa chọn ghép da thỏ - phương pháp nghiên cứu đơn giản đáp ứng mục tiêu nghiên cứu 4.2.2 Về khả dung nạp xương bò khử protein ba phương pháp thỏ thực nghiệm Ở nghiên cứu chúng tôi, mảnh xương sau xử lý loại bỏ mỡ, tủy xương khử protein phương pháp: sử dụng pepsin, H2O2 NaClO vô trùng tia gamma ghép da thỏ thực nghiệm Quan sát thời điểm tuần sau ghép nhận thấy vết mổ liền sẹo, không thấy dấu hiệu thải loại mảnh ghép Tại nơi tiếp xúc với mảnh xương khử protein pepsin có lớp mơ liên kết xơ mỏng Khơng thấy hình ảnh mạch máu tân tạo gần không thấy xuất tế bào viêm đại thực bào, bạch cầu đa nhân, lympho bào, tương bào Các tế bào mô liên kết xơ chủ yếu tế bào sợi với nhân dẹt, hình sợi Những nhận xét cho thấy, tổn thương vùng mơ xung quanh vị trí ghép xương tiến triển tới giai đoạn lành hóa Năm 2015, Lei cộng tiến hành ghép xương bò khử protein pesin vào tổn thương xương quay thỏ thực nghiệm, thời điểm tuần sau ghép quan sát thấy bắt đầu có tạo xương thấy tế bào viêm vùng ghép Tại nơi tiếp xúc với mảnh xương khử protein H 2O2, xuất lớp mô liên kết xơ dày Tại thấy số mạch máu, có tân mạch với tế bào nội mơ cao Rải rác có xuất số tế bào viêm Trong vùng mơ xơ có nhiều nguyên bào sợi với nhân hình trứng, to sáng màu Theo Anderson, tổn thương vùng mô quanh mảnh ghép tiến triển đến giai đoạn tạo mơ hạt tích cực tổng hợp mơ liên kết xơ 53 Nghiên cứu Lei năm 2015 quan sát vùng ghép mảnh xương bò khử protein H2O2 vào tổn thương xương quay thỏ thời điểm tuần sau ghép nhận thấy, có tạo xương vị trí ghép, lượng tế bào viêm vùng ghép xương nhóm sử dụng xương bò khử protein H2O2 cao so với nhóm sử dụng xương khử protein pepsin [31] Năm 1967, quan sát mảnh sinh thiết bệnh nhân ghép xương bò khử protein H2O2 vào cột sống để điều trị thối hóa cột sống sau tuần, D Churchill-Davidson nhận thấy khơng có dấu hiệu phản ứng viêm bắt đầu có tao xương tổn thương [59] Năm 1982, Mc Murray tiến hành quan sát mảnh sinh thiết bệnh nhi 3,5 tuổi bị gù lưng sau ghép xương bò khử protein H2O2 sau tuần nhận thấy có tạo mơ liên kết xơ quanh mảnh ghép với xuất nhiều nguyên bào sợi [60] Ở nơi tiếp xúc với mảnh xương khử protein NaClO xuất lớp mô xơ dày Trong vùng mơ da quanh mảnh ghép thấy số mạch máu với tế bào nội mô dẹt Các tế bào viêm thưa thớt Trong vùng mô xơ thấy hình ảnh tế bào sợi nguyên bào sợi Hình ảnh vi thể cho thấy, phản ứng viêm khơng mơ xung quanh vị trí tổn thương giai đoạn xơ hóa Trên thé giới nay, chưa có nghiên cứu đánh giá khả dung nạp xương bò khử protein NaClO Từ nhận xét cho thấy, vị trí tiếp xúc với mảnh ghép có xuất lớp mơ liên kết xơ bao quanh mảnh ghép Theo Ngô Duy Thìn cộng sự, lớp mơ liên kết mỏng dần q trình lành hóa tổn thương Hình ảnh vi thể vùng mơ da quanh vị trí ghép mảnh xương vị trí ghép cho thấy, trình hàn gắn tổn thương tiến triển nhanh vùng mơ da quanh vị trí ghép mảnh xương khử protein pepsin chậm mảnh xương khử protein H 2O2 Tuy nhiên, để 54 đánh giá kết của trình này, cần phải theo dõi mảnh ghép thời gian lâu Năm 2005, Simon S.J tiến hành ghép ba loại xương: xương tự thân, xương bò khử protein hang Bio- Oss beta tricalcium phosphate hãng Solothurn tổn thương xương hàm lợn theo dõi tuần nhận thấy: Ở tuần thứ nhất, đặc điểm chung tổn thương có xuất cục máu đông Riêng vùng mô quanh vị trí ghép xương tự thân thấy có hình thành mơ hạt xuất lớp mơ liên kết xơ bao quanh mảnh ghép Ở tuần thứ sau ghép, vị trí ghép xương tự thân có hình thành xương lưới, mơ liên kết xung quanh vị trí ghép xương bò khử protein TCP thấy hình ảnh mơ hạt xuất Ở thòi điểm tuần sau ghép, tất vị trí ghép xương có hình thành xương mới, đó, lượng xương hình thành mẫu sử dụng xương tự thân lớn Mô liên kết xen xương hình thành phần xương