BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA LH08 TRÊN MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM CHUỘT NHẮT TRẮNG SA SÚT TRÍ TUỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA LH08 TRÊN MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM CHUỘT NHẮT TRẮNG SA SÚT TRÍ TUỆ Chuyên ngành : Sinh lý học Mã số : 60720106 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG PGS TS ĐÀO THỊ VUI HÀ NỘI – 2018 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập tiến hành nghiên cứu, tơi nhận giúp đỡ tận tình từ thầy cô giáo, bạn đồng nghiệp, từ quan người thân gia đình Hồn thành luận văn này, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Thanh Hương - Phó trưởng Bộ mơn Sinh lý học, Trường Đại học Y Hà Nội PGS.TS Đào Thị Vui - Trưởng Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội người thầy, người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Dược lý Sinh hoá - Viện Dược liệu Trung ương giúp đỡ tham gia thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phịng Đào tạo Sau đại học, thầy giáo Trường Đại học Y Hà Nội nói chung thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý học nói riêng tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức quý báu cho tơi q trình học tập, nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Tổ chức cán bộ, Bộ môn Y học sở Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, người thân động viên, chia sẻ giúp đỡ trình học tập Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2018 Học viên Phan Thu Hằng LỜI CAM ĐOAN Tôi Phan Thu Hằng, học viên Cao học khóa 25, chuyên ngành Sinh lý học, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Thanh Hương, PGS TS Đào Thị Vui Công trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2018 Học viên Phan Thu Hằng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG, BIỂU ĐỒ, HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan sa sút trí tuệ 1.1.1 Khái niệm sa sút trí tuệ 1.1.2 Dịch tễ học sa sút trí tuệ 1.1.3 Yếu tố nguy sa sút trí tuệ 1.1.4 Phân loại sa sút trí tuệ 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh sa sút trí tuệ 1.1.6 Tổng quan trí nhớ .9 1.2 Thuốc điều trị sa sút trí tuệ 14 1.3 Vài nét chế phẩm LH08 15 1.4 Một số mơ hình gây sa sút trí tuệ động vật 23 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Hoá chất, thuốc, máy móc thiết bị phục vụ nghiên cứu 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Xây dựng mơ hình sa sút trí tuệ chuột nhắt trắng 35 2.3.2 Khảo sát tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ 38 2.3.3 Phương pháp tiến hành test hành vi định lượng thơng số sinh hố 41 2.4 Xử lý số liệu .50 2.5 Địa điểm nghiên cứu 50 2.6 Đạo đức nghiên cứu 50 Chương - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Kết xây dựng mơ hình gây sa sút trí tuệ chuột nhắt trắng 51 3.1.1 Kết xây dựng mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên .51 3.1.2 Kết xây dựng mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin 52 3.