BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LINH XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU NGHỆ VÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LINH MÃ SINH VIÊN: 1401368 XÂY DỰNG DẤU VÂN TAY HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU NGHỆ VÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Nguyễn Quỳnh Chi ThS Phạm Tuấn Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu – Đại học Dược Hà Nội Đại học Université catholique de Louvain – Vương quốc Bỉ HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình hồn thành khóa luận em nhận hỗ trợ giúp đỡ từ nhiều thầy cô, bạn bè gia đình Với tình cảm chân thành cho phép em gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tất cá nhân, tập thể tạo điều kiện cho em suốt trình học tập, nghiên cứu thực đề tài Trước hết, với lịng kính trọng biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Quỳnh Chi, ThS Phạm Tuấn Anh định hướng, bảo, giải đáp thắc mắc dìu dắt em trình học tập, nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn ThS Lê Thanh Bình, ThS Nguyễn Khắc Tiệp giúp đỡ, hỗ trợ em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới tồn thể thầy trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy anh chị kỹ thuật viên thuộc môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng ln tạo điều kiện tốt cho em trình nghiên cứu Xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể sinh viên nghiên cứu môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đồng hành, giúp đỡ, động viên tinh thần đưa nhiều góp ý trình thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè ln tin tưởng, chỗ dựa tinh thần nguồn động viên to lớn em suốt trình học tập, nghiên cứu trường Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Nguyễn Thị Linh MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Nghệ vàng Curcuma longa L 1.1.1 Vị trí, phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L 1.1.3 Thành phần hóa học thân rễ Nghệ vàng Curcuma longa L 1.1.4 Một số loài Curcuma L khác Việt Nam dễ nhầm lẫn với Nghệ vàng Curcuma longa L 1.2 Tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng 1.3 Vài nét dấu vân tay hóa học 1.3.1 Khái niệm dấu vân tay hóa học 1.3.2 Ứng dụng dấu vân tay hóa học 1.3.3 Một số nghiên cứu thiết lập dấu vân tay hóa học 1.3.4 Tình hình tiêu chuẩn hóa Nghệ vàng tinh dầu Nghệ vàng 10 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên liệu phương tiện nghiên cứu 12 2.1.1 Nguyên liệu 12 2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 13 2.1.2.1 Dung môi, hóa chất: 13 2.1.2.2 Trang thiết bị, máy móc: 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1 Thu mẫu Nghệ vàng xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu 14 2.2.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 14 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Thu mẫu nghiên cứu xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu 14 2.3.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 15 2.3.2.1 Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng 15 2.3.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 16 2.3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng 17 2.3.