ghép, khơng thấy dấu hiệu phản ứng viêm [7] Năm 2008, Filippo F tiến hành ghép xương bò khử protein hãng BioOss vào ổ sau nhổ tiền cối hàm chó Sau tuần, quan sát hình ảnh vi thể vị trí ghép nhận thấy có xuất lớp mô liên kết sợi xung quanh mảnh ghép, khơng có dấu hiệu phản ứng viêm, thối hóa hay hoại tử vùng mơ xung quanh mảnh ghép [62] Như vậy, so với chế phẩm xương bò khử protein thương mại sử dụng rộng rãi lâm sàng, hình ảnh vi thể vị trí ghép xương bò khử protein pepsin NaClO thời điểm tuần sau ghép khơng có khác biệt đáng kể 55 4.3 Đánh giá khả ứng dụng phương pháp khử protein xương bò 4.3.1 Phương pháp khử protein pepsin Trong nghiên cứu này, khử protein xương bò pepsin bộc lộ khả kích thích hàn gắn tổn thương tốt nhất, lượng protein lại mẫu xương cao đáng kể so với mẫu xương khử protein NaClO Nguyên nhân tượng phản ứng enzyme với chất phản ứng chọn lọc Trong chất xương, collagen tồn cấu trúc xoắn bền vững, tạo chuỗi polypeptide xoắn với nhau, đó, “trơ” phản ứng enzyme Vì vậy, trình khử protein xương bò pepsin loại bỏ protein bền vững có tính kháng nguyên cao chất xương, đồng thời giữ lại lượng lớn collgen có mẫu xương Collagen chứng minh khơng khơng có tính kháng ngun mà kích thích hàn gắn tổn thương Trước lâm sàng, người ta thường sử dụng collagen ngoại sinh để kích thích hàn gắn tổn thương số quan Hơn mơ xương, tương tác nhóm acis amin chuỗi collagen với receptor mặt tạo cốt bào kích thích tăng sinh biểu gen tế bào Nhờ đó, kích thích tạo xương Vì vậy, có lẽ nhờ phản ứng chọn lọc pepsin protein giúp giữ lại protein cấu trúc bền vững, có lợi cho trình hàn gắn tổn thương mà trình lành hóa vết thương quanh vị trí ghép xương khử protein pepsin diễn nhanh Tuy nhiên, pepsin hóa chất đắt tiền, khơng sẵn có, quy trình khử protein pepsin đòi hỏi yêu cầu chặt chẽ nhiệt độ, độ pH Quá trình pha dung dịch đệm phù hợp cho phản ứng enzyme không dễ tiến 56 hành Vì vậy, quy trình khơng đem lại hiệu cao kinh tế khó áp dụng rộng rãi 4.3.2 Phương pháp khử protein H2O2 Theo kết nghiên cứu này, trình hàn gắn tổn thương vị trí ghép mảnh xương khử protein H 2O2 diễn chậm so với hai phương pháp lại, lượng protein lại mẫu xương khử protein H2O2 xấp xỉ lượng protein lại mẫu xương khử protein pepsin Nguyên nhân tượng phản ứng H2O2 với protein khơng chọn lọc, đó, khử protein cấu trúc khơng có tiềm miễn dịch lại giữ lại protein có tính kháng ngun Một giả thiết khác để giải thích tượng H 2O2 có tính oxy hóa cao, đó, làm thay đổi cấu trúc tự nhiên sợi collagen, làm giảm khả hỗ trợ hàn gắn tổn thương protein hày Hơn nữa, sợi collagen bị biến đổi cấu trúc bộc lộ tính kháng nguyên thể nhận, đó, làm chậm q trình lành hóa vết thương Tuy nhiên, H2O2 hóa chất sẵn có, rẻ tiền, phương pháp khử protein hóa chất khơng đỏi hỏi yêu cầu cao điều kiện phản ứng, đó, dễ dàng ứng dụng lâm sàng Mặc dù vậy, để ứng dụng phương pháp cần nghiên cứu xa để xác định thời gian khử nồng độ H2O2 hợp lý cho loại bỏ protrein kháng nguyên mà vận giữ lại tối đa protein có lợi trì cấu trúc tự nhiên protein 4.3.3 Phương pháp khử protein NaClO Trong nghiên cứu chúng tơi, q trình hàn gắn tổn thương vị trí ghép mảnh xương khử protein NaClO nhanh so với trình hàn gắn tổn thương vị trí ghép mảnh xương khử protein H 2O2 chậm so với vị trí ghép mảnh xương khử pepsin 57 Hiện tượng giải thích NaClO khử gần hồn tồn protein mẫu, có thành phần collagen có lợi cho q trình hàn gắn tổn thương Hơn nữa, giống H2O2, NaClO chất có tính oxi hóa mạnh, đó, phá hủy cấu trúc sợi collagen cắt chúng thành đoạn peptid ngắn có tính kháng ngun Vì vậy, hàn gắn tổn thương quanh mảnh ghép xương khử protein NaClO kéo dài so với mẫu xương khử protein pepsin So với mẫu xương khử protein