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ 60 3.2.1 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên 60 3.2.2 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin 61 Chương - BÀN LUẬN .67 4.1 Xây dựng mô hình gây sa sút trí tuệ chuột nhắt trắng 67 4.1.1 Xây dựng mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên 68 4.1.2 Xây dựng mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin .70 4.2 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ 79 4.2.1 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên 79 4.2.2 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin 80 4.3 Điểm mạnh điểm yếu đề tài 83 KẾT LUẬN 84 KIẾN NGHỊ 86 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A : Amyloid - beta ACh AChE AD APP : Acetylcholin : Acetylcholinesterase : Alzheimer (sa sút trí tuệ thể Alzheimer) : Amyloid Precursor Protein (protein tiền thân -amyloid) BACE1 : Beta-site APP cleaving enzyme (enzym phân tách APP vị trí beta 1) : International Classification of Diseases (Phân loại quốc tế bệnh tật) : Locomotor activity test (test vận động tự nhiên) : Malondialdehyd : N-methyl-D-aspartat : Passive avoidance test (test trốn tránh thụ động) : Sa sút trí tuệ : Transient vessel oclusion (kẹp động mạch cảnh hai bên) : Vascular dementia (sa sút trí tuệ mạch máu) : Y maze test (test mê lộ chữ Y) ICD LAT MDA NMDA PAT SSTT T2VO VD YMT DANH MỤC BẢNG Bảng Đánh giá mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh 51 Bảng Ảnh hưởng liều scopolamin test trốn tránh thụ động 52 Bảng 3 Ảnh hưởng liều scopolamin test mê lộ chữ Y 54 Bảng Đánh giá mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin mg/kg thông qua test trốn tránh thụ động 55 Bảng Đánh giá mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin mg/kg thơng qua test mê lộ chữ Y 56 Bảng Đánh giá mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin mg/kg thơng qua test vận động tự nhiên 57 Bảng Ảnh hưởng scopolamin lên hoạt độ enzym AChE 58 Bảng Ảnh hưởng scopolamin lên nồng độ MDA 59 Bảng Ảnh hưởng chế phẩm LH08 mô hình gây sa sút trí tuệ scopolamin thơng qua test trốn tránh thụ động 61 Bảng 10 Ảnh hưởng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin mg/kg thơng qua test mê lộ chữ Y 63 Bảng 11 Ảnh hưởng chế phẩm LH08 lên khả vận động chuột 64 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ Ảnh hưởng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên thông qua test mê lộ chữ Y cải tiến 60 Biểu đồ Ảnh hưởng chế phẩm LH08 lên hoạt độ AChE mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin 65 45 Xing S.H., Zhu C.X., Zhang R cộng (2014) Huperzine a in the treatment of Alzheimer’s disease and vascular dementia: a meta-analysis Evid Based Complement Altern Med, 2014, 363985 46 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Các tác giả khác (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học & kỹ thuật Hà Nội 47 Kukongviriyapan U., Luangaram S., Leekhaosoong K cộng (2007) Antioxidant and vascular protective activities of Cratoxylum formosum, Syzygium gratum and Limnophila aromatica Biol Pharm Bull, 30(4), 661-666 48 Maisuthisakul P., Gordon M.H., Pongsawatmanit R cộng (2007) Enhancing the oxidative stability of rice crackers by addition of the ethanolic extract of phytochemicals from Cratoxylum formosum Dyer Asia Pac J Clin Nutr, 16 Suppl 1, 37-42 49 Rios J.L (2011) Chemical constituents and pharmacological properties of Poria cocos Planta Med, 77(7), 681-91 50 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, tác giả khác (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 51 Ruffo M., Parisi O.I., Amone F cộng (2017) Calabrian Goji vs Chinese Goji: A Comparative Study on Biological Properties Foods Basel Switz, 6(4) 52 Chang J.