BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH HIỀN XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC BỔ TRUNG ÍCH KHÍ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ THANH HIỀN MSV: 1401211 XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CỦA CỐM THUỐC BỔ TRUNG ÍCH KHÍ KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành khóa luận, em nhận giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, chuyên gia lĩnh vực nghiên cứu bạn bè gia đình Trước hết, em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thể thầy giáo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện, tận tình dạy dỗ bảo cho em suốt năm học qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Bùi Hồng Cường, người tận tình hướng dẫn, ln quan tâm bảo tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình học tập thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn chị Hồng Thị Hảo – học viên cao học khóa 22, Trường Đại học Dược Hà Nội chia sẻ, giúp đỡ hướng dẫn em tận tình thời gian em thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến DS Trần Văn Cương Công ty cổ phần Dược phẩm VCP, DS Đỗ Trung Hiếu Công ty cổ phần thương mại dược phẩm Quốc tế WINSACOM cung cấp mẫu cốm thuốc, chất chuẩn hỗ trợ kinh phí cho em thực đề tài Em xin cảm ơn PGS TS Nguyễn Mạnh Tuyển thầy cô môn Dược Học Cổ Truyền tạo điều kiện thuận lợi cho em trình làm thực nghiệm Em xin cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh, DS Bạch Thị Thắm anh chị Phòng Đơng dược - Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương giúp đỡ em trình làm thực nghiệm Cuối lời cảm ơn sâu sắc nhất, em muốn gửi tới gia đình, người thân bạn bè bên cạnh, ủng hộ em suốt trình học tập Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2019 Sinh viên Vũ Thị Thanh Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ …………………………………………………………………………….1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh trĩ 1.1.1 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học đại 1.1.2 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học cổ truyền 1.2 Phương thuốc “Bổ trung ích khí” 1.2.1 Công thức 1.2.2 Công năng, chủ trị phương thuốc 1.2.3 Định tính, định lượng 1.3 Tổng quan vị thuốc thuốc Bổ trung ích khí 1.3.1 Hoàng kỳ 1.3.2 Đảng sâm 1.3.3 Đương quy 10 1.3.4 Sài hồ 11 1.3.5 Trần bì 13 1.3.6 Thăng ma 14 1.3.7 Bạch truật 15 1.3.8 Cam thảo 16 1.4 Tổng quan phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) – detector tán xạ bay (ELSD) 17 1.4.1 Nguyên tắc phương pháp 17 1.4.2 Detector Tán xạ bay (ELSD) 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Thiết bị, máy móc 20 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu định tính số thành phần hóa học cốm Bổ trung ích khí, dược liệu: 21 2.2.2 Định lượng AGS – IV dược liệu Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ cốm Bổ trung ích khí phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [4] 21 2.3 Xử lý số liệu 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Khảo sát tiêu định tính 25 3.1.1 Định tính chất cốm Bổ trung ích khí phản ứng hóa học 25 3.1.2 Định tính cốm Bổ trung ích khí sắc ký lớp mỏng hiệu cao 26 3.2 Định lượng AGS IV Hoàng