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 17 2.3.3.2 Đánh giá tác dụng hiệp đồng tinh dầu Nghệ vàng kháng sinh 18 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thu mẫu Nghệ vàng xác định hàm lượng tinh dầu mẫu nghiên cứu 21 3.2 Xác định dấu vân tay hóa học tinh dầu Nghệ vàng 22 3.2.1 Dấu vân tay sắc ký lớp mỏng tinh dầu Nghệ vàng 22 3.2.2 Dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 24 3.2.2.1 Phân tích mẫu tinh dầu Nghệ vàng GC/MS 24 3.2.2.2 Xác định dấu vân tay sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng 27 3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng 32 3.3.1 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) tinh dầu Nghệ vàng 32 3.3.2 Đánh giá tác dụng hiệp đồng tinh dầu Nghệ vàng kháng sinh 32 CHƯƠNG BÀN LUẬN 35 KẾT LUẬN 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: HÌNH ẢNH THÂN RỄ 20 MẪU NGHỆ VÀNG PHỤ LỤC 2: THÀNH PHẦN 19 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG TRONG NGHIÊN CỨU CỦA PHẠM THỊ KIỀU DUNG PHỤ LỤC 3: HÌNH ẢNH SẮC KÝ ĐỒ 20 MẪU TINH DẦU NGHỆ VÀNG DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT GC/MS Gas chromatography – mass spectrometry TLC Thin layer chromatography RI Retention index Rf Retention time MSSA Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus MIC Minimum inhibitory concentration MHB-Ca Cation-adjusted Muller Hinton Broth FIC Fractional inhibitory concentration HCA Hierarchical cluster analysis SKLM Sắc ký lớp mỏng DĐVN V Dược Điển Việt Nam V DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/ml) tinh dầu Nghệ vàng số chủng vi khuẩn Bảng 2.1: Thông tin 20 mẫu thân rễ Nghệ vàng 12 Bảng 3.1: Hàm lượng tinh dầu tính theo dược liệu tươi 21 Bảng 3.2: Kết phân tích thành phần tinh dầu mẫu: 25 Bảng 3.3: Kết phân tích thành phần tinh dầu mẫu: 26 Bảng 3.4: Giá trị MIC (nl/ml) mẫu tinh dầu Nghệ vàng : BN01, HN11, HN12, NA03, VP01, NT01, CM01 32 Bảng 3.5: Giá trị MIC tinh dầu Nghệ vàng kháng sinh 33 Bảng 3.6: Kết đánh giá tác dụng làm giảm MIC cefoxitin hai chủng vi khuẩn MRSA 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Mơ tả bố trí checkerboard đĩa 96 giếng 20 Hình 3.1: Sắc ký đồ mẫu tinh dầu Nghệ sau màu vanillin/ H2SO4 , quan sát ánh sáng thường 22 Hình 3.2: Sắc ký đồ mẫu BN01, NA03, HB01, HB02, HT01 23 Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh dầu Nghệ vàng mẫu BN01 27 Hình 3.4: Kết phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào thành phần có tinh dầu 28 Hình 3.5: Kết phân cụm 20 mẫu tinh dầu với biến đầu vào thành phần thường xuất tinh dầu 28 Hình 3.6: Kết phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào thành phần có tinh dầu 29 Hình 3.7: Kết phân cụm 39 mẫu tinh dầu với biến đầu vào thành phần thường xuất tinh dầu 30 Hình 3.8: Hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghệ vàng trồng phổ biến quen thuộc nhiều tỉnh thành khắp nước biết đến từ lâu loại gia vị hay vị thuốc sử dụng y học cổ truyền Ngày Nghệ vàng mặt hàng nông sản trọng canh tác nguồn nguyên liệu chủ yếu để khai thác curcuminoid – thành phần hoạt chất thân rễ Nghệ vàng sử dụng lưu hành phổ biến thị trường Bên cạnh curcuminoid thành phần nghiên cứu nhiều, năm gần tinh dầu Nghệ vàng quan tâm Nhiều nghiên cứu chứng minh tinh dầu từ thân rễ Nghệ vàng có nhiều hoạt tính sinh học bật tác dụng xua đuổi muỗi, đặc biệt chủng muỗi vector gây bệnh nghiêm trọng người sốt xuất huyết, sốt rét [14]; tác dụng ức chế diệt số chủng vi nấm gây bệnh da [1] số chủng nấm gây bệnh cho trồng [22], [36] Một số nghiên cứu công bố tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L cịn có khả ức chế phát triển số vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt với vi khuẩn Streptococcus mutans vi khuẩn tạo mảng bám gây sâu [28] Ngoài tinh dầu Nghệ cho kết tốt nghiên cứu sử dụng để bảo quản hoa tươi [5] Với nhiều hoat tính sinh học đáng ý, tinh dầu Nghệ vàng dần trở thành đối tượng tiềm để khai thác đưa sản phẩm thị trường Tuy nhiên, thành phần loại tinh dầu nói chung tinh dầu Nghệ nói riêng thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường, thổ nhưỡng, điều kiện canh tác, giống, kiểu gen, điều kiện