-S., Lee Y.-J., Wilkie D.A cộng (2018) The Neuroprotective and antioxidative effects of submicron and blended Lycium barbarum in experimental retinal degeneration in rats J Vet Med Sci, 80(7), 1108-1115 53 Wang H.-B., Li Y.-X., Hao Y.-J cộng (2013) Neuroprotective effects of LBP on brain ischemic reperfusion neurodegeneration Eur Rev Med Pharmacol Sci, 17(20), 2760-2765 54 Li N., Liu C., Jing S cộng (2017) Compound SchisandraGinseng-Notoginseng-Lycium Extract Ameliorates Scopolamine-Induced Learning and Memory Disorders in Mice Evid-Based Complement Altern Med ECAM, 2017, 8632016 55 Dan H., Wu J., Peng M cộng (2011) Hypolipidemic effects of Alismatis rhizome on lipid profile in mice fed high-fat diet Saudi Med J, 32(7), 701-7 56 Gupta G., Chellappan D.K., Agarwal M cộng (2017) Pharmacological Evaluation of the Recuperative Effect of Morusin Against Aluminium Trichloride (AlCl3)-Induced Memory Impairment in Rats Cent Nerv Syst Agents Med Chem, 17(3), 196-200 57 Kwon D.H., Jeong J.W., Choi E.O cộng (2017) Inhibitory effects on the production of inflammatory mediators and reactive oxygen species by Mori folium in lipopolysaccharide-stimulated macrophages and zebrafish Acad Bras Cienc, 89(1 Suppl 0), 661-674 58 Kwon D.H., Cheon J.M., Choi E.O cộng (2016) The Immunomodulatory Activity of Mori folium, the Leaf of Morus alba L., in RAW 264.7 Macrophages In Vitro J Cancer Prev, 21(3), 144-151 59 Neha null, Sodhi R.K., Jaggi A.S cộng (2014) Animal models of dementia and cognitive dysfunction Life Sci, 109(2), 73-86 60 Viện Dược liệu Trung ương (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, NXB Khoa học & kỹ thuật 61 Zhao Q., Murakami Y., Tohda M cộng (2005) Preventive effect of chotosan, a Kampo medicine, on transient ischemia-induced learning deficit is mediated by stimulation of muscarinic M1 but not nicotinic receptor Biol Pharm Bull, 28(10), 1873-1878 62 Walrave L., Vinken M., Albertini G cộng (2016) Inhibition of Connexin43 Hemichannels Impairs Spatial Short-Term Memory without Affecting Spatial Working Memory Front Cell Neurosci, 10 63 Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V cộng (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity Biochem Pharmacol, 7(2), 88-95 64 Wasowicz W., Nève J., Peretz A (1993) Optimized steps in fluorometric determination of thiobarbituric acid-reactive substances in serum: importance of extraction pH and influence of sample preservation and storage Clin Chem, 39(12), 2522-2526 65 Liu B., Gao J.-M., Li F cộng (2018) Gastrodin Attenuates Bilateral Common Carotid Artery Occlusion-Induced Cognitive Deficits via Regulating Aβ-Related Proteins and Reducing Autophagy and Apoptosis in Rats Front Pharmacol, 9, 405 66 Kim D.H., Yoon B.H., Kim Y.-W cộng (2007) The seed extract of Cassia obtusifolia ameliorates learning and memory impairments induced by scopolamine or transient cerebral hypoperfusion in mice J Pharmacol Sci, 105(1), 82-93 67 Ahmadalipour A., Sadeghzadeh J., Samaei S.A cộng (2017) Protective Effects of Enriched Environment Against Transient Cerebral Ischemia-Induced Impairment of Passive Avoidance Memory and LongTerm Potentiation in Rats Basic Clin Neurosci, 8(6), 443-452 68 Bogachouk A.P., Storozheva Z.I., Telegin G.B cộng (2017) Studying