kỳ, cốm Hồng kỳ, cốm Bổ trung ích khí HPLC – ELSD 39 3.2.1 Chuẩn bị mẫu 39 3.2.2 Định lượng AGS IV Hoàng kỳ, cốm Hoàng kỳ, cốm thuốc Bổ trung ích khí HPLC – ELSD 40 CHƯƠNG BÀN LUẬN .48 4.1 Về định tính số thành phần hóa học cốm Bổ trung ích khí phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng hiệu cao 48 4.2 Về định lượng AGS IV mẫu Hồng kỳ, cốm Hồng kỳ, cốm Bổ trung ích khí 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 KẾT LUẬN 51 1.1 Xây dựng số tiêu định tính cốm thuốc Bổ trung ích khí 51 1.2 Xây dựng tiêu định lượng AGS IV cốm Bổ trung ích khí 51 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Logarit số e nồng độ AGS IV Astragalosid IV Ln (C ) HPLC High-performance liquid Ln (Spic) Logarit số e diện tích pic chromatography HPTLC High-performance thin layer NF-𝜅B Nuclear Factor-kappa B chromatography BT Bạch truật BTIK Bổ trung ích khí CT Cam thảo PGE2 Prostaglandin E2 DĐTQ Dược điển Trung Quốc PL Phụ lục DĐVN Dược điển Việt Nam PƯHH Phản ứng hóa học ĐQ Đương quy SH Sài hồ ĐS Đảng sâm SKLM Sắc kí lớp mỏng ĐT Định tính TB Trần bì IGF Insulin-like growth factor TM Thăng ma Inos Inducible nitric oxide synthase ELSD Evaporative light scattering detector HK Hoàng kỳ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số nghiên cứu định lượng AGS IV………………………………… Bảng 2.1 Công thức bào chế gói cốm thuốc Bổ trung ích khí (7,93g)……… 20 Bảng 3.1 Kết định tính phản ứng hóa học……………………………… 25 Bảng 3.2 Kết SKLM định tính Hồng kỳ, cốm Bổ trung ích khí AGS IV sau phu thuốc thử màu………………………………………… 28 Bảng 3.3 Kết SKLM định tính Đảng sâm, cốm, quan sát bước sóng 254 nm 30 Bảng 3.4 Kết SKLM định tính Đương quy, cốm, quan sát bước sóng 254nm 33 Bảng 3.5 Kết SKLM định tính Cam thảo, cốm, quan sát bước sóng 254 nm 34 Bảng 3.6 Kết SKLM định tính Bạch truật, cốm, quan sát bước sóng 254 nm Bảng 3.7 Kết SKLM định tính Trần bì, cốm, quan sát bước sóng 254 nm… 36 Bảng 3.8 Kết SKLM định tính Thăng ma, cốm, quan sát bước sóng 254 nm 37 Bảng 3.9 Kết SKLM định tính Sài hồ, cốm, quan sát bước sóng 254 nm… Bảng 3.10 Kết độ thích hợp hệ thống…………………………………………… 40 Bảng 3.11 Thời gian lưu mẫu thử mẫu chuẩn…………………………… 41 Bảng 3.12 Kết khảo sát khoảng tuyến tính định lượng AGS IV……………… 44 Bảng 3.13 Kết xác định độ ẩm dược liệu Hoàng kỳ……………………… 45 Bảng 3.14 Kết xác định độ ẩm cốm Hooàng kỳ, cốm Bổ trung ích khí…… 46 Bảng 3.15 Kết định lượng AGS IV mẫu nghiên cứu………………… 35 38 47 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ khối máy sắc ký lỏng hiệu cao ……………… 17 Hình 1.2 Sơ đồ nguyên lý cấu tạo detector tán xạ bay ……………… 18 Hình 2.1 Các dược liệu thuốc Bổ trung ích khí……………………… 19 Hình 3.1 Sắc ký đồ ĐT Hồng kỳ, cốm, AGS IV sau phun thuốc thử màu……………………………………………………………………… 28 Hình 3.2 Sắc ký đồ ĐT Đảng sâm, cốm bước sóng 254nm………………… 30 Hình 3.3 Sắc ký đồ ĐT Đương quy, cốm bước sóng 254nm…………………… 33 Hình 3.4 Sắc ký đồ ĐT Cam thảo, cốm bước sóng 254nm…………………… 34 Hình 3.5 Sắc ký đồ ĐT Bạch truật, cốm bước sóng 254nm…………………… 35 Hình 3.6 Sắc ký đồ ĐT Trần bì, cốm bước sóng 254nm……………………… 36 Hình 3.7 Sắc ký đồ ĐT Thăng ma, cốm bước sóng 254nm…………………… 37 Hình 3.8 Sắc ký đồ ĐT Sài hồ, cốm bước sóng 