1 A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Streptococcus suis (Liên cầu lợn) cầu khuẩn Gram dương có khả lây từ động vật (chủ yếu lợn) sang người qua thói quen ăn uống thực phẩm sống vết xây xước da trình giết mổ, chế biến thịt lợn Bệnh có khả thành dịch với tỷ lệ tử vong cao từ 12,8% đến 27,9% Bệnh nhân nhiễm S suis sau viện để lại di chứng nặng nề điếc từ 50% - 66,4%, rối loạn tiền đình (22,7%), số hoại tử cắt cụt chi Những biến chứng khả hồi phục, dẫn đến gánh nặng lớn sức khoẻ kinh tế cho bệnh nhân Tại Việt Nam, bệnh S suis vấn đề thời chuyên ngành Truyền Nhiễm yếu tố dịch tễ đặc biệt hậu lâm sàng nặng nề bệnh nhân khơng chẩn đốn điều trị sớm Bệnh xếp hàng thứ 6/10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc tử vong cao Hiện nay, tình trạng S suis kháng gần hồn tồn với kháng sinh hay sử dụng chăn nuôi dẫn đế nguy kháng thuốc vi khuẩn người Các gen kháng thuốc gen liên quan tới độc lực vi khuẩn nghiên cứu Thế giới Ở Việt Nam, nghiên cứu chủ yếu tập trung phía Nam Đến nay, bệnh lưu hành rộng rãi chưa có nghiên cứu nước đánh giá tổng thể đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, yếu tố tiên lượng số yếu tố độc lực vi khuẩn phân bố yếu tố thể lâm sàng Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu nhằm mục tiêu: Tìm hiểu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng thể bệnh Streptococcus suis gây người Xác định yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân bị bệnh Streptococcus suis Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh phát số gen kháng thuốc, gen độc lực Streptococcus suis TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Do phân bố thể lâm sàng vùng miền Việt Nam khác nên cần có tranh tổng quan đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân nhiễm S suis để từ giúp cho bác sĩ lâm sàng khơng bỏ sót, tiếp cận chẩn đoán điều trị đúng, giảm nguy tử vong cho bệnh nhân Ngoài ra, việc sử dụng kháng sinh chăn ni thiếu kiểm sốt dẫn đến tăng nguy S suis kháng thuốc người với xuất chủng có độc lực cao từ lợn khiến cho việc điều trị gặp nhiều khó khăn Bởi vậy, việc nghiên cứu kiểu gen, gen kháng thuốc, gen liên quan đến độc lực S suis người cần thiết CẤU TRÚC LUẬN ÁN Luận án có độ dài 124 trang Chia làm chương (Tổng quan: 30 trang; Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 23 trang; Kết quả: 32 trang; Bàn luận: 34 trang Có 40 bảng; biểu đồ; 10 hình; 115 tài liệu tham khảo (cả Tiếng Anh Tiếng Việt, 35% tài liệu từ năm 2014 trở lại đây) B NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm vi sinh vật chế gây bệnh Streptococcus suis Vào thập niên 1950, Streptococcus suis lần phát Anh Hà Lan gây bệnh lợn Vi khuẩn có hình cầu, bắt mầu gram dương, hiếu kị khí tuỳ tiện Vi khuẩn lây qua đường ăn uống thực phẩm sống vết xây xước da tiếp xúc với lợn nhiễm bệnh trình giết mổ, chế biến thực phẩm sống S suis phá vỡ rào cản biểu mô, tiếp cận tồn máu, xâm nhập lan tràn đến quan khác nhau, gây phản ứng viêm quan Ngồi ra, S suis có khả qua hàng rào máu-não xâm