thu hoạch bảo quản đặt yêu cầu cần phải có tiêu chuẩn tinh dầu Nghệ Hiện nay, DĐVN V bổ sung thêm chuyên luận tinh dầu Nghệ vàng nhiên tiêu kiểm nghiệm đặc biệt tiêu định tính sắc ký lớp mỏng cịn nhiều hạn chế Để góp phần bổ sung tiêu chuẩn chất lượng nâng cao giá trị tiềm tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L đề tài: “Xây dựng dấu vân tay hóa học đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng” thực với mục tiêu sau: Xác định dấu vân tay sắc ký lớp mỏng sắc ký khí tinh dầu Nghệ vàng Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Nghệ vàng Curcuma longa L 1.1.1 Vị trí, phân loại Theo hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (1987) [39], Nghệ vàng Curcuma longa L có vị trí phân loại sau: Giới thực vật - Plantae Ngành Ngọc Lan - Magoliophyta Lớp Hành - Liliopsida Phân lớp Hành - Liliidae Liên Gừng - Zingiberanae Bộ Gừng - Zingiberales Họ Gừng - Zingiberaceae Chi Nghệ - Curcuma Loài - Curcuma longa L 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Nghệ vàng Curcuma longa L Đặc điểm hình thái: Cây thảo sống nhiều năm, cao 0,6-1m Thân rễ phát triển thành củ hình trụ dẹt, bẻ cắt ngang có màu vàng, vàng sẫm, vàng cam đến vàng đỏ, mùi thơm Lá mọc thẳng từ thân rễ, phiến màu lục nhạt có hình bầu dục trái xoan, thn nhọn hai đầu, kích thước 40-45 x 15-18cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, uốn lượn; cuống có bẹ, bẹ rộng dài ơm vào tạo thành thân Cụm hoa hình trụ, mọc từ lên; bắc rời, màu nhạt, bắc hữu thụ phía đầu trịn, màu lục trắng nhạt, bắc bất thụ hẹp pha màu hồng tím nhạt đầu Đài hoa dạng chuông, đầu xẻ khơng đều; tràng màu trắng, thùy hình tam giác đều; cánh mơi gần trịn, màu vàng, phía chia thùy khơng rõ; nhị có bao phấn có cựa phần lồi trung đới ô, nhị lép bên dạng trái xoan rộng, dài bao phấn Bầu có lơng [3], [4], [8] Sinh thái: Cây ưa ẩm, ưa sáng, chịu bóng; có biên độ sinh thái rộng, thích nghi với nhiều vùng khí hậu khác nhau, từ khí hậu cận nhiệt đới đến khí hậu nhiệt đới điển hình Tồn phần mặt đất tàn lụi vào mùa đơng tỉnh phía bắc mùa khơ tỉnh phía nam Cây mọc lại vào mùa xn, có hoa sau Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu HN11 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu HN12 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu HN13 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu LC01 10 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu NB01 11 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu TH02 12 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu TQ01 13 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu TN02 14 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu VT01 15 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu VP02 16 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu VP01 17 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu H01 18 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu HN14 19 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu NA03 20 Hình ảnh SKĐ GC/MS mẫu NT01 ... Nghệ vàng 2.2.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng - Đánh giá tác dụng kháng khuẩn mẫu tinh dầu Nghệ vàng chủng vi khuẩn S aureus ATCC 25923 S aureus ATCC 33591 - Đánh giá tác dụng. .. nâng cao giá trị tiềm tinh dầu Nghệ vàng Curcuma longa L đề tài: ? ?Xây dựng dấu vân tay hóa học đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng? ?? thực với mục tiêu sau: Xác định dấu vân tay sắc... dầu Nghệ vàng (Hình 3.8; Hình 3.9) Hình 3.8: Hình ảnh dấu vân tay sắc ký tinh dầu Nghệ vàng 30 Hình 3.9: Sắc ký đồ 20 mẫu tinh dầu Nghệ vàng 31 3.3 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn tinh dầu Nghệ vàng