H2O2, lượng protein lại mẫu xương khử NaClO thấp nhiều Do đó, hai loại hóa chất làm biến đổi cấu trúc protein có tình “trơ” miễn dịch thành protein kích thích sinh miễn dịch lượng kháng ngun mẫu xương khử protein H 2O2 cao Do đó, q trình hàn gắn tổn thương vị trí ghép mảnh xương khử protein H 2O2 diễn chậm NaClO hóa chất rẻ tiền sẵn có, phương pháp khử dễ thực Tuy nhiên, để nâng cao hiệu dung nạp mảnh ghép, cần phải có nghiên cứu kỹ nhằm tìm phương pháp khử thích hợp, giữ lại protein cấu trúc có mẫu 58 KẾT LUẬN Về hiệu khử protein ba phương pháp 1.1 Lượng protein lại mẫu xương sau khử ba phương pháp - Lượng protein mẫu xương khử pepsin 19,42 g/100g - Lượng protein mẫu xương khử H2O2 19,41 g/100g - Lượng protein mẫu xương khử NaClO 1,04 g/100g 1.2 Về hình thái mẫu xương sau khử ba phương pháp - Các mẫu xương sau khử protein pepsin NaClO khơng có thay đổi hình thái đại thể, vi thể so với mẫu xương chưa khử - Mẫu xương khử protein NaClO có màu trắng sáng so với mẫu xương chưa khử Khơng khảo sát hình thái vi thể mảnh xương sau trình khử protein NaClo Về khả dung nạp mảnh xương sau trình khử protein ba phương pháp thỏ thực nghiệm Sau cấy ghép mảnh xương vào mô da thỏ tuần nhận thấy: - Các vết mổ khơ, sạch, khơng có tượng thải loại - Mô da xung quanh mảnh ghép không sưng nề, tiết dịch - Tại vị trí tiếp xúc với mảnh xương khử protein pepsin thấy có xuất lớp mô liên kết sợi mỏng, gần không thấy xuất tế bào viêm tân mạch Các tế bào mô liên kết sợi chủ yếu tế bào sợi - Tại vị trí tiếp xúc với mảnh xương khử protein H 2O2 thấy có xuất lớp mơ liên kết sợi dày, rải rác có tế bào 59 viêm tân mạch Trong mô liên kết sợi thấy có xuất tế bào sợi nguyên bào sợi - Tại vị trí tiếp xúc với mảnh xương khử protein NaClO thấy có xuất lớp mơ liên kết sợi dày, gần không thấy xuất tế bào viêm tân mạch Trong mô liên kết sợi thấy có xuất tế bào sợi nguyên bào sợi 60 KHUYẾN NGHỊ Nên có nghiên cứu sâu để tìm thời gian nồng độ hóa chất tối ưu cho quy trình khử protein H 2O2 NaClO để ứng dụng rộng rãi TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Khan S.N (2005) The biology of bone grafting J Am Acad Orthop Surg, 13(1), 77-86 Baldini N, De Sanctis M, Ferrari M (2011) Deproteinized bovine bone in periodontal and implant surgery Dent M ater, 27(1), 61-70 Becker W (1996) Clinical and histologic observations of sites implanted with intraoral autologous bone grafts or allografts 15 human case reports J Periodontol, 67(10), 25-33 Ekaterina K (2009) Histomorphometric study on healing of critical sized defect in rat calvaria using three different bovine grafts Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 9(5), 276-281 Stavropoulos A (2008) Deproteinized Bovine Bone Xenograft Musculoskeletal Tissue Regeneration: Biological Materials and Methods, W.S Pietrzak, Humana Press, Totowa, 119-151 Lei P (2015) A New Method for Xenogeneic Bone Graft Deproteinization: Comparative Study of Radius Defects in a Rabbit Model PLoS One, 2015 10(12) [online] Available at Stanko P (2013) Mesenchymal stem cells - a promising perspective in the orofacial cleft surgery Bratisl Lek Listy, 114(2), 2-50 Dimitriou R (2011) Bone regeneration: current concepts and future directions BMC Med, 9, 66-68 Baer W, Schaller P, Carl H.D (2002) Spongy hydroxyapatite in hand surgery-a five year follow-up J Hand Surg Br, 27(1), 3-101 Bauermeister A, Maatz R (1957) A method of bone maceration; results in animal experiments J Bone Joint Surg Am, 39(1), 66-153 Trịnh Bình (2002) Mơ liên kết thức - Mơ sụn - Mô xương Mô học, tái lần thứ 2, nhà xuất y học, Hà Nội, 142-189 Michael H.R (2011) bone Histology, a text and altlas, sixth edition, Wolters kluwer, Philadelphia, 218-223 