Triển khai mô hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm của thuốc và áp dụng đánh giá tác dụng của một số dược liệu

84 8 0
  • Loading ...
1/84 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 14/08/2019, 16:22

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ VÂN ANH TRIỂN KHAI MƠ HÌNH IN VITRO SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA THUỐC VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ VÂN ANH MÃ SINH VIÊN: 1401041 TRIỂN KHAI MƠ HÌNH IN VITRO SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA THUỐC VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Thu Hằng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo, gia đình, bạn bè người giúp đỡ, ủng hộ em thời gian vừa qua Trước hết em em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thu Hằng người ln tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cảm ơn ngồi kiến thức chun mơn em dạy phương pháp làm việc khoa học hiệu trung thực Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ DS Đinh Thị Kiều Giang anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực, chị Nguyễn Thị Xuyến anh chị Viện Dược Liệu tận tình giúp đỡ, bảo, tạo điều kiện cho em thời gian nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo mơn, phòng ban khác Trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em thời gian học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới người thầy dạy dỗ em suốt năm năm học tập mái trường Đại học Dược Hà Nội, cảm ơn thầy tận tâm với nghề, gương sáng lối sống đạo đức nghề nghiệp chúng em Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, chia sẻ khó khăn động viên em thực khóa luận Hà Nội, tháng năm 2019 Sinh viên Trần Thị Vân Anh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 1.1 Đại cương viêm 1.1.1 Khái niệm viêm 1.1.2 Nguyên nhân gây viêm 1.1.3 Cơ chế bệnh sinh viêm thành phần tham gia vào phản ứng viêm 1.2 Các đích tác dụng thuốc chống viêm 11 1.2.1 Enzym tham gia vào tổng hợp chất trung gian hóa học 12 1.2.2 Receptor cặp đôi với protein G 13 1.2.3 Cytokin thụ thể cytokin 13 1.2.4 Phân tử tương tác với tế bào 14 1.3 Mối quan hệ NO, lysosom bệnh viêm 15 1.3.1 Sự hình thành NO 15 1.3.2 Cơ chế hoạt động NO mối liên quan NO bệnh viêm 16 1.3.3 Cấu trúc chức hoạt động màng lysosom 17 1.3.4 Mối quan hệ bệnh viêm màng lysosom 18 1.4 Một số mơ hình in vitro nghiên cứu tác dụng chống viêm thuốc 18 1.4.1 Nghiên cứu tác dụng chống viêm mơ hình ổn định màng hồng cầu 18 1.4.2 Mơ hình ức chế giải phóng NO tế bào đại thực bào RAW 264.7 19 1.4.3 Mơ hình đánh giá ức chế biến tính protein 20 1.4.4 Mơ hình đánh giá ức chế enzym cyclooxygenase 5-lipooxygenase 20 1.5 Một số dược liệu có tiềm chống viêm nghiên cứu giới mơ hình in vitro 21 1.5.1 Các dược liệu có tiềm ức chế enzym LOX 22 1.5.2 Các dược liệu có tiềm ức chế biểu số cytokin tiền viêm 23 1.6 Thông tin số dược liệu dự án ARES thu hái tỉnh vùng núi phía Bắc 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 26 2.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu 26 2.2 Phương tiện nghiên cứu 27 2.2.1 Hóa chất 27 2.2.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 28 2.2.3 Dòng tế bào, hồng cầu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Phương pháp nghiên cứu 29 2.4.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 29 2.4.2 Triển khai mơ hình gây ly giải màng hồng cầu 29 2.4.3 Triển khai mơ hình định lượng NO giải phóng từ tế bào RAW 264.7 31 2.4.4 Áp dụng mơ hình triển khai để sàng lọc dược liệu chống viêm 35 2.4.5 Đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao dược liệu tiềm 37 2.5 Phương pháp xử lý số liệu 39 3.1 Kết triển khai mơ hình sàng lọc tác dụng chống viêm 40 3.1.1 Kết triển khai mơ hình gây ly giải màng hồng cầu 40 3.1.2 Kết triển khai mơ hình ức chế giải phóng NO tế bào đại thực bào Raw 264.7 42 3.2 Kết sàng lọc chọn dược liệu tiềm có tác dụng chống viêm 47 3.2.1 Kết sàng lọc tác dụng ổn định màng hồng cầu thuốc 47 3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế giải phóng NO tế bào RAW 264.7 mẫu dược liệu 48 3.2.3 Đánh giá độc tính mẫu dược liệu hai nồng độ khác mức độ sống tế bào RAW 264.7 49 3.3 Đánh giá tác dụng chống viêm cao dược liệu tiềm 50 3.3.1 Đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao toàn phần dược liệu tiềm mơ hình ổn định màng hồng cầu 50 3.3.2 Đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao tồn phần dược liệu tiềm mơ hình ức chế giải phóng NO 52 3.3.3 Đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao toàn phần dược liệu tiềm khả ức chế giải phóng TNF-α 55 4.1 Về kết triển khai mơ hình sàng lọc tác dụng chống viêm 57 4.1.1 Về kết triển khai mô hình gây ly giải màng hồng cầu 57 4.1.2 Về kết triển khai mơ hình giải phóng NO tế bào RAW 264.7 58 4.2 Về kết sàng lọc tác dụng chống viêm mẫu dược liệu có nguồn gốc từ Việt Nam 59 4.3 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm cao dược liệu tiềm 60 4.3.1 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ổn định màng hồng cầu 60 4.3.2 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mô hình ức chế giải phóng NO 61 4.3.3 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ức chế giải phóng TNF-α 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AA Acid arachidonic CAM Phân tử kết dính tế bào CD Cluster of differentiation CSM Phân tử đồng kích thích tế bào CNTF Ciliary neurotrophic factor CysLT Cysteinyl leucotrien CT-1 Cardiotrophin – ECM Chất bào EDRF Yếu tố nới lỏng nguồn gốc nội mô GPCR Thụ thể bắt cặp với protein G HETEs Acid hydroperoxyeicosateraenoic LTs Leucotrienes LIF Leukaemia inhibitory factor NOS Nitric oxid synthease NK Tế bào diệt tự nhiên TAX Thromboxan NAG-1 NSAID activated gen-1 MAP kinase Mitogen-activated protein kinase TNF-α Yếu tố hoại tử khối u PAF Yếu tố hoạt hóa tiểu cầu PGs Prostaglandins PLA2 Phospholipase A2 PPAR Peroxisome proliferator IL Interleukin IFN Interferon DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh viêm 11 Hình 1.2: Sơ đồ chế chống viêm NSAIDs glucocorticoid 12 Hình 1.3 Các đích tiềm thụ thể bắt cặp protein G 13 Hình 1.4 Các đích cytokin tiềm 14 Hình 1.5 Các đích tiềm CAM CSM 15 Hình 1.6 Sự hình thành NO 16 Hình 1.7 Sản phẩm NO mục tiêu tín hiệu trung gian NO 17 Hình 2.1: Quy trình chiết cao khơ tồn phần ethanol 27 Hình 2.2: Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 29 Hình 2.3 Sơ đồ khảo sát ảnh hưởng nồng độ LPS 32 Hình 3.1: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả ly giải màng hồng cầu 40 Hình 3.2 Ảnh hưởng diclofenac lên ổn định màng hồng cầu 42 Hình 3.3: Ảnh hưởng nồng độ chất kích thích LPS lên khả sinh NO tế bào Raw 264.7 43 Hình 3.4 Giá trị phần trăm tế bào sống sót tương ứng với nồng độ LPS khác 24h 44 Hình 3.5: Ảnh hưởng thời gian ủ với LPS lên khả giải phóng NO tế bào Raw 264.7 45 Hình 3.6 Ảnh hưởng Indomethacin đến khả giải phóng NO từ tế bào RAW 264.7 46 Hình 3.7 Ảnh hưởng Indomethacin lên phần trăm sống sót tế bào 46 Hình 3.8 Khả ổn định màng hồng cầu mẫu dược liệu 47 Hình 3.9 Khả ức chế sản sinh NO mẫu cao tồn phần hai nồng độ…48 Hình 3.10 Phần trăm tế bào sống sót mẫu 49 Hình 3.11 Khả ức chế ly giải màng hồng cầu cao toàn phần bọ mẩy nồng độ khác 51 Hình 3.12 Khả giải phóng NO tế bào RAW 264.7 mẫu cao toàn phần mẫu nồng độ khác 52 Hình 3.13 IC50 cao tồn phần mẫu Indomethacin mơ hình ức chế giải phóng NO 53 Hình 3.14 Phần trăm tế bào sống sót cao tồn phần mẫu (bọ mẩy) với nồng độ khác 54 Hình 3.15 Khả giải phóng TNF-α mẫu dải nồng độ khác 55 Khi tăng nồng độ lên 1µg/ml 5µg/ml lượng NO giải phóng tăng lên đáng kể tương ứng 115,668% 106,452% với phần trăm tế bào sống sót 81,086% 80,772% Tuy nhiên tăng lên đến 10µg/ml phần trăm giải phóng NO giảm 77,419% Ngun nhân nồng độ 10µg/ml gây độc tính cho tế bào phần trăm tế bào sống sót đạt 65,156% Dựa vào kết khảo sát cho thấy khơng có khác biệt khả giải phóng NO mật độ tế bào sống nồng độ 1µg/ml nồng độ 5µg/ml Tuy nhiên, tính phương diện kinh tế, đề tài chọn LPS với nồng độ 1µg/ml nồng độ nhỏ gây giải phóng NO cao có ý nghĩa thống kê so với mẫu trắng mà khơng gây độc tế bào cho thí nghiệm Nồng độ sử dụng nhiều nghiên cứu giới [22],[42],[65],[79],[81] Trong số nghiên cứu khác, nồng độ LPS tương ứng sử dụng 0,1µg/ml [57], [24]; nồng độ 0,5µg/ml [34]; nồng độ 5µg/ml [13] Ngồi ra, nghiên cứu Marta [53] nồng độ 1µg/ml LPS kích thích tế bào RAW 264.7 sản sinh lượng đáng kể chất trung gian TNF-α Ngoài yếu tố nồng độ, yếu tố thời gian yếu tố ảnh hưởng tới lượng NO tiết [5] Ở thời điểm 2h, 4h 6h lượng NO giải