the Specific Activity of the Amide Form of HLDF-6 Peptide using the Transgenic Model of Alzheimer’s Disease Acta Naturae, 9(3), 64-70 69 Xu J., Murakami Y., Matsumoto K cộng (2000) Protective effect of Oren-gedoku-to (Huang-Lian-Jie-Du-Tang) against impairment of learning and memory induced by transient cerebral ischemia in mice J Ethnopharmacol, 73(3), 405-413 70 Kakihana M., Yamazaki N., Nagaoka A (1984) Effects of idebenone (CV2619) on the concentrations of acetylcholine and choline in various brain regions of rats with cerebral ischemia Jpn J Pharmacol, 36(3), 357-363 71 Katsura M., Iino T., Kuriyama K (1992) Changes in content of neuroactive amino acids and acetylcholine in the rat hippocampus following transient forebrain ischemia Neurochem Int, 21(2), 243-249 72 Momtazi-Borojeni A.A., Sadeghi-Aliabadi H., Rabbani M cộng (2017) Cognitive enhancing of pineapple extract and juice in scopolamine-induced amnesia in mice Res Pharm Sci, 12(3), 257-264 73 Rahimzadegan M Soodi M (2018) Comparison of Memory Impairment and Oxidative Stress Following Single or Repeated Doses Administration of Scopolamine in Rat Hippocampus Basic Clin Neurosci, 9(1), 5-14 74 Lu C., Dong L., Lv J cộng (2018) 20(S)-protopanaxadiol (PPD) alleviates scopolamine-induced memory impairment via regulation of cholinergic and antioxidant systems, and expression of Egr-1, c-Fos and c-Jun in mice Chem Biol Interact, 279, 64-72 75 Ogunsuyi O.B., Ademiluyi A.O., Oboh G cộng (2018) Green leafy vegetables from two Solanum spp (Solanum nigrum L and Solanum macrocarpon L) ameliorate scopolamine-induced cognitive and neurochemical impairments in rats Food Sci Nutr, 6(4), 860-870 76 Ebert U Kirch W (1998) Scopolamine model of dementia: electroencephalogram findings and cognitive performance Eur J Clin Invest, 28(11), 944-949 77 Misane I Ogren S.O (2003) Selective 5-HT1A antagonists WAY 100635 and NAD-299 attenuate the impairment of passive avoidance caused by scopolamine in the rat Neuropsychopharmacol Off Publ Am Coll Neuropsychopharmacol, 28(2), 253-264 78 Wang X.-C., Xu Y.-M., Li H.-Y cộng (2018) Jiao-Tai-Wan Improves Cognitive Dysfunctions through Cholinergic Pathway in Scopolamine-Treated Mice BioMed Res Int, 2018, 3538763 79 Ravichandran V.A., Kim M., Han S.K cộng (2018) Stachys sieboldii Extract Supplementation Attenuates Memory Deficits by Modulating BDNF-CREB and Its Downstream Molecules, in Animal Models of Memory Impairment Nutrients, 10(7) 80 Dobryakova Y.V., Gurskaya O., Markevich V.A (2014) Participation of muscarinic receptors in memory consolidation in passive avoidance learning Acta Neurobiol Exp (Warsz), 74(2), 211-217 81 Popović M., Caballero-Bleda M., Benavente-García O cộng (2014) The flavonoid apigenin delays forgetting of passive avoidance conditioning in rats J Psychopharmacol Oxf Engl, 28(5), 498-501 82 Klinkenberg I Blokland A (2011) A comparison of scopolamine and biperiden as a rodent model for cholinergic cognitive impairment Psychopharmacology (Berl), 215(3), 549-566 83 Hong S.M., Soe K.H., Lee T.H cộng (2018) Cognitive Improving Effects by Highbush Blueberry (Vaccinium crymbosum L.) Vinegar on ScopolamineInduced Amnesia Mice Model J Agric Food Chem, 66(1), 99-107 84 Tabrizian K., Yaghoobi N.S., Iranshahi M cộng (2015) Auraptene consolidates memory, reverses