Hall A.C.G, John E (2005) Bone and Its Relation to Extracellular Calcium and Phosphate Textbook of medical physiology, W.B Saunders, Philadelphia, 980 - 984 Clarke B (2008) Normal bone anatomy and physiology Clin J Am Soc Nephrol, 3(3), 9-131 DeLustro F (1990) Immune responses to allogeneic and xenogeneic implants of collagen and collagen derivatives Clin Orthop Relat Res, 19(2), 79-112 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Wagner-Ecker M (2013) The collagen component of biological bone graft substitutes promotes ectopic bone formation by human mesenchymal stem cells Acta Biomater, 9(7), 298-307 Poinern G.E (2009) Synthesis and characterisation of nanohydroxyapatite using an ultrasound assisted method Ultrason Sonochem, 16(4), 74-469 Bigi A (1997) Chemical and structural characterization of the mineral phase from cortical and trabecular bone J Inorg Biochem, 68(1), 45-51 LeGeros R.Z (1993) Biodegradation and bioresorption of calcium phosphate ceramics Clin Mater, 14(1), 65-88 Bohner M (2000) Calcium orthophosphates in medicine: from ceramics to calcium phosphate cements Injury, 31(4), 37-47 Wagoner J, Herschler B.A (2011) A review of the mechanical behavior of CaP and CaP/polymer composites for applications in bone replacement and repair Acta Biomater, 7(1), 16-30 Rho J.Y, Kuhn-Spearing L, Zioupos P (1998) Mechanical properties and the hierarchical structure of bone Med Eng Phys, 20(2), 92-102 Halliwell B (1989) Free Radicals in Biology and Medicine, 2nd 1989, Clarendon Press, Oxfor Cabiscol E, Tamarit J, Ros J (2000) Oxidative stress in bacteria and protein damage by reactive oxygen species Int Microbiol, 3(1), 3-8 Sies H (1993) Damage to plasmid DNA by singlet oxygen and its protection Mutat Res, 299(3), 91-183 Hallen L.G (1966) Heterologous transplantation with Kiel bone An experimental and clinical study Acta Orthop Scand, 37(1), 1-19 Wilppula E, Bakalim G (1972) Kiel bone in the surgical treatment of tibial condylar fractures Acta Orthop Scand, 43(1), 7-62 Termine J.D (1973) Hydrazine-deproteinated bone mineral Physical and chemical properties Calcif Tissue Res, 12(1), 73-90 Fattibene P (2006) EPR properties of intact and deproteinated dentin Radiat Prot Dosimetry, 120(1),20-126 Broz J.J (1997) Effects of deproteinization and ashing on site-specific properties of cortical bone J Mater Sci Mater Med, 8(6), 395-401 Chen P.Y (2011) Minerals form a continuum phase in mature cancellous bone Calcif Tissue Int, 88(5), 351-361 Phạm Thị Minh Đức (2007) Sinh lý máy tiêu hóa Sinh lý học, Nhà xuất y học, Hà Nội, 238-245 Nguyễn Quang Vinh, Phan Tuấn Nghĩa (2004), Thực tập hóa sinh học, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội Klokkevold P.R (2002) Advanced Implant Surgery and Bone Grafting Techniques Carranza's Clinical Periodontology, 9th edition, W.B Saunders, Philadelphia, - 23 Albrektsson T, Johansson C (2001) Osteoinduction, osteoconduction and osseointegration Eur Spine J, 10(2), 96-101 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 Wozney J.M, Rosen M (1998) Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair Clin Orthop Relat Res, 346, 26-37 da Silva R.C (2016) Radiographic and histological evaluation of ectopic application of deproteinized bovine bone matrix Ann Maxillofac Surg, 6(1), 9-14 Yuan H (2001) Bone formation induced by calcium phosphate ceramics in soft tissue of dogs: a comparative study between porous α-TCP and β-TCP Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 12(1), 7-13 Yuan H (2000) Tissue responses of calcium phosphate cement: a study in dogs Biomaterials, 21(12),1283-1290 Hofman S (1999) Effects of Laddec on the formation of