phóng khơng đáng kể so với mẫu trắng Bắt đầu thời điểm 24h phần NO sản sinh 127,558% Khi tăng thời gian lên 48h 72h phần trăm NO sản sinh tăng lên 209,076% 198,515% Đề tài chọn thời điểm kích thích LPS 24h thời điểm sớm gây giải phóng NO đáng kể so với mẫu trắng Kết tương đồng khảo sát nghiên cứu [5], áp dụng hầu hết mơ hình nghiên cứu [57],[22],[24],[34],[55],[65],[79],[81] 4.2 Về kết sàng lọc tác dụng chống viêm mẫu dược liệu có nguồn gốc từ Việt Nam Hiện không Việt Nam mà toàn giới, xu hướng phát triển thuốc có thành phần từ tự nhiên nghiên cứu chế tác động rõ ràng, tối ưu thành phần, có thử nghiệm ngày phát triển chúng mở hướng điều trị sử dụng thuốc đồng thời bổ sung, hỗ trợ thuốc tân dược Về kết sàng lọc dược liệu mơ hình ổn định màng hồng cầu Trong mẫu dược liệu, có mẫu (bọ mẩy) thể tác dụng ổn định màng hồng cầu rõ nồng độ 100µg/ml với phần trăm ức chế ly giải 88,351%; diclofenac nồng độ 100µg/ml ức chế ly giải 85,487% Kết sau đánh giá 59 thể khả ổn định màng hồng cầu mẫu diclofenac khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê Về kết sàng lọc dược liệu mơ hình ức chế giải phóng NO NO đích tác dụng nhiều thuốc chống viêm Ức chế giải phóng NO đại thực bào làm ngăn chặn trình viêm diễn Trong mẫu dược liệu, nồng độ 100µg/ml, mẫu mẫu 16 thể khả ức chế giải phóng NO đáng kể 65,376% 87,082% mà không gây ảnh hưởng tới tế bào (phần trăm tế bào sống sót ≥ 80%) Các mẫu lại khơng thể tác dụng ức chế sinh NO rõ ràng gây độc tế bào Mẫu 12 mẫu 18, phần trăm tế bào sống sót đạt 99% phần trăm ức chế giải phóng NO khơng đáng kể so với mẫu chứng Mẫu 10 15 thể phần trăm ức chế giải phóng NO 19,898% 47,214% % tế bào sống sót ≥ 80% Đối với mẫu 13, phần trăm giải phóng NO đạt 108,223% phần trăm tế bào sống sót ≤ 80% Dựa vào kết hai mơ hình sàng lọc, đề tài lựa chọn mẫu dược liệu tiềm để đánh giá sâu 4.3 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm cao dược liệu tiềm Từ hai mơ hình sàng lọc, đề tài chọn mẫu dược liệu tiềm đáp ứng đủ tiêu chí dược liệu tiềm 4.3.1 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ổn định màng hồng cầu Để đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao toàn phần mơ hình ổn định màng hồng cầu Thí nghiệm bố trí với mẫu cao tồn phần bọ mẩy mơ hình ổn định màng hồng cầu dải nồng độ khác nhau: 500µg/ml, 200µg/ml, 100µg/ml, 50µg/ml, 25µg/ml Khi tăng nồng độ từ 25µg/ml lên 200µg/ml phần trăm ức chế ly giải màng hồng cầu tăng từ 17,886% lên 88,415% Tuy nhiên, tăng từ 200µg/ml lên nồng độ 500µg/ml phần trăm ức chế ly giải màng hồng cầu khác khơng có ý nghĩa thống kê Tác dụng ổn định màng hồng cầu mẫu thể thông qua IC50 Giá trị IC50 theo phân tích inhibitor cao tồn phần bọ mẩy mơ hình ổn định màng hồng cầu 47,3µg/ml (26,31 - 85,02µg/ml), Diclofenac dùng làm chất đối chiếu có IC50 123,6µg/ml (75,7 – 201,7µg/ml) Bọ mẩy thuộc họ Verbenaceae, trồng thu hái nhiều năm nước châu Á Chúng có khả nhiệt, giải độc, lợi niệu, loại bỏ độc tố bị viêm ruột 60 [45] Rễ sử dụng thuốc chống viêm, thuốc giảm đau để điều trị cảm lạnh, sốt cao, viêm não B, đau nửa đầu, khó tiêu, viêm họng, viêm khớp dạng thấp [83], nghiên cứu có tác dụng chống viêm Zhang cộng vào năm 1993 [80] Trong vài nghiên cứu khác, người ta tìm thấy bọ mẩy có chứa hoạt chất acid phenolic, flavonoid có nhiều phận [82] Cây bọ mẩy có tác dụng ổn định màng hồng cầu thể khả ổn định màng lysosom Dịch chiết từ ức chế enzym gây viêm giải phóng từ lysosom bạch cầu trung tính vị trí viêm, làm hạn chế phản ứng viêm xảy Ổn định màng hồng cầu hay màng lysosom trình tồn vẹn màng có tác nhân gây viêm Các thuốc chống viêm có tác dụng chúng có tác dụng bảo vệ protein màng khỏi biến tính nhiệt Trong q trình viêm, enzym giải phóng từ lysosom vào cytosol gây tổn thương mô xung quanh, gây viêm Hầu hết loại thuốc chống viêm ổn định màng lysosom ức chế q trình viêm cách hạn chế giải phóng enzym từ lysosom Có số giả thiết thành phần flavonoid acid phenolic với tác dụng chống oxy hóa thể khả ổn định màng hồng cầu Màng tế bào hồng cầu chứa lipid giàu acid béo khơng bão hòa, chúng thường xun tiếp xúc với oxy mô khác dễ bị tổn thương oxy hóa Sự xâm lấn màng hồng cầu tác nhân oxy hóa dẫn đến tan máu Sự gắn kết flavonoid với màng hồng cầu có tác dụng ức chế peroxid hóa lipid đồng