nhập vào hệ thần kinh trung ương gây bệnh cảnh viêm màng não 1.2 Dịch tễ học nhiễm streptococcus suis người Trên Thế giới, trường hợp nhiễm khuẩn S suis người mô tả vào năm 1968 Đan Mạch Từ đó, số lượng trường hợp bệnh báo cáo toàn giới tăng lên nhiều nước bao gồm: Hà Lan, Bỉ, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức, Thuỵ Điển, Canada Đặc biệt khu vực Châu Á Hồng Kông, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan Việt Nam chiếm 90,2% Bệnh có khả gây dịch, điển hình vụ dịch lớn Trung Quốc năm 1999 2005 với số người mắc lớn tỷ lệ tử vong cao Tại Việt Nam, trường hợp nhiễm S suis mô tả vào 11/1996 với bệnh cảnh viêm màng não Kể từ đó, ca bệnh S suis gây bệnh người báo cáo khắp miền đất nước Theo Cục y tế dự phòng – Bộ y tế, tính đến năm 2016, tỷ lệ mắc S suis người 0,007/100,000 dân, bệnh đứng hàng thứ 10 bệnh truyền nhiễm có tỷ lệ mắc tử vong cao 1.3 Các thể lâm sàng nhiễm S suis yếu tố tiên lượng tử vong Streptococcus suis gây bệnh người với bệnh cảnh lâm sàng đa dạng viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm khuẩn, viêm nội tâm mạc Trong đó, viêm màng não mủ S suis chiếm tỷ lệ 68% bệnh cảnh lâm sàng nhiễm khuẩn S suis quan sát toàn giới Điếc biến chứng thường gặp bệnh nhân viêm màng não S suis với tỷ lệ xung quanh 50%, khả hồi phục thấp Sốc nhiễm khuẩn thường diễn biến nhanh tỷ lệ tử vong cao từ 60% đến 80% tuỳ nghiên cứu Các yếu tố rối loạn đông máu, suy đa tạng, bệnh lý thời gian ủ bệnh ngắn yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân nhiễm S suis 1.4 Chẩn đoán điều trị bệnh nhân nhiễm Streptococcus suis Chẩn đoán nhiễm S suis thường dựa vào biểu lâm sàng viêm màng não (sốt, đau đầu, rối loạn ý thức, cứng gáy, buồn nôn, nôn…), nhiễm khuẩn huyết (sốt, đau mỏi cơ, ban xuất huyết hoại tử, mạch nhanh…) với xét nghiệm xác định ngun ni cấy PCR dương tính Điều trị đặc hiệu kháng sinh nhóm betalactam điều trị hỗ trợ khác thở máy, lọc máu… 1.5 Kháng kháng sinh yếu tố độc lực S suis S suis kháng gần hoàn tồn với kháng sinh sử dụng chăn ni tetracycline, erythromycin, số chủng bắt đầu kháng với ceftriaxon fluoroquinolone Các gen kháng thuốc, tìm thấy erm(B) (erythromycin), cat (chloramphenicol), tet(M), tet(O), tet(L) (tetracyclin) Các yếu tố độc lực chủ yếu S suis typ 2, typ lây bệnh trực tiếp từ động vật sang người Các nghiên cứu giới cho thấy có yếu tố độc lực bao gồm: protein phóng thích muramidase - protein muramidase-released protein (MRP) gen mrp mã hoá, suilysin gen sly mã hoá, yếu tố protein ngoại bào extracellular factor (EF) gen epf mã hoá 1.6 Kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên cứu S suis Cơng nghệ giải trình tự gen hệ đời thực tạo bước đột phá so với công nghệ Sanger thời gian, chất lượng chi phí cho trình giải trình tự gen Dựa vào việc giải tồn trình tự gen S suis giúp xác định typ huyết gây bệnh, xác định MLST (Multilocus sequence typing), gen kháng thuốc gen liên quan đến độc lực Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân: Bao gồm 221 bệnh nhân chẩn đoán