scopolamine-disrupted memory in passive avoidance task, and ameliorates retention deficits in mice Iran J Basic Med Sci, 18(10), 1014-1019 85 Zhou J., Yang W., Suo D cộng (2018) Moringa oleifera Seed Extract Alleviates Scopolamine-Induced Learning and Memory Impairment in Mice Front Pharmacol, 86 Kim Y.H Park J.H (2017) Vanillin and 4-hydroxybenzyl alcohol attenuate cognitive impairment and the reduction of cell proliferation and neuroblast differentiation in the dentate gyrus in a mouse model of scopolamine-induced amnesia Anat Cell Biol, 50(2), 143-151 87 Sohanaki H., Baluchnejadmojarad T., Nikbakht F cộng (2016) Pelargonidin Improves Passive Avoidance Task Performance in a Rat Amyloid Beta25-35 Model of Alzheimer’s Disease Via Estrogen Receptor Independent Pathways Acta Med Iran, 54(4), 245-250 88 Sheng G., Zhang J., Gao S cộng (2018) SKF83959 Has Protective Effects in the Scopolamine Model of Dementia Biol Pharm Bull, 41(3), 427-434 89 Lam L.M.T., Nguyen M.T.T., Nguyen H.X cộng (2016) Anticholinesterases and memory improving effects of Vietnamese Xylia xylocarpa Chem Cent J, 10 90 Klinkenberg I Blokland A (2010) The validity of scopolamine as a pharmacological model for cognitive impairment: a review of animal behavioral studies Neurosci Biobehav Rev, 34(8), 1307-1350 91 Podolsky I.M., Shtrygol’ S.Y., Zubkov V.O (2018) The psycho- and neurotropic profiling of novel 3-(N-R,R′-aminomethyl)-2-methyl-1Hquinolin-4-ones in vivo Saudi Pharm J SPJ, 26(1), 107 92 Ionita R., Postu P.A., Beppe G.J cộng (2017) Cognitiveenhancing and antioxidant activities of the aqueous extract from Markhamia tomentosa (Benth.) K Schum stem bark in a rat model of scopolamine Behav Brain Funct BBF, 13(1), 93 Snyder H.M., Corriveau R.A., Craft S cộng (2015) Vascular contributions to cognitive impairment and dementia including Alzheimer’s disease Alzheimers Dement J Alzheimers Assoc, 11(6), 710-717 94 Guo H., Xu Y., Huang W cộng (2016) Kuwanon G Preserves LPS-Induced Disruption of Gut Epithelial Barrier In Vitro Mol Basel Switz, 21(11) 95 Shan X., Zhou J., Ma T cộng (2011) Lycium barbarum polysaccharides reduce exercise-induced oxidative stress Int J Mol Sci, 12(2), 1081-1088 96 Kim M.-S., Lee D.Y., Lee J cộng (2018) Terminalia chebula extract prevents scopolamine-induced amnesia via cholinergic modulation and anti-oxidative effects in mice BMC Complement Altern Med, 18 97 Zhou M.-M., Xue Y., Sun S.-H cộng (2016) Effects of different fatty acids composition of phosphatidylcholine on brain function of dementia mice induced by scopolamine Lipids Health Dis, 15(1), 135 98 Xie L., Jiang C., Wang Z cộng (2016) Effect of Huperzine A on Aβ-induced p65 of astrocyte in vitro Biosci Biotechnol Biochem, 80(12), 2334-2337 99 Qian Z.M Ke Y (2014) Huperzine A: Is it an Effective DiseaseModifying Drug for Alzheimer’s Disease? Front Aging Neurosci, 6, 216 100 Keowkase R Weerapreeyakul N (2016) Cratoxylum formosum Extract Protects against Amyloid-Beta Toxicity in a Caenorhabditis elegans Model of Alzheimer’s Disease Planta Med, 82(6), 516-523 101 Xiong J., Liu X.-H., Bui V.-B cộng (2014) Phenolic constituents from the leaves of Cratoxylum formosum ssp pruniflorum Fitoterapia, 94, 114-119 102 Yu M., Xu X., Jiang N cộng (2017) Dehydropachymic acid decreases bafilomycin A1 induced β-Amyloid accumulation in PC12 cells J Ethnopharmacol, 198, 167-173 103 Park Y.-H., Son I.H., Kim B cộng (2009) Poria cocos water extract (PCW) protects PC12 neuronal cells from beta-amyloid-induced cell death through antioxidant and antiapoptotic functions Pharm, 64(11), 760-764 104 Zhou L., Liao W., Chen X cộng (2018) An arabinogalactan from fruits of Lycium barbarum L inhibits production and aggregation of Aβ42 Carbohydr Polym, 195, 643-651 105 Ye M., Moon J., Yang J cộng (2015) The standardized Lycium chinense fruit extract protects against Alzheimer’s disease in 3xTg-AD mice J Ethnopharmacol, 172, 85-90 106 Mi X.-S., Feng Q., Lo A.C.Y cộng (2012) Protection of retinal ganglion cells and retinal vasculature by Lycium barbarum polysaccharides in a mouse model of acute ocular hypertension PloS One, 7(10), e45469 107 Rabbani M., Ghannadi A., Malekian N (2014) Evaluation of the effect of Cyperus rotundus L in scopolamine-induced learning deficit in mice Adv Biomed Res, 3, 217 108 Bhakta H.K., Park C.H., Yokozawa T cộng (2017) Potential anticholinesterase and β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme inhibitory activities of cornuside and gallotannins from Cornus officinalis fruits Arch Pharm Res, 40(7), 836-853 109 Lee K.Y., Sung S.H., Kim S.H cộng (2009) Cognitive-enhancing activity of loganin isolated from Cornus officinalis in scopolamineinduced amnesic mice Arch Pharm Res, 32(5), 677-683 110 Kuk E.B., Jo A.R., Oh S.I cộng (2017) Anti-Alzheimer’s disease activity of compounds from the root bark of Morus alba L Arch Pharm Res, 40(3), 338-349 111 Yu M.S., Lai C.S., Ho Y.S cộng (2007) Characterization of the effects of anti-aging medicine Fructus lycii on beta-amyloid peptide neurotoxicity Int J Mol Med, 20(2), 261-8 PHỤ LỤC Phụ lục I - Quy trình định lượng Acetylcholinesterase dịch nghiền đồng thể não Các bước thực Pha dung dịch đệm phosphat pH 7,5, 100 mM: Cân 1,12 g KH2PO4 14,95 g Na2HPO4.12H2O => Hòa tan 500 ml H2O => Pha 500 x = 15000 ml - Pha 100 ml đệm phosphat (ở trên) có chứa triton X 100 1,5% (1,5 ml) - Phần đệm lại tủ lạnh làm dung môi nghiền đồng thể dung môi pha chất Nghiền đồng thể: - Nghiền đồng thể điều kiện lạnh với ml dd đệm phosphat Xử lý dịch nghiền: - Hút xác 0,75 ml dịch nghiền đồng thể vào ống eppendorff có chứa sẵn 0,45 ml đệm phosphat - triton lạnh => ly tâm 0C với tốc độ 15000 rpm/30 phút - Hút 0,2 ml dịch vào ống eppendorff có chứa sẵn 0,8 ml đệm phosphat lạnh=> bảo quản lạnh chờ định lượng Chuẩn bị chất: - ACCI mM (M = 289,18): Hòa tan 26,1 mg 15 ml đệm phosphat - DTNB (M = 396,35): Hòa tan 23,9 mg 15 ml đệm phosphat Tiến hành phản ứng: - Thêm 100 ul đệm vào giếng - Thêm 30 ul dịch nghiền đồng thể vào giếng Lắc, ủ 25 oC 10 phút - Thêm 40 ul DTNB vào giếng Lắc, ủ phút - Thêm 30 ul ACCI vào giếng Lắc, ủ 25 oC, đo quang phút 10 phút bước sóng 412 nm Ghi Phụ lục II - Quy trình định lượng MDA dịch nghiền đồng thể não Thời gian Công việc Chuẩn bị: - 1,5 L dung dịch đệm phosphat 100 mM, pH 7,5 - 0,5 L dung dịch đệm phosphat 100 mM, pH 7,5 chứa triton X 100 1% - 62 ống eppendorff chứa 0,45 ml đệm phosphattriton => bảo quản lạnh - 62 ống eppemdorff chưa 0,8 ml đệm phosphat => bảo quản lạnh - Nghiền đồng thể não với ml đệm phosphat điều kiện lạnh - Hút xác 0,75 ml dịch nghiền đồng thể vào ống eppendorff có chứa sẵn 0,45 ml đệm phosphat - triton lạnh => ly tâm 40C với tốc độ 15000 rpm/30 phút => hút 0,2 ml dịch vào ống eppendorff có chứa sẵn 0,8 ml đệm phosphat lạnh => để định lượng AchE - Phần dịch nghiền đồng thể lại ống falcon thêm 40 µl BHT 0,5M (trong ethanol) => đem ly tâm lạnh (tốc độ 10000 rpm 15’) Hút 500 µl dịch sau ly tâm sang ống eppendorff có chứa sẵn 500 µl TBA 20% =>Ly tâm lạnh 10000 rpm 10’ - Bật nồi cách thủy - Pha dung dịch TBA 0,75 %: cân 0,75 g TBA pha 100 ml nước cất, siêu âm tan (chuẩn bị trước dùng) - Pha dãy chuẩn TMP: Người thực Thời gian Công việc + Hút 87,6µl TMP pha vđ với nước cất bình định mức 100 ml nước cất (A) => lắc kỹ + Hút 500 µl dd A pha vđ với đệm phosphat 0,1 M bình định mức 50 ml (C1) + ml C1 + 1ml nước cất = C2 + ml C2 + 1ml nước cất = C3 + ml C3 + 1ml nước cất = C4 + ml C4 + 1ml nước cất = C5 + ml C5 + 1ml nước cất = C6 - Chuẩn bị 70 ống nghiệm thủy tinh 10 ml có nắp, thêm vào ống thử: 750 µl phần dịch sau ly tâm + 750 µl TBA 0,75% Thêm vào ống chuẩn: 100 µl dung dịch chuẩn + 275 µl đệm phosphat 0,1M + 375 µl TCA 20% + 750 µl TBA 0,75% - Xếp ống nghiệm vào nồi cách thủy 95oC, ghi l ại thời gian - Sau 45’ đun cách thủy nhiệt độ >= 95oC, l tất ống nghiệm ra, ngâm nước lạnh - Ly tâm thường với tốc độ 3500 rpm 10 phút - Hút xác 200 µl mẫu vào đĩa 96 giếng (2 giếng/mẫu), đo quang bước sóng 532 nm Trường hợp mẫu đục sau ly tâm, thực quy trình chiết butanol Trong trường hợp mẫu đục sau ly tâm: - Thêm 3,5 ml n-butanol vào ống, lắc mạnh, ly tâm 5000 rpm phút - Hút khoảng 1,5 ml lớp n-butanol sau ly tâm vào ống eppendorff có chứa natri sulfat khan, ly tâm máy ly tâm nhỏ phút - Hút 200 µl mẫu vào giếng, lặp lại Người thực Thời gian Công việc giếng/mẫu đem đo quang 532 nm X Người thực Phụ lục III - Một số bảng kết Bảng Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên thơng qua test mê lộ chữ Y cải tiến Lơ thí nghiệm n Chứng sinh lý 11 Chứng bệnh 12 Chứng dương (tacrin mg/kg) 10 Lô thử liều (LH08 - 1100 mg/kg) 11 Lô thử liều (LH08 - 2200 mg/kg) 10 Tỷ lệ % thời gian khám phá cánh tay (%) 53,93 11,94 40,31 11,20 = 0,011 50,22 7,72 = 0,028 40,74 10,20 = 0,925 46,09 12,72 = 0,271 Kết biểu diễn dạng Mean SD, : so sánh với lô chứng sinh lý, : so sánh với lô chứng bệnh Bảng Tác dụng chế phẩm LH08 lên hoạt độ AChE mơ hình gây sa sút trí tuệ scopolamin Lơ thí nghệm n Chứng sinh lý 10 Chứng bệnh Chứng dương (donepezil mg/kg) Lô thử liều (LH08 - 1100 mg/kg) 10 Lô thử liều (LH08 - 2200 mg/kg) Lô thử liều (LH08 - 4400 mg/kg) Hoạt độ AChE (UI/ g não) 10,33 0,96 12,60 1,28 = 0,000 8,63 1,09 = 0,000 11,06 1,15 = 0,013 9,67 1,26 = 0,000 9,88 0,98 = 0,000 Kết biểu diễn dạng Mean SD, : so với lô chứng sinh lý, : so với lô chứng bệnh ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ PHAN THU HẰNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ CỦA LH08 TRÊN MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM CHUỘT NHẮT TRẮNG SA SÚT TRÍ TUỆ Chuyên ngành : Sinh lý học Mã số : 60720106... phục vụ nghiên cứu 33 2.3 Phương pháp nghiên cứu 34 2.3.1 Xây dựng mơ hình sa sút trí tuệ chuột nhắt trắng 35 2.3.2 Khảo sát tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ ... 4.2 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ 79 4.2.1 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình gây sa sút trí tuệ kẹp động mạch cảnh hai bên 79 4.2.2 Tác dụng chế phẩm LH08 mơ hình