thời tăng cường tính tồn vẹn màng q trình ly giải [17] 4.3.2 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ức chế giải phóng NO Để đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao tồn phần mơ hình ức chế giải phóng NO, qua hiểu thêm chế chống viêm bọ mẩy Thí nghiệm bố trí với mẫu cao tồn phần bọ mẩy mơ hình ức chế giải phóng NO dải nồng độ khác nhau: 200µg/ml; 100µg/ml; 50µg/ml; 25µg/ml, 12,5µg/ml Tại nồng độ 12,5µg/ml 25µg/ml, phần trăm ức chế giải phóng NO 19,656%; 25,954% Khả ức chế giải phóng NO tăng dần theo nồng độ tăng nồng độ từ 25µg/ml lên 200µg/ml Giá trị IC50 theo phân tích inhibitor cao tồn phần bọ mẩy mơ hình ức chế giải phóng NO 48,41µg/ml (36,38 – 64,40µg/ml) Indomethacin dùng làm chất đối chiếu có IC50 46,36µg/ml (23,20 – 92,65µg/ml) Ngồi ra, Huan Liu cộng [46] chứng minh dịch chiết methanol 61 bọ mẩy có tác dụng chống oxy hóa ức chế giải phóng NO Trong bọ mẩy có chứa flavonoid clerodendrin, số alcaloid khung indol [1] Một số nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy, thành phần flavonoid bọ mẩy có tác dụng ức chế giải phóng NO Flavonoid có tác dụng ức chế enzym iNOS enzym quan trọng q trình tổng hợp NO, qua làm ức chế giải phóng NO từ đại thực bào q trình viêm [31] Ngồi ra, chứa hợp chất phenolic Các hợp chất có vai trò quan trọng ứng dụng y học [69] có thuộc tính chống độc, chống ung thư, kháng khuẩn [48] Trong thực vật, chất chống oxy hóa phenolic sản xuất kết trình trao đổi chất thứ cấp nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên tốt cho người [23] Chúng có tác dụng tốt chống viêm số bệnh tim mạch [74] 4.3.3 Về kết đánh giá tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ức chế giải phóng TNF-α Sự tăng nồng độ TNF-α có liên quan đến bệnh mạn tính viêm khớp dạng thấp, hen suyễn, xơ vữa động mạch Do đó, ức chế TNF-α mục tiêu quan trọng để điều trị bệnh viêm Để đánh giá sâu chế chống viêm bọ mẩy, tiến hành đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm mẫu mơ hình ức chế giải phóng TNF-α Thí nghiệm bố trí với mẫu cao tồn phần bọ mẩy mơ hình ức chế giải phóng TNF-α dải nồng độ khác nhau: 200µg/ml; 100µg/ml; 50µg/ml; 25µg/ml; 12,5µg/ml Khi tăng nồng độ từ 25µg/ml đến 100µg/ml lượng TNF-α giải phóng giảm dần có ý nghĩa thống kê Tại nồng độ 100µg/ml lượng TNF-α giảm lần so với nồng độ 25µg/ml; 12,5µg/ml Được biết ethanol dung môi tốt để chiết dược liệu đặc biệt hợp chất phenolic (bao gồm có tannin flavonoid) [25] Khả ức chế TNF-α tác dụng flavonoid polyphenol Ngồi khả ức chế giải phóng NO thơng qua ức chế enzym iNOS tổng hợp NO, hợp chất có khả ức chế cytokin tiết từ đại thực bào TNF-α, IL-1, giúp làm giảm tiến triển bệnh viêm [56] Thông qua nghiên cứu này, triển khai hai mơ hình mơ hình ổn định màng hồng cầu ức chế giải phóng NO, đồng thời sàng lọc dược tiềm đánh giá tác dụng dược liệu hai mơ hình triển khai Những kết góp phần tạo tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo, nhằm nghiên cứu sâu 62 chế chống viêm dược liệu tiềm cao phân đoạn dược liệu tiềm 63 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp với đề tài “Triển khai mơ hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm thuốc áp dụng đánh giá tác dụng số dược liệu tiềm năng”, thu kết sau: Đã triển khai mơ hình gây ly giải màng hồng cầu:  Xác định nhiệt độ thích hợp 54°C mà khả gây ly giải màng hồng cầu rõ so với mẫu trắng (p < 0,05) mà khơng gây biến tính hồng cầu  Xác định thời gian thích hợp 20 phút thời điểm sớm có khả gây ly gải màng hồng cầu có ý nghĩa thống kê so với mẫu trắng (p < 0,05) Đã triển khai mô hình định lượng NO giải phóng từ tế bào đại thực bào RAW 264.7  Xác định nồng độ LPS 1µg/ml nồng độ thích hợp mà có khả gây giải phóng NO rõ so với mẫu trắng (p < 0,05) mà không gây độc tế bào (phần trăm tế bào sống ≥ 80%)  Xác định thời gian gây kích thích LPS sớm 24h mà có khả giải phóng NO rõ so với mẫu trắng (p < 0,05) Áp dụng hai mơ hình triển khai để sàng lọc mẫu cao ethanol mẫu dược liệu thu hái tỉnh vùng núi phía Bắc chọn mẫu dược liệu tiềm  Trên mơ hình ổn định màng hồng cầu: Mẫu (bọ mẩy) với nồng độ 100µg/ml ức chế 88,351% khả ly giải màng hồng cầu Trong mẫu 10, 12, 13, 15 có khả ức chế khả ly giải màng hồng cầu < 60% Các mẫu 17, 18 ức chế 61,044%; 60,853% ly giải màng