nhiễm S suis thỏa mãn tiêu chuẩn sau: Tuổi > 16, khơng phân biệt giới tính Có biểu lâm sàng nhiễm khuẩn huyết và/hoặc viêm màng não Cấy máu/dịch não tủy và/hoặc PCR máu/dịch não tuỷ dương tính với S suis Đồng ý tham gia nghiên cứu 4 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân Bệnh nhân có thêm kết vi sinh sinh học phân tử nhiễm thêm vi khuẩn khác S suis Bệnh nhân có bệnh lý suy gan, suy thận trước bị bệnh Bệnh nhân đồng nhiễm HIV, HCV, HBV Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu thời điểm trình tiến hành nghiên cứu 2.2 Thiết kế nghiên cứu: Tiến cứu 2.3 Cỡ mẫu nghiên cứu: Chọn mẫu thuận tiện, lấy toàn bệnh nhân đáp ứng tiêu chuẩn chọn mục 2.1.1, điều trị Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương từ tháng 05/2015 đến tháng 05/2018 2.4 Phương pháp nghiên cứu Bệnh nhân sau chẩn đoán xác định nhiễm S suis phân vào nhóm: (1) Viêm màng não, (2) Nhiễm khuẩn huyết có viêm màng não (3) Sốc nhiễm khuẩn Tiến hành đánh giá, phân tích đặc điểm chung so sánh đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, yếu tố tiên lượng, gen kháng thuốc, gen độc lực, typ huyết (sero type), 2.4.1 Các bước tiến hành a) Mục tiêu nghiên cứu 1: Đánh giá đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng chung thể bệnh Streptococcus suis gây người – Các thể bệnh S suis gây người: Dựa vào biểu lâm sàng với kết nuôi cấy PCR loại bệnh phẩm tiến hành phân loại thể bệnh nghiên cứu sau:  Viêm màng não: bệnh nhân có biểu lâm sàng VMN + xét nghiệm nuôi cấy và/hoặc PCR dịch não tuỷ (+) với S suis  Nhiễm khuẩn huyết có viêm màng não: bệnh nhân lâm sàng có đồng thời biểu nhiễm khuẩn huyết viêm màng não với bệnh phẩm máu + dịch não tuỷ dương tính với S suis  Sốc nhiễm khuẩn: bệnh nhân có biểu lâm sàng sốc nhiễm khuẩn + xét nghiệm (nuôi cấy PCR máu và/hoặc dịch não tuỷ) dương tính với S suis  Các thể bệnh ghi nhận thống kê số lượng, phần trăm vẽ bảng biểu đồ biểu diễn phù hợp – Đặc điểm lâm sàng: Chúng tiến hành tìm hiểu đặc điểm lâm sàng chung toàn bệnh nhân nghiên cứu đặc điểm lâm sàng riêng thể bệnh So sánh đặc điểm riêng thể bệnh tiền sử phơi nhiễm (ăn uống, tiếp xúc ), triệu chứng (sốt, đau đầu, đau mỏi người, buồn nôn, nôn, ỉa chảy ), triệu chứng thực thể (rối loạn tri giác, gáy cứng, kernig ) – Đặc điểm cận lâm sàng: Chúng tiến hành ghi nhận so sánh số cận lâm sàng thể bệnh việc so sánh trung bình trung vị số xét nghiệm (sử dụng kiểm định bình phương, kiểm định Kruskal-wallis ) Các xét nghiệm làm bao gồm: xét nghiệm thường quy, xét nghiệm xác định nguyên gây bệnh, xét nghiệm theo dõi điều trị b) Mục tiêu nghiên cứu 2: Phân tích yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân bị bệnh Streptococcus suis Bệnh nhân nghiên cứu chia làm 02 nhóm dựa vào kết điều trị Nhóm sống: bệnh nhân điều trị khỏi bệnh nhân điều trị có kết tiến triển tốt, tồn trạng đỡ sau chuyển tuyển tuyến điều trị theo theo nguyện vọng bệnh nhân người nhà Nhóm tử vong: bệnh nhân tử vong bệnh viện bệnh nhân q trình điều trị bệnh khơng cải thiện, diễn biến