DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Bp C CYP1B1 DNA dNTP G PCR RFLP : Adenin : Base pair : Cytosine : Cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide : Deoxyribonucleotid Acid : Deoxyribonucleotid-5-triphosphate : Guanine : Polymerase chain reaction (phản ứng khuếch đại chuỗi gen) : Restriction fragment length polymorphism T (đa hình chiều dài phân đoạn cắt giới hạn) : Thymine MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược glôcôm bẩm sinh nguyên phát .3 1.1.1 Khái niệm dịch tễ học glôcôm bẩm sinh nguyên phát .3 1.1.2 Phân loại glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.1.3 Giải phẫu bệnh, sinh lí bệnh glơcơm bẩm sinh nguyên phát 1.1.4 Chẩn đoán điều trị glôcôm bẩm sinh nguyên phát 1.2 Vị trí, cấu trúc gen protein CYP1B1 1.2.1 Vị trí gen .9 1.2.2 Cấu trúc gen 1.2.3 Protein CYP1B1: Cấu trúc chức 10 1.3 Đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 13 1.3.1 Các dạng đột biến cấu trúc gen CYP1B1 .13 1.3.2 Các vị trí đột biến gen CYP1B1 DNA 15 1.4 Các kĩ thuật phát đột biến gen CYP1B1 19 1.4.1 Kỹ thuật PCR .19 1.4.2 Kỹ thuật PCR-RFLP 21 1.4.3 Kỹ thuật SSCP 22 1.4.4 Kỹ thuật ARMS-PCR 23 1.4.5 Kỹ thuật giải trình tự gen 25 1.4.6 Kỹ thuật MLPA 29 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1 Đối tượng nghiên cứu 32 2.2 Phương pháp nghiên cứu .33 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 33 2.2.2 Kỹ thuật thu thập thông tin 35 2.2.3 Nội dung biến số nghiên cứu 35 2.2.4 Dụng cụ, trang thiết bị hóa chất nghiên cứu 36 2.2.5 Quy trình kỹ thuật .37 4.5.4 Kỹ thuật MLPA xác định đột biến dị hợp tử xóa đoạn .40 2.2.6 Xử lý phân tích số liệu 43 2.3 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .44 3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 44 3.2 Kết tách chiết DNA .45 3.3 Kết điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA 48 3.4 Kết khuếch đại exon exon gen CYP1B1 48 3.5 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 49 3.5.1 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 kỹ thuật giải trình tự .49 3.5.2 Kết xác định đột biến gen CYP1B1 kỹ thuật MLPA 64 3.6 Mối liên quan đột biến gen CYP1B1 số đặc điểm lâm sàng bệnh nhân nghiên cứu .67 3.6.1 Mối liên quan thời gian khởi phát bệnh với đột biến gen CYP1B1 67 3.6.2 Mối liên quan giới tính đột biến gen CYP1B1 .68 3.6.3 Mối liên quan số mắt biểu bệnh đột biến gen CYP1B1 .68 3.6.4 Mối liên quan nhãn áp đột biến gen CYP1B1 .69 3.6.5 Mối liên quan đường kính giác mạc đột biến gen CYP1B1 70 3.6.6 Mối liên quan giai đoạn bệnh đột biến gen CYP1B1 71 3.7 Kết phát người lành mang gen bệnh thành viên gia đình bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát .71 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 80 4.1 Bàn luận thông tin chung đối tượng nghiên cứu 80 4.2 Bàn luận kết tách chiết DNA 81 4.3 Bàn luận kết điện di DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA 82 4.4 Bàn luận kết PCR khuếch đại exon exon gen CYP1B1 82 4.5 Bàn luận kết xác định đột biến gen CYP1B1 82 4.6 Bàn luận mối liên quan đột biến gen CYP1B1 số đặc điểm lâm sàng nhóm bệnh nhân nghiên cứu .87 4.7 Bàn luận kết phát người lành mang gen: 89 4.7.1 Biện luận kết gia đình mã số G08 89 4.7.2 Biện luận kết gia đình số mã số G43 89 4.7.3 Biện luận kết gia đình số mã số G12 90 KẾT LUẬN 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bảng mô tả đột biến gen CYP1B1 dự đoán vùng ảnh hưởng 11 Bảng 1.2 Bảng tỉ lệ đột biến gen CYP1B1 số nước châu Á 14 Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR 38 Bảng 2.2 Tên, kích thước vị trí sản phẩm PCR Kit MLPA P128-CYP450 (MRC- Holland) 41 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi bệnh nhân nghiên cứu 44 Bảng 3.2: Nồng độ độ tinh mẫu DNA tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân nghiên cứu 46 Bảng 3.3: Bảng tổng kết dạng đột biến điểm gen CYP1B1 56 Bảng 3.4: Kết dự đoán gây bệnh đột biến điểm gen CYP1B1 58 Bảng 3.5: Tỷ lệ dạng đột biến điểm gen CYP1B1 63 Bảng 3.6: Các đa hình SNP gen CYP1B1 bệnh nhân nghiên cứu 63 Bảng 3.7: So sánh thời gian khởi phát nhóm có đột biến nhóm khơng có đột biến gen CYP1B1 67 Bảng 3.8: Mối liên quan giơí nhóm bệnh nhân có đột biến nhóm bệnh nhân khơng có đột biến gen CYP1B1 68 Bảng 3.9 Mối liên quan tình trạng đột biến gen với số mắt bị bệnh .69 Bảng 3.10 So sánh nhãn áp nhóm có đột biến khơng có đột biến gen CYP1B1 69 Bảng 3.11 Mối liên quan đường kính giác mạc với đột biến gen CYP1B1 70 Bảng 3.12 Mối liên quan giai đoạn bệnh với tình trạng đột biến gen .71 Bảng 3.13 Kết phát đột biến gen thành viên gia đình bệnh nhân 78 Bảng 3.14 Kết đột biến đa hình SNP số gia đình bệnh nhân .79 Bảng 4.1: Kết phát tỷ lệ đột biến bệnh nhân châu Á 84 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ tỷ lệ giới đối tượng nghiên cứu 44 Biểu đồ 3.2: Phân bố đột biến điểm gen CYP1B1 57 Biểu đồ 3.3: Phân bố đột biến exon exon .58 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí gen CYP1B1 Hình 1.2: Sơ đồ vị trí gen tổng hợp vùng cấu trúc protein CYP1B1 10 Hình 1.3: Hình ảnh khơng gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 .11 Hình 1.4: Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 12 Hình 1.5: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 .15 Hình 1.6: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 thường gặp người da trắng 16 Hình 1.7: Sự phân bố đột biến gen CYP1B1 người châu Á 17 Hình 1.8: Giải trình tự gen CYP1B1, p.V419Gfs11X đột biến xóa đoạn phát bệnh nhân dị hợp tử .18 Hình 1.9: Các bước kĩ thuật PCR 20 Hình 1.10: Hình ảnh điện di sản phẩm sau dùng enzym cắt giới hạn .22 Hình 1.11: Phát đột biến E387K gen CYP1B1 KT ARMS-PCR 24 Hình 1.12 Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP 25 Hình 1.13: Phản ứng gắn ddNTP làm dừng tổng hợp DNA 26 Hình 1.14: Nguyên lý giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid 27 Hình 1.15: Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự gen [ 28 Hình 1.16 Các giai đoạn kỹ thuật MLPA 30 Hình 1.17 Hình ảnh đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử 31 Hình 2.1 Hình ảnh minh họa kết MLPA sử dụng Kit MLPA P128CYP450 .41 Hình 3.1: Minh họa đo OD mẫu DNA tách chiết máy Nanodrop 1000 bệnh nhân mã số G13 45 Hình 3.2: Kết điện di DNA tổng số 48 Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon (A), exon (B) gen CYP1B1 (+) mẫu đối chứng dương, (-) mẫu đối chứng âm; (1-5) mẫu bệnh nhân; (MK) Marker .49 Hình 3.4: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G15 49 Hình 3.5: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G9 50 Hình 3.6: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G10 50 Hình 3.7: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G20 51 Hình 3.8: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G20 51 Hình 3.9: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G20 52 Hình 3.10: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G8 52 Hình 3.11: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G19 53 Hình 3.12: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G21 53 Hình 3.13: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G40 54 Hình 3.14: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G70 54 Hình 3.15: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G24 55 Hình 3.16: Kết giải trình tự bệnh nhân MS G44 55 Hình 3.17: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.D218H 59 Hình 3.18: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.D242N 60 Hình 3.19: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.G365E 61 Hình 3.20: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.Q86K 62 Hình 3.21: Hình ảnh cấu trúc protein CYP1B1 với đột biến p.A133T 62 Hình 3.22: Hình ảnh MLPA (hình trên) kết tính tốn (Relative Peak Area) phần mềm coffalyser (hình dưới) BN MS G40 MS2 Ex1, Ex3 đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon gen CYP1B1 .65 Hình 3.23: Hình ảnh MLPA (hình trên) kết tính tốn (Relative Peak Area) phần mềm coffalyser (hình dưới) bệnh nhân MS G45 MS68 Ex1, Ex3 đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon gen CYP1B1 66 Hình 3.23: Sơ đồ phả hệ gia đình bệnh nhân mã số G40 72 Hình 3.24: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G40 73 Hình 3.25: Phả hệ gia đình bệnh nhân G24 74 Hình 3.26: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G24 (E229K) 75 Hình 3.27: Phả hệ gia đình bệnh nhân G70 76 Hình 3.28: Hình ảnh giải trình tự gia đình bệnh nhân G70 (E229K) 77 Hình 3.29: Hình ảnh MLPA (hình trên) kết tính tốn (Relative Peak Area) phần mềm coffalyser (hình dưới) gen CYP1B1 bố bệnh nhân MS G28 (G28B) Ex1, Ex3 đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, exon gen CYP1B1 .78 ĐẶT VẤN ĐỀ Glôcôm trẻ em nguyên nhân thường gặp gây mù lòa trẻ em, đặc biệt glôcôm bẩm sinh nguyên phát trẻ q nhỏ, khó khám, khó đo nhãn áp, chẩn đốn dễ bị bỏ sót, phẫu thuật dễ bị tái phát Bệnh thường xảy hai mắt (65-80%), xuất sớm từ năm đầu sau sinh điều trị khỏi hay phòng ngừa với kỹ thuật y học đại [1], [2] Tỷ lệ bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát có tần suất khoảng 1/10.000 đến 1/20.000 trẻ sinh sống nước châu Âu Mỹ Bệnh chiếm 55% tổng số trường hợp glôcôm nguyên phát trẻ em, 60% chẩn đoán vào lúc tháng tuổi 80% vòng năm Khoảng 65% trẻ nam bệnh thường xảy hai mắt 65-80% trường hợp với mức độ không tương đương Tuy gặp hai nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa trẻ nhỏ [1], [3], [4] Các tác giả Shaffer Weiss từ năm 1970 xác định glôcôm bẩm sinh nguyên phát thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể thường [5] Ba đột biến gen nghiên cứu nhiều liên quan đến glôcôm CYP1B1, LTBP2, MYOC [6] Trong gen CYP1B1 tổng hợp protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc trì chức mắt Có nhiều giả thiết đưa mối liên quan đột biến gen CYP1B1 bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát trẻ em [7], [8] Gen CYP1B1 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể vị trí 2p22.2 bao gồm exon intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base [9], [10] Đột biến gen CYP1B1 hay gặp đột biến thay acid amin (missense) phát 733 trường hợp số 1096 đột biến (66,76%) Trong đột biến gen CYP1B1 phát chủ yếu exon exon [11] Một báo cáo khác năm 2011 kết luận đột biến thay loại đột biến gen CYP1B1 hay gặp [12] 89 phải phẫu thuật nhiều lần 4.7 Bàn luận kết phát người lành mang gen: 4.7.1 Biện luận kết gia đình mã số G08 Bệnh nhân mã số G08, khởi phát bệnh lúc sinh, bị bệnh mắt, dấu hiệu lâm sàng nặng với mức nhãn áp 35mmHg Phân tích trình tự gen bệnh nhân phát đột biến p.Q86K dị hợp tử đa hình đơn p.A119S đồng hợp tử Gia đình bệnh nhân Đơng Anh Hà Nội, tiền sử thai nghén khơng có đặc biệt Gia đình bệnh nhân khơng có người bệnh tăng nhãn áp Bố mẹ anh trai bệnh nhân (10 tuổi) khơng phát đột biến Đa hình đơn p.A119S thể dị hợp tử phát bố bệnh nhân Như vậy, khơng tìm thấy di truyền đột biến p.Q86K gia đình số G08 Có thể đột biến p.Q86K bệnh nhân đột biến sinh.Tuy nhiên bệnh nhân mang đột biến ( kiểu gen Aa) di truyền đột biến cho hệ sau Cần tư vấn di truyền cho bệnh nhân trước kết hôn 4.7.2 Biện luận kết gia đình số mã số G43 Bệnh nhân phát bệnh từ tháng tuổi, mức độ bệnh nặng Kết giải trình tự cho thấy bệnh nhân mang đột biến p.Q86K dị hợp tử Tiền sử thai nghén bệnh nhân khơng có đặc biệt Phả hệ gia đình bệnh nhân cho thấy bà nội bố biểu bệnh nên kiểu gen AA Tuy nhiên không phát đột biến p.Q86K bố bệnh nhân Giả thiết đặt ra, có đột biến khác vị trí khơng phát gen khác gây bệnh di truyền từ bà nội sang bố bệnh nhân bệnh nhân P.Q86K đột biến phối hợp gây bệnh bệnh nhân Hai em bệnh nhân không phát bệnh, nhiên người lành mang gen, cần kiểm tra để có tư vấn di truyền thích hợp 4.7.3 Biện luận kết gia đình số mã số G12 Bệnh nhân mã số G12, thứ gia đình có anh em trai Hai 90 anh trai bệnh nhân (14 11 tuổi) khơng có biểu bệnh Bệnh nhân khởi phát bệnh từ tháng tuổi, bị bệnh mắt Nhãn áp < 25mmHg Bà nội bệnh nhân sống có tiền sử sống vùng nhiễm Dioxin; mẹ bệnh nhân thời gian mang thai bệnh nhân có sử dụng thuốc trầm cảm Cả ông, bà, bố mẹ bệnh nhân khơng có tiền sử bệnh tăng nhãn áp Phân tích trình tự gen CYP1B1 bố, mẹ bệnh nhân khơng phát đột biến Vậy, bệnh nhân không phát chứng di truyền Có thể bệnh nhân mang đột biến phát sinh Bệnh nhân mang đột biến cần tư vấn di truyền cho bệnh nhân trước kết 4.7.4 Phân tích kết gia đình số mã số G40 Bệnh nhân mã số G40, khởi phát bệnh lúc sinh, bị bệnh mắt, nhãn áp >25mmHg Gia đình bệnh nhân khơng có bị bệnh tăng nhãn áp Em gái bệnh nhân sinh