hồng cầu  Trên mơ hình ức chế giải phóng NO: hai nồng độ 100µg/ml 200µg/ml, có mẫu mẫu 15 ức chế khả giải phóng NO tế bào RAW 264.7 mà phần trăm tế bào sống sót ≥ 80%  Từ kết quả, chọn mẫu mẫu dược liệu thể khả ức chế ly giải màng hồng cầu rõ nồng độ 100µg/ml khả ức chế giải phóng NO tế bào RAW 264.7 mà không gây độc tế bào nồng độ Xác định mối tương quan liều tác dụng chống viêm bọ mẩy IC50 cao ethanol bọ mẩy 64  Trên mơ hình ổn định màng hồng cầu: khả ức chế ly giải màng hồng cầu tăng dần theo nồng độ dịch chiết từ 25µg/ml đến nồng độ 200µg/ml Tại nồng độ 200µg/ml 500µg/ml, mẫu thể ổn định màng hồng cầu đáng kể so với mẫu chứng IC50 cao ethanol bọ mẩy mô hình ổn định màng hồng cầu 47,3µg/ml (26,31 - 85,02µg/ml)  Trên mơ hình ức chế giải phóng NO tế bào RAW 264.7: khả ức chế giải phóng NO tăng dần theo nồng độ dịch chiết từ 25µg/ml đến nồng độ 200µg/ml Tại nồng độ 200µg/ml thể khả ức chế giải phóng NO rõ so với mẫu chứng IC50 cao ethanol bọ mẩy mơ hình ức chế sản sinh NO từ tế bào RAW 264.7 48,41µg/ml (36,38 – 64,40µg/ml)  Trên khả ức chế giải phóng TNF-α, mẫu thể khả ức chế tăng dần theo nồng độ từ 12,5µg/ml đến nồng độ 100µg/ml Tại nồng độ 200µg/ml 100µg/ml thể khả ức chế giải phóng TNF-α rõ so với mẫu chứng ĐỀ XUẤT Từ kết thu được, đề tài xin đề xuất:  Tiếp tục áp dụng mơ hình để sàng lọc dược liệu khác sử dụng dân gian để tìm dược liệu tiềm  Tiếp tục đánh giá tác dụng dược lý thực nghiệm cao phân đoạn bọ mẩy để xác định phân đoạn dịch chiết có tác dụng định hướng nghiên cứu hóa học theo tác dụng sinh học  Tiếp tục xác định khả chống viêm dược liệu tiềm mơ hình in vivo để hướng tới khả sử dụng điều trị bệnh liên quan đến viêm thuốc 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung,et al "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1-2", Nhà Xuất Bản Khoa Học Kỹ Thuật Dũng Nguyễn Trí (2016), "Mơ học phân tử" NXB Y Học Hồng Lê Thị Diễm (2002), "Góp phần tìm hiểu tác dụng chống viêm hoa Kim ngân (Lonicera Japonica thump caprioliaceae) kết hợp với anpha chymotrysin", Luận văn Thạc Sỹ Dược Học, Đại Học Dược Hà Nội Hương Nguyễn Thị Mai (2006), "Tổng quan hóa sinh viêm thuốc điều trị viêm", Khóa luận tốt nghiệp Dược Sỹ Đại Học - Đại Học Dược Hà Nội Lê Đình Tố, Nguyễn Trung Kiên, et al (2017), "Tối ưu hố mơ hình sàng lọc hợp chất kháng viêm tế bào macrophage RAW 264.7", Tạp chí Phát triển Khoa Học Công Nghệ, số 5, tr.18-26 Nga Lê Thị (2008), "Tổng quan mơ hình nghiên cứu tác dụng chống viêm thuốc", Trường Đại Học Dược Hà Nội Nhà xuất Y học (2006), "Hóa sinh cho thầy thuốc lâm sàng" Bộ mơn Dược Lý - trường Đại học Dược Hà Nội (2004 ), "Dược lý học, tập 2", tr.231-244, 255-260 Bộ môn Sinh Lý Học - Trường ĐH Y Hà Nội (2006), "Sinh Lý Học" NXB Y Học, tập 10 Roanh Lê Đình, Chủ Nguyễn Văn (2009), "Bệnh học viêm bệnh nhiễm khuẩn" NXB Y Học, tr 29 11 Roanh Lê Đình, Nguyễn Đình Mão (1997), "Bệnh học viêm nhiễm khuẩn" NXB Y Học, tr 1-132 12 "Thông tin ngắn điểm báo :Thuốc chống viêm không steroid hãng Merck", Tạp chí thơng tin dược lâm sàng, số 5-2003, tr.23-24 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 13 Amirghofran Z., Malek-Hosseini S., et al (2011), "Inhibition of nitric oxide production and proinflammatory cytokines by several medicinal plants", Iran J Immunol, 8(3), pp 159-69 14 Amujoyegbe O O., Agbedahunsi Joseph, et al (2012), In vitro evaluation of membrane stabilizing activities of leaf and root extracts of Calliandra portoricensis (JACQ) benth on sickle and normal human erythrocytes, pp 15 Anosike C A., Obidoa O., et al (2012), "Membrane stabilization as a mechanism of the anti-inflammatory activity of methanol extract of garden egg (Solanum aethiopicum)", Daru, 20(1), pp 76 16 Archer C B., Page C P., et al (1984), "Inflammatory characteristics of platelet activating factor (PAF-acether) in human skin", Br J Dermatol, 110(1), pp 4550 17 Asgary S., Naderi G., et al (2005), "Protective effect of flavonoids against red blood cell hemolysis by free radicals", Exp Clin Cardiol, 10(2), pp 88-90 18 Ballabio A (2016), "The awesome lysosome", EMBO Mol Med, 8(2), pp 73-6 19 Begum Nasreen, Srisailam Keshetti, et al (2016), Investigation of in vitro anti inflammatory and COX-2 inhibitory activity of root extracts of Berberis