nặng, không qua khỏi người nhà bệnh nhân xin để tử vong nhà Chúng sử dụng phân tích đơn biến đa biến đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng, tiền sử tiếp xúc, bệnh lý nhóm để tìm yếu tố tiên lượng tử vong bệnh nhân Kết điều trị: Tỷ lệ tử vong, số ngày điều trị trung bình, di chứng (điếc, liệt, tâm thần, hoại tử cắt cụt chi viện) c) Mục tiêu nghiên cứu 3: Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh phát số gen kháng thuốc, gen độc lực Streptococcus suis Chúng tiến hành xác định mức độ nhạy cảm S suis với kháng sinh kháng sinh đồ, đo MIC kĩ thuật E-test (thanh Etest hãng Biomerieux-Pháp) theo hướng dẫn CLSI M100 Xác định gen kháng thuốc, gen độc lực cũng, typ huyết kiểu gen theo MLST dựa vào phân tích trình tự gen S suis sau sử dụng kĩ thuật giải trình tự gen hệ máy Miseq, mồi chạy kít chuẩn bị thư viện NexteraXT hãng Illumia – Mỹ Kết kiểm tra, phân tích với chuyên gia Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford – Vương Quốc Anh đặt Hà Nội (OUCRU) 6 – Đánh giá mức độ nhạy cảm với kháng sinh S suis: xác định độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh thường sử dụng lâm sàng (ampicillin, penicillin, ceftriaxon, levofloxacin, linezolid, vancomycin) sử dụng chăn nuôi (erythromycin, clindamycin, tetracycllin) Tính tỷ lệ phần trăm kháng nhạy cảm – Xác định số gen kháng thuốc, plasmids gen độc lực: Chúng tiến hành xác định gen kháng thuốc, gen độc lực thông qua việc tìm ngân hàng liệu gen sau:  Với gen kháng: từ ARG-ANNOT (Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation), CARD (Comprehensive Antibiotic Resistance Database, Resfinder;  Với gen độc lực: từ VFDB (Virulence Factor Database); – Xác định typ huyết thanh, MLST (Multilocus sequencing type) phân loài: Xác định typ huyết cho S suis dựa vào vùng vỏ polysaccharide (capsular polysaccharide - CPS) – nơi mã hóa gen vùng locus cps cho tổng hợp chức sinh học Tiến hành tải sở liệu gen cps S suis từ hệ thống theo đường dẫn sau: https:// github.com/streplab/SsuisSerotyping_pipeline Xác định phân loại MLST chủng S suis phân lập dựa vào gen chức (gen giữ nhà-house keeping gene) Đem so sánh với sở liệu trang web: http://www.mlst.net S suis  Tiến hành phân tích phân bố typ huyết kiểu gen thể bệnh lâm sàng phân bố chung tồn nhóm nghiên cứu  So sánh trình tự tồn bộ gen chủng MSLT với với chủng tham chiếu 2.5 Các tiêu chuẩn, kĩ thuật sử dụng nghiên cứu – Tiêu chuẩn chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết sốc nhiễm khuẩn: Theo Surviving Sepsis Campaign (2012) – Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm màng não lâm sàng: Theo Principles and Practice of Infectious Diseases (2013) – Tiêu chuẩn chẩn đoán nghiện rượu: Theo thang điểm AUDIT-C WHO (2001) phát triển Frank (2008) Bệnh nhân chẩn đốn nghiện rượu có tổng điểm ≥ nam ≥ nữ – Kĩ thuật xác định Streptococcus suis Realtime PCR: Sử dụng cặp mồi probe cho gene cps2 để xác định S suis Primers:  cps2JF (5’- GGTTACTTGCTACTTTTGATGGAAATT-3’)  cps2JR (5’-CGCACCTCTTTTATCTCTTCCAA-3’) o Probe: (FAM-TCAAGAATCTGAGCTGCAAAAGTGTCAAATTGATAMRA) Hãng Bioresearch (Mỹ) + Máy sử dụng: 7500 Fast Realtime PCR (Applied Biosystem – Mỹ) + Qui trình Realtime PCR cho gen cps2 (theo quy trình khoa xét nghiệm Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới TW OUCRU Hà Nội – Kĩ thuật nuôi cấy, định danh S sui: Thiết bị: Máy cấy máu Bactec 9050/9120: Bactec Dickinson, Mỹ; số máy móc Anh, Đức, Pháp; Môi trường thạch máu cừu, Socola (Oxoid, Anh) Tiến hành định danh vi khuẩn hệ thống máy Vitek compact Biomeriux, Pháp – Kĩ thuật kháng sinh đồ xác định MIC E-test: Sử dụng thiết bị dải giấy kháng sinh (E-test): hãng Bio merieux, Pháp Diễn giải báo cáo kết (theo CLSI M100) – Kỹ thuật giải trình tự gen hệ phân tích số liệu sử dụng phần mềm tin sinh học: Theo quy trình thực Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford Anh 2.6 Thu thập số liệu: Số liệu thu thập thông qua bệnh án nghiên cứu mẫu thiết kế sẵn 2.7 Phân tích xử lí số liệu: Số liệu nghiên cứu phân tích xử lý phần mềm SPSS 16.0, STATA với thuật toán ứng dụng 2.8 Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương 2.9 Thời gian nghiên cứu: năm từ tháng 05/2015 đến tháng 05/2018 2.10 Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu thông qua hội đồng y đức trường Đại học Y Hà Nội hội đồng y đức Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương o Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Trong thời gian nghiên cứu có 221 bệnh nhân thoả mãn tiêu chuẩn Nam giới chiếm chủ yếu (92%) Tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 53,5 tuổi, nhóm tuổi từ 40 – 60 chiếm tỷ lệ cao 69,23% Bệnh chủ yếu xuất từ tháng đến tháng 10 hàng năm 3.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 3.1.1 Đặc điểm chung nhóm nghiên cứu – Đặc điểm tình trạng phơi nhiễm Bảng 3.1 Tình trạng phơi nhiễm Tiền sử phơi nhiễm Tần số (n=221) Tỉ lệ % Phơi nhiễm qua tiếp xúc 59 26,70 41 18,55  Giết mổ lợn 11 4,98  Chế biến thực phẩm sống 3,17  Chăn nuôi lợn Phơi nhiễm qua ăn uống 46 20,81 41 18,55  Ăn tiết canh 2,26  Ăn thực phẩm sống khác Ăn uống + tiếp xúc 12 5,43 Không rõ 104 47,06 Có 117 bệnh nhân (chiếm tỷ lệ 52,94%) có tiền sử phơi nhiễm với nguồn lây Trong đó, ăn tiết canh lợn chiếm tỉ lệ cao với 23,08% Có 47,06% bệnh nhân khơng rõ tiền sử phơi nhiễm 3.1.2 Đặc điểm lâm sàng – Các thể lâm sàng 18.10% 46.15% 35.75% Viêm màng não NKH có VMN Sốc nhiễm khuẩn Biểu đồ 3.1 Các thể lâm sàng bệnh Phần lớn bệnh nhân nghiên cứu viêm màng não NKH có VMN 35,8% sốc nhiễm khuẩn chiếm 18,1% Bảng 3.2 Triệu chứng chung Triệu chứng Số BN (n=221) Tỷ lệ % Sốt 221 100 Đau đầu 197 89,14 Rét run 151 68,33 Buồn nôn 139 62,90 Nôn 132 59,73 Đau mỏi 121 55,00 Triệu chứng hay gặp bệnh nhân nhiễm S suis sốt, đau đầu rét run Bảng 3.3 Triệu chứng thể NKH có Sốc nhiễm p VMN khuẩn Triệu chứng n=102 n=79 n=40 (%) (%) (%) 102 79 40 Sốt (100) (100) (100) 63 53 35 Rét run 0,01 (61,76) (67,09) (87,50) 52 43 26 Đau mỏi 0,35 (51,49) (54,43) (65,00) 96 72 29 Đau đầu 0,001 (94,12) (91,14) (72,5) 76 49 14