254nm………………………… 38 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu dung mơi……………………………………………… 41 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử Hồng kỳ……………………… 42 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu thử cốm Hoàng kỳ mẫu thử cốm Bổ trung ích 43 khí Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan logarit số e nồng độ logarit số e diện tích pic AGS IV……………………………… 45 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh trĩ bệnh thường gặp với tỉ lệ mắc cao cộng đồng, đứng đầu bệnh lý hậu môn, trực tràng Nghiên cứu Mỹ (2018) cho thấy khoảng 75% người Mỹ mắc triệu chứng bệnh trĩ vào thời điểm đời họ [35] Ở Việt Nam, điều tra dịch tễ học vào năm 2005 tỉnh miền bắc nước ta phát 1446/2651 người dân mắc bệnh trĩ, chiếm tỷ lệ lên tới 55% [14] Bệnh trĩ khơng gây nguy hại tới tính mạng có ảnh hưởng nhiều tới sinh hoạt chất lượng sống người bệnh Theo YHHĐ ngày nay, có nhiều phương pháp điều trị trĩ như: điều trị nội khoa, điều trị thủ thuật, điều trị phẫu thuật [19] Bệnh trĩ YHCT đề cập đến nhiều y văn kinh điển nguyên nhân, chế bệnh sinh phương pháp điều trị Bài “Bổ trung ích khí thang” với vị dược liệu: Hoàng kỳ, Đảng sâm, Bạch truật, Thăng ma, Sài hồ, Đương quy, Cam thảo thuốc cổ phương giới thiệu y văn dùng điều trị trĩ thơng qua tác dụng ích khí thăng đề (làm co búi trĩ) làm giảm ứ huyết búi trĩ trực tràng [9] Trên thị trường nay, thuốc “Bổ trung ích khí” đại hóa thành nhiều chế phẩm điều trị trĩ như: viên hoàn cứng Tottri (Traphaco), viên nang cứng Hermonic (Trường Anh Pharm)… Với mong muốn phát huy tính ưu việt thuốc cổ truyền tính tiện lợi sử dụng cho người bệnh, việc nghiên cứu bào chế tiêu chuẩn hóa phương thuốc cổ truyền với dạng bào chế đại vô cần thiết, cốm thuốc dạng bào chế dễ sử dụng, hấp thu nhanh sử dụng đối tượng bệnh nhân không dùng thuốc dạng viên Công ty Cổ phần Dược phẩm VCP bào chế thành công cốm thuốc từ thuốc “Bổ trung ích khí” nhiên chưa có nghiên cứu tiêu chuẩn hóa dạng bào chế Từ lý trên, đề tài “Xây dựng số tiêu chất lượng cốm thuốc Bổ trung ích khí” thực với mục tiêu: - Định tính số thành phần hóa học cốm thuốc phản ứng hóa học sắc ký lớp mỏng hiệu cao - Định lượng Astragalosid IV cốm thuốc sắc ký lỏng hiệu cao, detector tán xạ bay CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh trĩ 1.1.1 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học đại Trĩ cấu trúc mạch bình thường ống hậu mơn Bệnh trĩ tình trạng cấu trúc bị chuyển đổi sang trạng thái bệnh lý yếu tố học làm giãn, lỏng lẻo hệ thống nâng đỡ gây sa búi trĩ yếu tố mạch máu làm giãn mạch gây chảy máu [19] Ngày nay, có nhiều phương pháp để điều trị trĩ, bao gồm: Điều trị nội khoa: tuân thủ nguyên tắc vệ sinh, lao động, ăn uống; dùng thuốc chỗ dạng mỡ, viên đặt hậu môn dùng thuốc toàn thân làm tăng sức bền thành mạch Điều trị thủ thuật: tiêm xơ, thắt búi trĩ vòng cao su dùng tia hồng ngoại, đốt điện, lase, liệu pháp lạnh… Điều trị ngoại khoa: phẫu thuật theo phương pháp cắt trĩ riêng lẻ búi theo Milligan – Morgan lấy bỏ toàn niêm mạc ống hậu môn búi trĩ theo phương pháp Whitehead kết hợp với chế độ săn sóc sau mổ [19], [2] 1.1.2 Bệnh trĩ theo quan điểm Y học cổ truyền Trĩ bệnh mạn tính mạch trực tràng hậu môn bị giãn xung huyết Tĩnh mạch xung huyết thành búi nhiều búi, tùy vị trí tĩnh mạch trực tràng hậu môn, phân chia lâm sàng thành trĩ nội hay trĩ ngoại Vì xung huyết dễ gây quản, chảy máu làm người bệnh thiếu máu; bội nhiễm nên người bệnh có triệu chứng nhiễm trùng Theo Y học cổ truyền, tỳ vị suy yếu khơng vận hóa thủy cốc, khơng làm chủ nhục, không thống nhiếp huyết khiến thấp nhiệt, đàm trọc ứ đọng làm phát sinh búi trĩ, tạo thành dịch tiết gây ngứa ngáy vùng hậu mơn, nhục bị nhẽo (khí hư gây hạ hãm), nên búi trĩ khối da, vùng hậu môn sa xuống - Nguyên nhân gây trĩ: Viêm đại tràng mạn tính gây táo bón, thường xun phải rặn nhiều; viêm gan, xơ gan mạn tính gây xung huyết tĩnh mạch; bệnh nghề nghiệp đứng lâu, ngồi lâu, mang vác nặng; phụ nữ đẻ nhiều lần, phụ nữ có thai làm trương lực thành mạch, thành bụng bị giảm gây giãn tĩnh mạch… 28 Hanlin Gong, Feng Qin, et al (2018), "Herbal Formula Modified Buzhong-YiqiTang for Functional Constipation in Adults: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials", Evid Based Complement Alternat Med, 2018, pp 9602525 29 Jiang Yueping, Liu Yufeng, et al (2015), "Acetylenes and fatty acids from Codonopsis pilosula", Acta Pharmaceutica Sinica B, 5(3), pp 215-222 30 Li Wenkui, Fitzloff John F (2001), "Determination of astragaloside IV in Radix astragali (Astragalus membranaceus var monghulicus) using high-performance liquid chromatography with evaporative light-scattering detection", Journal of chromatographic science, 39(11), pp 459-462 31 Li Yunfei, Wang Yi, et al (2008), "Simultaneous determination of seven bioactive compounds in Chinese medicine “QI-SHEN-YI-QI” dropping pill by LC-UV and LC-ELSD", Chromatographia, 67(3-4), pp 293-297 32 Liu Ping, Zhao Haiping, et al (2017), "Anti-aging implications of Astragalus Membranaceus (Huangqi): a well-known chinese tonic", Aging and disease, 8(6), pp 868 33 Luo Meixia, Luo Hujie, et al (2018), "Evaluation of chemical components in Citri Reticulatae Pericarpium of different cultivars collected from different regions by GC–MS and HPLC", Food science & nutrition, 6(2), pp 400-416 34 Luo Yumin, Qin Zhen, et al (2004), "Astragaloside IV protects against ischemic brain injury in a murine model of transient focal ischemia", Neuroscience letters, 363(3), pp 218-223 35 Mott T, Latimer K, et al (2018), "Hemorrhoids: Selection for diagnosis and treatment", Am Fam Doctor, 97(3), pp 172-179 36 Ren Shuang, Zhang Hua, et al (2013), "Pharmacological effects of Astragaloside IV: a literature review", Journal of Traditional Chinese Medicine, 33(3), pp 413416 37 Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung (2008), "Triterpene from the roots of Codonopsis pilosula", Vietnam Journal of Chemistry, 46(4), pp 515 38 Wang Yan-Ping, Li Xiao-Yu, et al (2002), "Effect of astragaloside IV on T, B lymphocyte proliferation and peritoneal macrophage function in mice", Acta Pharmacologica Sinica, 23(3), pp 263-266 39 Wei Wen-Long, Zeng Rui, et al (2016), "Angelica sinensis in China-A review of botanical profile, ethnopharmacology, phytochemistry and chemical analysis", Journal of ethnopharmacology, 190, pp 116-141 40 Wu Tao, Bligh SW Annie, et al (2005), "Simultaneous determination of six isoflavonoids in commercial Radix Astragali by HPLC-UV", Fitoterapia, 76(2), pp 157-165 41 Yu Xin, Sun Shuang, et al (2018), "Citri Reticulatae Pericarpium (Chenpi): Botany, ethnopharmacology, phytochemistry, and pharmacology of a frequently used traditional Chinese medicine", Journal of ethnopharmacology, 220, pp 265-282 42 Yu Xue-Qing, Xue Charlie Changli, et al (2008), "In vitro and in vivo neuroprotective effect and mechanisms of glabridin, a major active isoflavan from Glycyrrhiza glabra (licorice)", Life sciences, 82(1-2), pp 68-78 43 Zhang YL, Yang XX, et al (2010), "Quantitative analysis of astragaloside IV in traditional Chinese medicine ‘Huang-Qi-Si-Wu’Capsules by HPLC/UV", J Chin Pharma Sci, 19, pp 223-228 44 Zhao Zhuanyou, Wang Weiting, et al (2009), "Effects of Astragaloside IV on heart failure in rats", Chinese Medicine, 4(1), pp 45 Zheng GuoDong, Yang DePo, et al (2009), "Simultaneous determination of five bioactive flavonoids in Pericarpium Citri reticulatae from china by highperformance liquid chromatography with dual wavelength detection", Journal of agricultural and food chemistry, 57(15), pp 6552-6557 46 Jiang Yueping, Liu Yufeng, et al (2016), "Sesquiterpene glycosides from the roots of Codonopsis pilosula", Acta pharmaceutica sinica B, 6(1), pp 46-54 PHỤ LỤC Phụ lục Định tính nhóm chất cốm Bổ trung ích khí phản ứng hóa học Phụ lục Định tính, định lượng dược liệu thuốc, viên hồn Bổ trung ích khí theo DĐVN V Phụ lục Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng PHỤ LỤC ĐỊNH TÍNH CÁC NHĨM CHẤT TRONG CỐM BỔ TRUNG ÍCH KHÍ BẰNG PHẢN ỨNG HĨA HỌC  Định tính Saponin: Mẫu nghiên cứu (MNC): - Lấy 5g cốm cho vào cốc có mỏ, pha lỗng 50 ml nước cất Đun bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc Dịch lọc đem lắc lần với n-buthanol Gộp dịch chiết nbuthanol, bốc dung mơi đến cắn Hòa tan cắn 10 ml ethanol 90% để làm phản ứng định tính - Dược liệu: Cân 2g dược liệu loại cho vào bình nón, thêm 20ml EtOH 90% Đun cách thủy sơi khoảng 15 phút Lọc nóng, đến khoảng 10 ml Dịch thu tiến hành phản ứng định tính Phản ứng tạo bọt: Cho khoảng 2ml MNC vào ống nghiệm to, bay EtOH, thêm vào ống 10 mL nước cất, lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm 10 phút Kết dương tính sau 15 phút cho cột bọt bền vững Phản ứng Salkowski Lấy mL MNC vào ống nghiệm, bốc đến cắn, hòa tan cắn 1mL CHCl3 Nghiêng ống nghiệm 450, nhỏ từ từ đồng lượng dung dịch H2SO4 đặc (TT) theo thành ống Phản ứng dương tính xuất vòng màu đỏ tím hai lớp Phản ứng Rosenthaler: Lấy 1mL MNC cho vào ống nghiệm, thêm giọt vanilin 1% ethanol, thêm giọt dd HCl đặc (TT), hơ nóng Phản ứng dương tính lắc nhẹ thấy dung dịch xuất màu vàng đậm  Định tính alkaloid: Mẫu nghiên cứu (MNC): - Dược liệu: g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL có nút mài, thêm 20 mL dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc lấy dịch lọc Cho dịch lọc vào bình gạn 50 mL, kiềm hóa dịch lọc dung dịch amoniac đặc đến pH = - 10 (thử thị màu vạn năng) Lắc với CHCl3 (3 lần x 10 mL), gạn lấy lớp CHCl3, bốc đến