BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - BÙI ĐỨC THẮNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ KẾT QUẢ NHỎ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) Ở THẠCH THẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI - - BÙI ĐỨC THẮNG 1401571 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BỒ KẾT QUẢ NHỎ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) Ở THẠCH THẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển ThS Trần Văn Thành Nơi thực Bộ môn Dƣợc học cổ truyền HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu thực đề tài, thời điểm hồn thành khóa luận lúc tơi xin phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển – Trƣởng môn Dƣợc học cổ truyền – ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, quan tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu ThS Phạm Thị Anh, DS Trần Văn Thành bên cạnh bảo, hƣớng dẫn giúp đỡ đồng hành suốt thời gian thực đề tài ThS Nghiêm Đức Trọng – môn Thực vật - Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi nghiên cứu hồn thành luận văn Các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc học cổ truyền, Bộ môn Thực vật trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình làm nghiên cứu thực khóa luận Các thầy, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, trang bị đầy đủ kiến thức động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu trƣờng Cuối tơi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới bạn, anh chị em làm đề tài chuyên đề Dƣợc liệu – Dƣợc học cổ truyền, ln đồng hành, chia sẻ, động viên, khích lệ tơi q trình học tập nghiên cứu giúp tơi hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 17 tháng 05 năm 2019 Sinh viên Bùi Đức Thắng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Gleditsia 1.1.1 Thực vật học 1.1.2 Thành phần hóa học 1.2 Tổng quan loài Gleditsia australis 1.2.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.2.2 Thành phần hóa học 1.2.3 Công dụng tác dụng sinh học CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1 Nguyên liệu phƣơng tiện nghiên cứu 10 2.1.1 Nguyên liệu 10 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 10 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 2.2.1 Nghiên cứu thực vật học 11 2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 11 CHƢƠNG III KẾT QUẢ 22 3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 22 3.1.1 Đặc điểm hình thái 22 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu 25 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu 26 3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 27 3.2.1 Định tính 28 3.2.2 Chiết xuất phân lập hợp chất 33 3.2.3 Xác định cấu trúc FG1 36 BÀN LUẬN 39 Về thực vật 39 Về hóa học 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR H-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Proton Magnetic Resonance Spectroscopy D/c Dịch chiết Dd Dung dịch DĐVN Dƣợc điển Việt nam EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol HPLC High Performance Liquid Chromatography HPTLC High Performance Thin Layer Chromatography MeOH Methanol NMR Nuclear magnetic resonance TĐ Tƣơng đƣơng TLC Thin Layer Chromatography TPHH Thành phần hóa học TT Thuốc thử UV Ultra Violet DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Kết định tính sơ nhóm chất Bồ kết (Fructus gleditsiae australis) phản ứng hóa học thƣờng quy 27 Bảng Kết phân tích sắc kí đồ 29 Bảng 3 Dữ liệu phổ 1H-NMR phổ 13C-NMR chất FG1 35 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Gleditsia australis F B Forbes & Hemsley Hình Sơ đồ chiết xuất cao tổng cao toàn phần 19 Hình Thân cành mang hoa Bồ kết thực địa 22 Hình Một số đặc điểm hình thái Bồ kết 23 Hình 3 Một số đặc điểm hình thái hoa Bồ kết 23 Hình Fructus Gleditsiae australis 24 Hình Vi Phẫu Bồ kết (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) 25 Hình Đặc điểm bột Bồ kết (Fructus Gleditsiae australis) 26 Hình Bản mỏng sắc kí bƣớc sóng 30 Hình Phân tích sắc kí đồ 31 Hình Số lƣợng pic săc kí đồ chuẩn Vitexin (A) cao Bồ kết (B) 31 Hình 10 Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethyl acetat Bồ kết bỏ hạt 34 Hình 11 Công thức cấu tạo acid oleanolic 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thƣ Chủ tịch Hồ Chí Minh gửi Hội nghị cán Y tế ngày 27 tháng 02 năm 1955 có viết “Ơng cha ta ngày trƣớc có nhiều kinh nghiệm quý báu cách chữa bệnh thuốc ta, thuốc bắc Để mở rộng phạm vi y học, cô nên trọng nghiên cứu phối hợp thuốc “đơng” “tây”,…” Sau gần 65 năm, xu hƣớng sâu nghiên cứu tìm kiếm hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ loài thực vật làm dƣợc phẩm chữa bệnh ngày thu hút đƣợc quan tâm nhà khoa học ƣu điểm chúng khơng độc có độc tính, dễ hấp thu chuyển hóa thể Việc sử dụng chi Gleditsia làm thuốc có từ 2000 năm trƣớc Bên cạnh việc kết hợp với kinh nghiệm tác phẩm kinh điển đƣợc viết danh y Trung Quốc nhƣ Thần Nông thảo kinh, Thang Dịch Bản Thảo, Đƣờng Bản Thảo, , nhà khoa học ngày tập trung nghiên cứu nhằm tìm hoạt chất, tác dụng dƣợc lý chi Gleditsia giúp cải thiện chất lƣợng sống ngƣời Mặc dù có nhiều nghiên cứu khoa học chi Gleditsia, song nghiên cứu chủ yếu tập trung vào loài nhƣ Gleditsia sinensis, Gleditsia japonica, Gleditsia tricanthos có nghiên cứu loài Gleditsia australis – loài Bồ kết đƣợc tìm thấy nhiều Việt Nam Cây bồ kết (Gleditsia australis Hemsl.) mọc hoang miền Bắc miền Nam nƣớc ta với trữ lƣợng lớn Trong y học đại, số bệnh viện dùng bồ kết chữa bí đại, trung tiện sau mổ, tắc ruột, dùng cho trẻ em ngƣời lớn Quả bồ kết đƣợc dùng trƣờng hợp trúng phong, hôn mê bất tỉnh, cấm khẩu, hen suyễn, mụn nhọt, viêm tuyến vú, đau nhức Những nghiên cứu tác dụng dƣợc lý cho thấy bồ kết có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhƣ kháng tràng cầu khuẩn, trực khuẩn lỵ shigella, trực khuẩn thƣơng hàn, trực khuẩn mủ xanh phẩy khuẩn tả Chính lý đó, nhằm mục đích tìm hiểu đặc điểm thực vật thành phần hóa học Bồ kết, để có thêm tri thức nâng cao giá trị sử dụng thuốc, thực đề tài: "Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học Bồ kết nhỏ (Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl.) Thạch Thất" với mục tiêu: Mơ tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học Bồ kết nhỏ mơ tả đặc điểm vi học Định tính nhóm chất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất có Bồ kết CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Gleditsia 1.1.1 Thực vật học 1.1.1.1 Vị trí phân lồi Chi Gleditsia đƣợc phân loại nhƣ sau: Giới (Kingdom) Thực vật (Planta) Ngành (Phylum) Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp (Class) Phân lớp (Subclass) Bộ (Order) Ngọc lan (Magnoliophyta) Hoa hồng (Rosidae) Đậu (Fabales) Họ (Family) Phân họ (Sub-family) Đậu (Fabaceae) Vang (Caesalpinioideae) Chi (Genus) 1.1.1.2 Bồ kết (Gleditsia) [1-3] Đặc điểm thực vật Theo thực vật chí Trung Quốc, chi Gleditsia đƣợc miêu tả nhƣ sau: rụng bụi, thân cành thƣờng có gai nhọn, cuống có rãnh; lá, thƣờng chét, có mép hình cƣa nhọn tròn; kèm nhỏ, rụng sớm; hoa đơn tính lƣỡng tính, xanh lục trắng xanh, thƣờng mọc kẽ lá, cụm hoa chùm chùy; bẹ hình sợi, mặt ngồi có lơng, mặt nhẵn; cánh hoa – 5, dài đài thùy; nhị hoa – 10, nhơ ngồi; bầu trên, khơng cuống cuống ngắn, vòi nhụy ngắn, đầu nhụy nằm đỉnh; hay nhiều nỗn; có vỏ dẹt, thẳng, uống cong hình xoắn, hay nhiều hạt hình trứng hình elip, dẹt gần hình trụ [17] 1.1.1.3 Phân bố Phần lớn loài thuộc chi Gleditsia đƣợc tìm thấy vùng Đơng Nam Á, Bắc Mỹ, Đơng – Nam Mỹ phía Nam Caucasus [14], [17], [20] KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Về đặc điểm thực vật - Đã mô tả đặc điểm hình thái, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu đƣợc thu hái xã Kim Quan, huyện Thạch Thất, Hà Nội loài Gleditsia australis F B Forbes & Hemsl - Đã mô tả đƣợc đặc điểm vi phẫu đặc điểm bột Bồ kết Fructus Gleditsia australis F B Forbes & Hemsl Về thành phần hóa học - Đã định tính nhóm chất hữu dƣợc liệu Bồ kết phản ứng hóa học thƣờng quy đƣa kết luận thành phần gồm có: flavonoid, saponin, tanin, đƣờng khử polysarrcharid - Đã tiến hành sắc kí lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) so sánh với chất đối chiếu vitexin đẫ kết luận đƣợc có mặt vitexin dƣợc liệu Bồ kết với Rf = 0,683 với hệ dung môi khai triển Cloroform: MeOH: Nƣớc (13:10:2) - Từ cao phân đoạn Ethyl acetate phân lập đƣợc chất FG1 tinh khiết xác định đƣợc FG1 acid oleanolic KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu phận mặt đất loài Gleditsia australis đặc điểm thực vật thành phần hóa học - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học phân lập thêm chất từ cao phân đoạn n-butanol 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu Tiếng Việt Bộ môn Dƣợc liệu (2006), Thực tập Dược liệu, Phần hóa học, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Bộ môn Thực vật (1997), Thực vật dược - Phân loại thực vật, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Bộ môn Thực vật (2004), Thực tập thực vật nhận biết thuốc, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, Hà Nội Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, NXB Y học, tr 1086-088 Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Tập 1, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 114-115 Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1990), Phương pháp nghiên cứu hóa học thuốc, NXB Y học, TP Hồ Chí Minh, tr.60-68 Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt nam, I, Nxb Trẻ, tr 838-869 10 Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt nam, NXB Y học, tr 732-734 11 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 732-733 12 Viện Dƣợc liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 245-247 13 Đào Hữu Vinh (chủ biên), Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mĩ Linh, Phạm Hùng Việt (1985), Các phương pháp sắc ký, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội B Tài liệu Tiếng Anh 14 American Journal of Botany 90(2): 310–320 2003 PHYLOGENETIC RELATIONSHIPS IN GLEDITSIA (LEGUMINOSAE) BASED ON ITS SEQUENCES1 ANDREW SCHNABEL, 2,4 PATRICK E MCDONEL, 2,5 AND JONATHAN F WENDEL3 15 Bik Hai, N.T et al (1972) Khim Prir Soedin: 647-648; CA: 108219c 16 D Kealey, P J Haines (2002), Analytical Chemistry, printed in the united States of America 17 Editorial Board of Flora of China, 2007 18 GORDON, D 1966 A revision of the genus Gleditsia (Leguminosae) Ph.D dissertation, Indiana University, Bloomington, Indiana, USA 19.http://www.theplantlist.org/browse/A/Leguminosae/Gleditsia/ 20.Huxley, A., Griffiths, M., Levy, M., 1992 Dictionary of Gardening: The New Royal Horticultural Society, vol Macmillan, London, pp 423-424.Jiangsu New Medical College, 1977 Dictionary Traditional Drugs Shanghai Science & Technology Press, Shanghai 21 Jian-Ping Zhang, Xin-Hui Tian, Yong-Xun Yang, Qing-Xin Liu, Qun Wang, Li-Ping Chen, Hui-Liang Li and Wei-Dong Zhang, Gleditsia species: An ethnomedical, phytochemical and pharmacological review, Journal of Ethnopharmacology 22 Kajimoto, T., Aoki, N., Ohta, E., Kawai, Y., Ohta, S., 2010a Locustoside A: A new purine alkaloid glucoside from seeds of Gleditsia japonica Phytochemistry Letters 3, 198-200 23 Kajimoto, T., Aoki, N., Ohta, E., Kawai, Y., Ohta, S., 2010b Saikachinoside A, a novel 3-prenylated isoguanine glucoside from seeds of Gleditsia japonica Tetrahedron Letters 51, 2099-2101 24 Lee, J., Yi, J.M., Kim, J.H., Lee, Y.J., Park, J.S., Bang, O.S., Kim, N.S., 2014 Cytochalasin H, an Active Anti-angiogenic Constituent of the Ethanol Extract of Gleditsia sinensis Thorns Biological & Pharmaceutical Bulletin 37, 6-12 25 Li, W.-H., Zhang, X.-M., Tian, R.-R., Zheng, Y.-T., Zhao, W.-M., Qiu, M.-H., 2007 A new anti-HIV lupane acid from Gleditsia sinensis Lam J Asian Nat Prod Res 9, 551e555 26 Lim, J.-C., Park, J.H., Budesinsky, M., Kasal, A., Han, Y.-H., Koo, B.-S., Lee, S.-I., Lee, D.-U., 2005 Antimutagenic constituents from the thorns of Gleditsia sinensis 27 Melek FR, Kassem IA, Miyase T, Fayad W, 2014 Caspicaosides E-K, triterpenoid saponins and cytotoxic acylated saponins from fruits of Gleditsia caspica Desf 28 Miyase T1, Melek FR, Warashina T, Selim MA, El Fiki NM, Kassem IA, 2010 Cytotoxic triterpenoid saponins acylated with monoterpenic acids from fruits of Gleditsia caspica Desf 29 Mohammed, R.S., Zeid, A.H.A., El Hawary, S.S., Sleem, A.A., Ashour, W.E., 2014 Flavonoid constituents, cytotoxic and antioxidant activities of Gleditsia triacanthos L leaves Saudi J Biol Sci 21, 547e553 30 Nguyễn Văn Dƣơng (1993), Medicinal Plants of Vietnam, Cambodia and Laos 31 Takao Konoshima and Tokunosuke Sawada (1982) Legume saponins of Gleditsia japonica Miquel IV 13C-Nuclear magnetic resonance spectral studies for structure elucidation of Gleditsia saponins B and C Chem Pharm Bull., 30 (8), pp 2747-2760 32 Werner Seebacher Nebojsa Simic, Robert Weis, Robert Saf, Olaf Kunert (2003), " Spectral assignments and reference data.", Magnetic resonance in chemistry, 41, pp 636638 33 Y.Q Li, H.Z Liu (2011), An overview of advance on research on application of Gleditsia sinensis Lam, J Anhui Argic Sci 39, pp 9611 – 9613 34 Zhang, Z.Z., Koike, K., Jia, Z.H., Nikaido, T., Guo, D., Zheng, J.H., 1999a Triterpenoidal Saponins Acylated with Two Monoterpenic Acids from Gleditsia sinensis Chemical & Pharmaceutical Bulletin 47, 388-393 35 Zhang, Z.Z., Koike, K., Jia, Z.H., Nikaido, T., Guo, D., Zheng, J.H., 1999b Gleditsiosides N-Q, New Triterpenoid Saponins from Gleditsia sinensis Journal of Natural Products 62, 877-881 36 Zhang, Z.Z., Koike, K., Jia, Z.H., Nikaido, T., Guo, D., Zheng, J.H., 1999c Four New Triterpenoidal Saponins Acylated with One Monoterpenic Acid from Gleditsia sinensis Journal of Natural Products 62, 740-745 37 Zhang, Z.Z., Koike, K.Z., Jia, Z.H., Nikaido, T., Guo, D., Zheng, J.H., 1999d Triterpenoidal saponins from Gleditsia sinensis Phytochemistry 52, 715-722 38 Zhou, L., Li, D., Jiang, W., Qin, Z., Zhao, S., Qiu, M., Wu, J., 2007a Two ellagic acid glycosides from Gleditsia sinensis Lam with antifungal activity on Magnaporthe grisea Nat Prod Res 21, 303e309 39 Zhou, L., Li, D., Wang, J., Liu, Y., Wu, J., 2007b Antibacterial phenolic compounds from the spines of Gleditsia sinensis Lam Nat Prod Res 21, 283e291 C Tài liệu Tiếng Đức 40 Morimoto, H., Oshio, H., 1965 Uber Lespedamin, ein neues Alkaloid Liebigs Annalen der Chemie 682, 212-218 D Tài liệu Tiếng Trung 41 中国药典(2015), 年版, 页码21 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Một số máy móc sử dụng nghiên cứu Máy cất quay IKA Hệ thống chấm khai triển sắc kí lớp Phụ lục 2: Tiêu thực vật Bồ kết nhỏ - Gleditsia australis F.B.Forbes & Hemsl Phiếu giám định tên khoa học Giấy chứng nhận mã số tiêu Tiêu thực vật số Tiêu thực vật số Tiêu thực số Phụ lục 3: Chất chuẩn Vitexin Chất chuẩn Vitexin – Công ty TNHH công nghệ sinh học Nam Ninh, Trung Quốc Giấy chứng nhận phân tích chất chuẩn Vitexin – Công ty TNHH công nghệ sinh học Nam Ninh, Trung Quốc Phụ lục 4: Phổ NMR FG1 FG1 – MeOD & CDCl3 – 1H FG1 – MeOD & CDCl3 – 1H FG1 – MeOD & CDCl3 – 13C ... kết hợp với kinh nghiệm tác phẩm kinh điển đƣợc viết danh y Trung Quốc nhƣ Thần Nông thảo kinh, Thang Dịch Bản Thảo, Đƣờng Bản Thảo, , nhà khoa học ngày tập trung nghiên cứu nhằm tìm hoạt chất,