aristata 20 Berridge M V., Herst P M., et al (2005), "Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction", Biotechnol Annu Rev, 11, pp 127-52 21 Blonska M., Czuba Z P., et al (2003), "Effect of flavone derivatives on interleukin-1beta (IL-1beta) mRNA expression and IL-1beta protein synthesis in stimulated RAW 264.7 macrophages", Scand J Immunol, 57(2), pp 162-6 22 Castro J P., Ocampo Y C., et al (2014), "In vivo and in vitro anti-inflammatory activity of Cryptostegia grandiflora Roxb ex R Br leaves", Biol Res, 47, pp 32 23 Chun Sung-Sook, Vattem Dhiraj A., et al (2005), "Phenolic antioxidants from clonal oregano (Origanum vulgare) with antimicrobial activity against Helicobacter pylori", Process Biochemistry, 40(2), pp 809-816 24 Deng J S., Chi C S., et al (2011), "Antioxidant, analgesic, and antiinflammatory activities of the ethanolic extracts of Taxillus liquidambaricola", J Ethnopharmacol, 137(3), pp 1161-71 25 Do Q D., Angkawijaya A E., et al (2014), "Effect of extraction solvent on total phenol content, total flavonoid content, and antioxidant activity of Limnophila aromatica", J Food Drug Anal, 22(3), pp 296-302 26 Ferdous Md, Reyad-Ul-Ferdous Mohammad, et al (2014), Ex-Vivo antiinflammatory and antimicrobial activities of the leaves of Bauhinia acuminata 27 Funk C D (2001), "Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology", Science, 294(5548), pp 1871-5 28 Gashaw I., Ellinghaus P., et al (2011), "What makes a good drug target?", Drug Discov Today, 16(23-24), pp 1037-43 29 Ge W., Li D., et al (2015), "The Roles of Lysosomes in Inflammation and Autoimmune Diseases", Int Rev Immunol, 34(5), pp 415-31 30 Gonon A T., Erbas D., et al (2004), "Nitric oxide mediates protective effect of endothelin receptor antagonism during myocardial ischemia and reperfusion", Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286(5), pp H1767-74 31 Gutierrez-Venegas G., Ventura-Arroyo J A., et al (2014), "Flavonoids inhibit iNOS production via mitogen activated proteins in lipoteichoic acid stimulated cardiomyoblasts", Int Immunopharmacol, 21(2), pp 320-7 32 Howlader M A., Alam M., et al (2011), "Antinociceptive and anti-inflammatory activity of the ethanolic extract of Cymbidium aloifolium (L.)", Pak J Biol Sci, 14(19), pp 909-11 33 Issa A Y;, Volate S.R;, et al (2006), The role of phytochemicals in inhibition of cancer and inflammation: new directions and perspectives, J Food Composit Anal., pp 405-419 34 Jeong J W., Lee H H., et al (2014), "Ethanol extract of Poria cocos reduces the production of inflammatory mediators by suppressing the NF-kappaB signaling pathway in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages", BMC Complement Altern Med, 14, pp 101 35 Jimenez-Aspee F., Alberto M R., et al (2015), "Anti-inflammatory activity of copao (Eulychnia acida Phil., Cactaceae) fruits", Plant Foods Hum Nutr, 70(2), pp 135-40 36 Juvekar Archana, Sakat Sachin, et al (2009), In vitro antioxidant and antiinflammatory activity of methanol extract of Oxalis corniculata Linn, pp 37 Kardile Mahendra, Mahajan Umesh, et al (2016), "Membrane stabilization assay for anti-inflammatory activity yields false positive results for samples containing traces of ethanol and methanol" 38 Kardile Mahendra V, Mahajan Umesh B, et al (2016), "Membrane stabilization assay for anti-inflammatory activity yields false positive results for samples containing traces of ethanol and methanol", World journal of pharmacy and pharmaceutical Sciences, 5(3), pp 493-497 39 Kasschau M R., Byam-Smith M P., et al (1995), "Influence of pH and temperature on hemolysis by adult Schistosoma mansoni membranes", J Exp Zool, 271(4), pp 315-22 40 Keardrit Kittipong, Rujjanawate Chaiyong, et al (1991), "Analgesic, antipyretic and anti-inflammatory effects of Tacca chantrieri Andre" 41 Korhonen R., Lahti A., et al (2005), "Nitric oxide production and signaling in inflammation", Curr Drug Targets Inflamm Allergy", 4(4), pp 471-9 42 Lee M H., Lee J M., et al (2007), "In-vitro and in-vivo anti-inflammatory action of the ethanol extract of Trachelospermi caulis", J Pharm Pharmacol, 59(1), pp 123-30 43 Leelaprakash G, Dass S Mohan (2011), "Invitro anti-inflammatory activity of methanol