cách thủy tới khơ, thu cắn Hòa tan cắn mL H2SO4 1N, chia dịch chiết vào ống nghiệm - Cốm: g cốm, hòa tan vào 10 mL nước cất (đun nóng để hòa tan hồn tồn) tiến hành Ống 1: Nhỏ - giọt TT Mayer Phản ứng dương tính xuất kết tủa trắng Ống 2: Nhỏ - giọt TT Dragendorff Phản ứng dương tính xuất tủa da cam Ống 3: Nhỏ 2- giọt TT Bouchardat Phản ứng dương tính xuất tủa nâu đỏ  Định tính flavonoid: Mẫu nghiên cứu (MNC): - Cốm: Cân 5g cốm cho vào bình nón, pha lỗng 50ml nước cất Đun bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc Dịch chiết nước thu lắc với EtOAc lần, lần 15ml Gộp dịch chiết EtOAc lại, bốc dung môi, cắn thu hòa tan 10ml ethanol 90% làm phản ứng định tính - Dược liệu: Cân 2g dược liệu loại cho vào bình nón, thêm 20ml EtOH 90% Đun cách thủy sơi vài phút Lọc nóng, bớt dịch lọc lại khoảng 10 ml Dịch tiến hành phản ứng định tính Phản ứng Cyanidin: Cho 2mL DC vào ống nghiệm, thêm bột magnesi kim loại, thêm giọt HCl đặc, lắc đều, đun cách thủy phút Phản ứng dương tính xuất màu vàng nâu Phản ứng với amoniac (NH3): Nhỏ 1-2 giọt DC lên tờ giấy lọc, sấy nhẹ đến khô Hơ lên miệng lọ có chứa amoniac đặc mở nắp Phản ứng dương tính thấy màu vàng đậm dần lên Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%: Cho vào ống nghiệm 2mL dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd FeCl3 5% Phản ứng dương tính xuất tủa màu xanh đen  Định tính coumarin: Mẫu nghiên cứu (MNC): - Đun cách thủy bình nón chứa 5g cốm thuốc 5g bột dược liệu với 30mL ethanol 90%, lọc nóng qua giấy lọc, dịch thu đem làm phản ứng định tính Phản ứng mở-đóng vòng lacton: Cho vào ống nghiệm, ống mL DC: Ống 1: thêm 0,5 mL dung dịch NaOH 10% Ống 2: Để yên Đun hai ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát thấy: Ống 1: tủa đục Ống 2: Thêm vào ống nghiệm ống mL nước cất Lắc thấy: Ống 1: suốt Ống 2: có tủa đục Thêm vào ống vài giọt dd HCl đặc, ống đục trở lại ống (phản ứng dương tính) Phản ứng Diazo hóa: Cho vào ống nghiệm 1mL DC, thêm 2mL dd NaOH 10% Đun cách thủy 10 phút, để nguội Thêm vài giọt TT Diazo pha Phản ứng dương tính xuất màu đỏ gạch  Định tính polysaccharid, đường khử, acid amin: Mẫu nghiên cứu (MNC): - Cho 5g cốm thuốc 5g bột dược liệu vào bình nón, thêm 20 Ml nước cất Đun sơi trực tiếp 10 phút, để nguội, lọc, lấy dịch lọc để làm phản ứng Định tính polysaccharid: - Đun cách thủy 2ml dịch lọc với 0,5ml dung dịch Lugol (TT) vài phút - Phản ứng dương tính dung dịch chuyển sang màu tím đỏ - xanh tím Định tính đường khử: - Đun cách thủy 2ml dịch lọc với 0,5 ml TT Fehling A, Fehling B vài phút - Phản ứng dương tính xuất tủa đỏ gạch Định tính acid amin Lấy ml dịch lọc, thêm giọt TT Ninhydrin, đun cách thủy – phút Phản ứng dương tính xuất màu tím PHỤ LỤC ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG CÁC DƯỢC LIỆU TRONG BÀI THUỐC, VIÊN HOÀN BỔ TRUNG ÍCH KHÍ THEO DĐVN Hoàng kỳ  Định tính: (sắc ký lớp mỏng) - Dung mơi khai triển: chloroform – methanol - nước (13:7:2) - Dung dịch thử: Hồng kỳ chiết với methanol, dịch lọc thành cắn Rửa cắn, hoà tan nước cất lắc với n-buthanol Các dịch n-buthanol gộp lại, thành cắn, hồ tan cắn methanol dung dịch thử - Dung dịch chất đối chiếu: Hoà tan AGS-IV methanol để dung dịch nồng độ mg/ml dược liệu chuẩn Hoàng kỳ - Phát hiện: Thuốc thử dung dịch acid sulfuric 10%/ethanol, sấy 1050C, quan sát ánh sáng thường bước sóng 366 nm  Định lượng: (HPLC – ELSD) - Pha động: Acetonitril nước - Điều kiện sắc kí:  Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm, 5µm)  Dertector tán xạ bay  Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút  Thể tích tiêm: 20 µl  Chương trình dung mơi: - Thời gian Acetonitril (%) Nước (%) 0→10 100 10→45 0→60 100→40 45→60 60 40 Yêu cầu: hàm lượng Astragalosid IV hồng kỳ khơng thấp 0.04% tính theo dược liệu khô kiệt Đảng sâm  Định tính sắc ký lớp mỏng - Dung mơi khai triển: n-buthanol-acid acetic-nước (7:1:0,5) - Dung dịch thử: Lấy 2,5 g bột dược liệu chiết siêu âm với 50 ml methanol, lọc Dịch lọc thu hồi dung môi đến cắn, hoà tan cắn ml nước chuyển vào cột Rửa giải 50 ml nước, bỏ nước rửa, tiếp tục rửa 50 ml ethanol 50% Bốc dung dịch rửa giải đến cắn, hoà tan cắn ml methanol thành dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Dung dịch lobetyolin chuẩn methanol nồng độ 0,5 mg/ml dung dịch Đảng sâm chuẩn chiết mẫu thử - Phát hiện: Phun dung dịch acid sulfuric 10%/ethanol, quan sát bước sóng 366 nm Đương quy  Định tính sắc ký lớp mỏng - Dung môi khai triển: Cyclohexan-diclomethan-ethyl acetat-acid formic (4:1:1:0,5) - Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, thêm 20 ml ethanol 95%, ngâm giờ, lọc, bốc dịch lọc khoảng 10 ml dung dịch thử - Dung dịch đối chiếu: Dung dịch acid ferulic chuẩn ethanol có nồng độ mg/ml dung dịch đương quy chuẩn chiết mẫu thử - Phát hiện: Quan sát bước sóng 366 nm Sài hồ  Định tính sắc ký lớp mỏng - Dung mơi khai triển: Ethyl acetat – ethanol – nước (8:2:1) - Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm 20 ml methanol, đun hồi lưu khoảng 1h để nguội, lọc Bốc dịch lọc đến khoảng ml, lọc - Dung dịch đối chiếu: Dung dịch saikosaponin A chuẩn methanol có nồng độ 0,5 mg/ml dung dịch sài hồ chuẩn chiết mẫu thử - Phát hiện: Phun dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyd 2% acid sulfuric 40%, quan sát bước sóng 366 nm Trần bì  Định tính sắc ký lớp mỏng  Dung môi khai triển: (1): Ethyl acetat – methanol – nước (100:17:13) (2): Toluen-ethyl acetat-acid formic-nước (20:10:1)  Dung dịch thử: Lấy 0,3 g bột dược liệu, đun hồi lưu với 20 ml methanol, lọc Cơ dịch lọc khoảng ml dung dịch thử  Dung dịch đối chiếu: Dung dịch hesperidin chuẩn methanol có nồng độ mg/ml dung dịch Trần bì chuẩn chiết mẫu thử  Tiến hành: Triển khai sắc ký với dung môi (1) đến dung môi cm, lấy mỏng để khô, tiếp tục triển khai với dung môi khai triển (2) đến dung môi cm  Phát hiện: Phun dung dịch nhơm clorid 1%, quan sát bước sóng 366 nm Thăng ma  Định tính sắc ký lớp mỏng  Dung môi triển khai: Toluen-cloroform-acid acetic (6:1:0,5)  Dung dịch thử: Lấy g bột dược liệu, chiết hồi lưu với 50 ml ethanol 96%, dịch lọc đến cắn, hồ tan cắn ml ethanol dung dịch thử  Dung dịch đối chiếu: Dung dịch acid ferulic acid isoferulic chuẩn ethanol 96 % (TT) có nồng độ mg/ml dung dịch Thăng ma chuẩn chiết mẫu thử  Phát hiện: Quan sát bước sóng 366 nm Bạch truật Định tính sắc ký lớp mỏng  Dung môi khai triển: Ether dầu hỏa (30 °c đến 60 °C) – ethyl acetat (50 : 1)  Dung dịch thử: Lấy 0,5 g bột dược liệu, thêm ml n-hexan (TT) cho vào bình nút kín, lắc khoảng 30 min, lọc lấy dịch lọc để làm dung dịch thử  Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5 g bột Bạch truật (mẫu chuẩn), tiến hành chiết mô tả phần dung dịch thử  Phát hiện:dùng thuốc thử màu vanilin 1% dung dịch acid sulfuric 5% Cam thảo  Định tính sắc ký lớp mỏng  Dung môi khai triển: Ethylacetat– acid formic– acid acetic băng – nước (15:1:1:2)  Dung dịch thử: Bột dược liệu chiết loại tạp với ether ethylic Sau chiết với methanol, dịch lọc đến cắn Hồ tan cắn nước lắc với n-butanol bão hoà nước Dịch chiết n-butanol bốc đến cắn, hoà tan methanol dung dịch thử  Dung dịch đối chiếu: Dung dịch amoni glycyrrhizinat chuẩn methanol có nồng độ mg/ml dung dịch Cam thảo chuẩn chiết mẫu thử  Phát hiện: Dung dịch acid sulfuric 10%/ethanol, quan sát bước sóng 366 nm Hồn bổ trung ích khí  Định tính sắc ký lớp mỏng  Định tính Cam thảo  Bản mỏng: Silica gel GF254  Dung môi khai triển: Cloroform – aceton (7:3)  Dung dịch thử: Lấy 10g chế phẩm, nghiền cắt nhỏ, thêm 20 ml methanol, dùng đũa thủy tinh dần nhuyễn, gạn, lọc Bã chiết lần Tập trung dịch lọc, cô cách thủy tới khoảng ml  Dung dịch đối chiếu: Lấy 2g Cam thảo (mẫu chuẩn) cắt nhỏ, thêm 20 ml methanol, đun sôi cách thủy 20 min, lọc, bã chiết lần Tập trung dịch lọc, cô cách thủy khoảng ml  Phát hiện: quan sát ánh sáng tử ngoại có bước sóng 254 nm 366 nm, phun dung dịch vanilin % / acid sulfuric  Định tính Đương quy:  Dung mơi khai triển: n-Hexan – ethyl acetat (95:5)  Dung dịch thử: Dùng dịch chiết methanol phần định tính Cam thảo  Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5g bột Đương quy (mẫu chuẩn), thêm ml methanol, lắc kỹ 10 min, lọc Cô dịch lọc cách thủy tới cắn Hòa cắn ml methanol  Phát hiện: quan sát ánh sáng tử ngoại có bước sóng 366 nm, phun thuốc thử màu dung dịch vanil1 % / acid sulfuric PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ SẮC KÝ LỚP MỎNG Phụ lục 3.1 Sắc kí đồ ĐT Cam thảo, cốm bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử Phụ lục 3.2 Sắc kí đồ ĐT Đương quy, cốm bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử Phụ lục 3.3 Sắc kí đồ ĐT Bạch truật, cốm bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử Phụ lục 3.4 Sắc kí đồ ĐT Trần bì, cốm bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử Phụ lục 3.5 Sắc kí đồ ĐT Sài hồ, cốm bước sóng 366 nm quan sát ánh sáng thường sau phun thuốc thử Phụ lục 3.6 Sắc kí đồ ĐT Hồng kỳ, cốm bước sóng 254 nm 366 nm Phụ lục 3.7 Sắc kí đồ ĐT Đảng sâm – cốm, Thăng ma – cốm bước sóng 366 nm ... mega pixel  Hệ thống thi t bị SKLM hiệu cao Linomat (Camag Switzeland)  Máy sắc ký lỏng Hitachi-ELSD  Bếp cách thuỷ  Pipet xác loại, micro pipet, dụng cụ thủy tinh cần thi t khác 20 2.1.3 Hóa... bạn bè bên cạnh, ủng hộ em suốt trình học tập Hà Nội, ngày 13 tháng 06 năm 2019 Sinh viên Vũ Thị Thanh Hiền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN... 2.1 Đối tượng, phương tiện nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.1.2 Thi t bị, máy móc 20 2.1.3 Hóa chất, chất chuẩn 21 2.2 Phương pháp nghiên