calcified bone matrix in rat calvariae cells culture Biomaterials, 20(13), 66-72 Wetzel A.C, Stich H, Caffesse R.G (1995) Bone apposition onto oral implants in the sinus area filled with different grafting materials A histological study in beagle dogs Clin Oral Implants Res, 6(3), 63-88 Sculean A (2003) Healing of intrabony defects following treatment with a bovine-derived xenograft and collagen membrane A controlled clinical study J Clin Periodontol, 30(1), 73-80 Trường đại học y Hà Nội - Bộ môn miễn dịch - sinh lý bệnh (2015) Miễn dịch ghép Giáo trình miễn dịch học (dùng cho học viên sau đại học), Nhà xuất Đại học y Hà Nội, Hà Nội, 279-280 Cohen R.E (1994) Phenotypic characterization of mononuclear cells following anorganic bovine bone implantation in rats J Periodontol, 65(11), 15-18 Precheur H.V (2007) Bone graft materials Dent Clin North Am, 51(3), 4672 Sogal A, Tofe A.J (1999) Risk assessment of bovine spongiform encephalopathy transmission through bone graft material derived from bovine bone used for dental applications J Periodontol, 70(9), 63-72 Paknejad M (2015) Histologic Evaluation of Bone Healing Capacity Following Application of Inorganic Bovine Bone and a New Allograft Material in Rabbit Calvaria Journal of Dentistry, 12(1), 31-38 Ghiacci G, Graiani G (2016) "Over-inlay" block graft and differential morphometry: a novel block graft model to study bone regeneration and host-to-graft interfaces in rats J Periodontal Implant Sci, 46(4), 33-56 Richardson C.R (1999) Clinical evaluation of Bio-Oss: a bovine-derived xenograft for the treatment of periodontal osseous defects in humans J Clin Periodontol, 26(7), 8-42 Mellonig J.T (2000) Human histologic evaluation of a bovine-derived bone xenograft in the treatment of periodontal osseous defects Int J Periodontics Restorative Dent, 20(1), 19-29 51 52 53 54 55 56 Artzi Z, Tal H, Dayan D (2001) Porous bovine bone mineral in healing of human extraction sockets: Histochemical observations at months J Periodontol, 72(2), 9-15 van Steenberghe D (2000) The clinical use of deproteinized bovine bone mineral on bone regeneration in conjunction with immediate implant installation Clin Oral Implants Res, 11(3), 6-21 Valentini P, Abensur D.J (2003) Maxillary sinus grafting with anorganic bovine bone: a clinical report of long-term results Int J Oral Maxillofac Implants, 18(4), 60-67 Hallman M (2001) A clinical histologic study of bovine hydroxyapatite in combination with autogenous bone and fibrin glue for maxillary sinus floor augmentation Results after to months of healing Clin Oral Implants Res, 12(2), 43-53 Hallman M, Sennerby L, Lundgren S (2002) A clinical and histologic evaluation of implant integration in the posterior maxilla after sinus floor augmentation with autogenous bone, bovine hydroxyapatite, or a 20:80 mixture Int J Oral Maxillofac Implants, 17(5), 43-65 Maiorana C (2006) Sinus elevation with alloplasts or xenogenic materials and implants: an up-to-4-year clinical and radiologic follow-up Int J Oral Maxillofac Implants, 21(3), 32-46 ... giá hiệu ba phương pháp khử protein xương bò với hai mục tiêu: So sánh hiệu khử protein xương bò từ ba phương pháp khử protein khác Nhận xét khả dung nạp xương bò khử protein thỏ thực nghiệm... bột xương bò khử protein khác [5] Tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu phương pháp khử protein xương bò ứng dụng y học Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài Đánh giá hiệu ba phương pháp. .. tạo xương 15 1.3 Các phương pháp đánh giá hàm lượng protein xương Để xác định hàm lượng protein lại xương sau q trình xử lý, phương pháp sau thường lựa chọn: 1.3.1 Phương pháp Kjeldahl Phương pháp