extract of Enicostemma axillare", International Journal of Drug Development and Research, 3(3), pp 189-196 44 Leyva-López Nayely, Gutiérrez-Grijalva Erick, et al (2016), "Flavonoids as Cytokine Modulators: A Possible Therapy for Inflammation-Related Diseases" 45 Li Y., Zhao Q C., et al (2008), "Chemical constituents of Clerodendrum cyrtophyllum Turcz" 46 Liu Huan, Wang Lan, et al (2011), "Antioxidant and nitric oxide release inhibition activities of methanolic extract from Clerodendrum cyrtophyllum Turcz", Horticulture, Environment, and Biotechnology, 52(3), pp 309-314 47 Loi Vu Duc, Tung Bui Thanh, et al (2017), "Anti-Inflammatory and Anticancer Activities of Hedyotis capitellata Growing in Vietnam", World Journal of Medical Sciences 14 (2): 22-28, 2017 48 Luthria Dave (2008), "Influence of experimental conditions on the extraction of phenolic compounds from parsley (Petroselinum crispum) flakes using a pressurized liquid extractor" 49 Meng F., Lowell C A (1997), "Lipopolysaccharide (LPS)-induced macrophage activation and signal transduction in the absence of Src-family kinases Hck, Fgr, and Lyn", J Exp Med, 185(9), pp 1661-70 50 Mogana R, Teng-Jin K, et al (2013), "The medicinal timber Canarium patentinervium Miq.(Burseraceae Kunth.) is an anti-inflammatory bioresource of dual inhibitors of cyclooxygenase (COX) and 5-lipoxygenase (5-LOX)", ISRN biotechnology, 2013 51 Nworu Chukwuemeka, Akah Peter (2015), "Anti-inflammatory medicinal plants and the molecular mechanisms underlying their activities" 52 Omale James, Okafor P N (2008), "Comparative antioxidant capacity, membrane stabilization, polyphenol composition and cytotoxicity of the leaf and stem of Cissus multistriata" 53 Palacz Marta, Borkowska Paulina, et al (2017), "Effect of apigenin, kaempferol and resveratrol on the gene expression and protein secretion of tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin-10 (IL-10) in RAW-264.7 macrophages" 54 Palmer R M., Ferrige A G., et al (1987), "Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor", Nature, 327(6122), pp 524-6 55 Park E., Kum S., et al (2005), "Anti-inflammatory activity of herbal medicines: inhibition of nitric oxide production and tumor necrosis factor-alpha secretion in an activated macrophage-like cell line", Am J Chin Med, 33(3), pp 415-24 56 Peluso I., Raguzzini A., et al (2013), "Effect of flavonoids on circulating levels of TNF-alpha and IL-6 in humans: a systematic review and meta-analysis", Mol Nutr Food Res, 57(5), pp 784-801 57 Phuneerub P., Limpanasithikul W., et al (2015), "In vitro anti-inflammatory, mutagenic and antimutagenic activities of ethanolic extract of Clerodendrum paniculatum root", J Adv Pharm Technol Res, 6(2), pp 48-52 58 Posadas I., Terencio M C., et al (2000), "Co-regulation between cyclooxygenase-2 and inducible nitric oxide synthase expression in the time-course of murine inflammation", Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 361(1), pp 98106 59 R Sarveswaran, Jayasuriya W J A Banukie, et al (2017), "In vitro assays to investigate the anti-inflammatory activity of herbal extracts: A Review", World Journal of Pharmaceutical Research, pp 131-141 60 Ranasinghe P., Ranasinghe P., et al (2012), "In vitro erythrocyte membrane stabilization properties of Carica papaya L leaf extracts", Pharmacognosy Res, 4(4), pp 196-202 61 Rang H., Dale, M., Ritter, J., Gardner, P (1995), "Pharmacolog", New York, NY: Churchill Livingstone, pp 226-229 62 Reyad-ul-Ferdous Md, Azam Md Golam, et al (2014), "Phytochemical screening, in-vitro membrane stabilizing and thrombo-lytic activities of Lophopetalum javanicum", International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 5(2), pp 350 63 Ricciotti E., FitzGerald G A (2011), "Prostaglandins and inflammation", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 31(5), pp 986-1000 64 Ripoche J (2011), "Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases", Clin Res Hepatol Gastroenterol, 35(5), pp 353-7 65 Ryu S., Shin J S., et al (2013), "Echinocystic acid isolated from Eclipta prostrata suppresses lipopolysaccharide-induced iNOS, TNF-alpha, and IL-6 expressions via NF-kappaB inactivation in RAW 264.7 macrophages", Planta Med, 79(12), pp 1031-7 66 Samud A M., Asmawi M Z., et al (1999), "Anti-inflammatory activity of Crinum asiaticum plant and its effect on bradykinin-induced contractions on isolated uterus", Immunopharmacology, 43(2-3), pp 311-6 67 Sharma J N., Al-Omran A., et al (2007), "Role of nitric oxide in inflammatory diseases", Inflammopharmacology, 15(6), pp 252-9 68 Shen Diandian (2008), "Development of anti-inflammatory agents from the aromatic plants, Origanum spp and Mentha spp., and analytical methods on the quality control of bioactive phenolic compounds", New Brunswick, New Jersey 69 Shetty Kalidas (2004), "Role of proline-linked pentose phosphate pathway in biosynthesis of plant phenolics for functional food and environmental applications: a review", Process Biochemistry, 39(7), pp 789-804 70 Snyder S H., Bredt D S (1992), "Biological roles of nitric oxide", Sci Am, 266(5), pp 68-71, 74-7 71 Takebayashi J., Kaji H., et al (2007), "Inhibition of free radical-induced erythrocyte hemolysis by 2-O-substituted ascorbic acid derivatives", Free Radic Biol Med, 43(8), pp 1156-64 72 Tsong T Y., Kingsley E (1975), "Hemolysis of human erythrocyte induced by a rapid temperature jump", J Biol Chem, 250(2), pp 786-9 73 Turner Mark D., Nedjai Belinda, et al (2014), "Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research, 1843(11), pp 2563-2582 74 Wang Yuan-Chuen, Chuang Yueh-Chueh, et al (2008), "The flavonoid, carotenoid and pectin content in peels of citrus cultivated in Taiwan", Food Chemistry, 106(1), pp 277-284 75 Wu H., Denna T H., et al (2019), "Beyond a neurotransmitter: The role of serotonin in inflammation and immunity", Pharmacol Res, 140, pp 100-114 76 Xaus J., Comalada M., et al (2000), "LPS induces apoptosis in macrophages mostly through the autocrine production of TNF-alpha", Blood, 95(12), pp 3823-31 77 Yang T., Zhang A., et al (2006), "Nitric oxide stimulates COX-2 expression in cultured collecting duct cells through MAP kinases and superoxide but not cGMP", Am J Physiol Renal Physiol, 291(4), pp F891-5 78 Yoon J H., Baek S J (2005), "Molecular targets of dietary polyphenols with anti-inflammatory properties", Yonsei Med J, 46(5), pp 585-96 79 Yue G G., Chan B C., et al (2012), "Screening for anti-inflammatory and bronchorelaxant activities of 12 commonly used Chinese herbal medicines", Phytother Res, 26(6), pp 915-25 80 Zhang H.Q, C.J Huang, et al (1993), "Pharmacological studies of Clerodendrum cyrtophyllum Turcz J Guilin Med Colg 1:11-13 (in Chinese)" 81 Zhou J., Sun Y Y., et al (2017), "Prim-O-glucosylcimifugin Attenuates Lipopolysaccharideinduced Inflammatory Response Macrophages", Pharmacogn Mag, 13(51), pp 378-384 in RAW 264.7 82 Zhou J., Zheng X., et al (2013), "Optimization of ultrasonic-assisted extraction and radical-scavenging capacity of phenols and flavonoids from Clerodendrum cyrtophyllum Turcz leaves", PLoS One, 8(7), pp e68392 83 ZY Wu (2004), Flora Repubulicae Popularis Sinicae, Beijing: Science Press, pp 84 Liao J C Deng, J S., Chiu C S., et al (2012), "Anti-Inflammatory Activities of Cinnamomum cassia Constituents In Vitro and In Vivo", Evid Based Complement Alternat Med, 2012, pp 429320 85 Schwartz C., Eberle J U., et al (2016), "Basophils in inflammation", Eur J Pharmacol, 778, pp 90-5 ... Triển khai mơ hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm thuốc áp dụng đánh giá tác dụng số dược liệu với ba mục tiêu: Triển khai hai mô hình in vitro để sàng lọc dược liệu chống viêm Áp dụng. .. HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ VÂN ANH MÃ SINH VIÊN: 1401041 TRIỂN KHAI MÔ HÌNH IN VITRO SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA THUỐC VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... 2.4.4 Áp dụng mơ hình triển khai để sàng lọc dược liệu chống viêm 35 2.4.5 Đánh giá mối tương quan liều tác dụng chống viêm cao dược liệu tiềm 37 2.5 Phương pháp xử lý số liệu
- Xem thêm -

Xem thêm: Triển khai mô hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm của thuốc và áp dụng đánh giá tác dụng của một số dược liệu, Triển khai mô hình in vitro sàng lọc tác dụng chống viêm của thuốc và áp dụng đánh giá tác dụng của một số dược liệu

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn