1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1953, hai nhà bác học James D Watson Francis H.C Crick phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA thức đánh dấu đời sinh học phân tử Kỹ thuật sinh học phân tử việc sử dụng kỹ thuật gen kỹ thuật protein để xác định trình tự gen hay chuỗi acid amin gen khác nhau, lập đồ gen khu vực định gen lồi sinh vật Hiện nay, có nhiều phương pháp sinh học phân tử ứng dụng cho loại bệnh lý khác nhau.giúp phát bệnh lý di truyền Trong lĩnh vực Y học di truyền học kỹ thuật gen giúp người phát nguyên số bệnh nan y, chế tạo loại thuốc để điều trị bệnh Đặc biệt, năm gần đây, liệu pháp gen nghiên cứu đưa vào ứng dụng để điều trị số bệnh lý di truyền Di truyền Y học năm qua phát triển nhanh chiều rộng lẫn chiều sâu, đặc biệt kỹ thuật sinh học phân tử thâm nhập vào hầu hết chuyên ngành y học phát huy hiệu to lớn chẩn đoán, điều trị phòng bệnh Từ năm 1970, Shaffer Weiss xác định glôcôm bẩm sinh nguyên phát thể bệnh glôcôm di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể thường phổ biến trẻ em Các nghiên cứu protein CYP1B1 đóng vai trò quan trọng việc hình thành cấu trúc trì chức vùng bè, góc tiền phòng nhãn cầu đột biến gen dẫn đến bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Trong năm gần đây, nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát châu Á tập trung sâu vào chế bệnh sinh mức độ phân tử, làm sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt người mang gen gây bệnh, giảm gánh nặng cho gia đình xã hội Trong năm gần đây, nghiên cứu bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát châu Á tập trung sâu vào chế bệnh sinh mức độ phân tử, làm sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen, đồng thời giúp việc quản lý tốt người mang gen gây bệnh Trong bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, đột biến gen CYP1B1 chủ yếu đột biến điểm, xuất toàn chiều dài gen phương pháp PCR, giải trình tự gen MLPA sử dụng để phát đột biến , , , , Cphạm vi chuyên húng tơi tiến hành chun đề để trình bày xin đề cập đến nội dung "Các kỹ thuật thông dụng để xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát người lành mang gen bệnh " GEN CYP1B1 VÀ ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT 1.1 Cấu trúc vị trí gen CYP1B1 Tên khoa học thức gen CYP1B1 "cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1” Ngồi gen CYP1B1 gọi với tên khác như: aryl hydrocarbon hydroxylase, CP1B, CP1B1_HUMAN, cytochrome P450 - subfamily I (dioxin-inducible) polypeptide 1, flavoprotein-linked monooxygenas, microsomal monooxygenase, xenobiotic monooxygenase Năm 1994, Sutter cộng xác định gen CYP1B1 gồm 543 axit amin phân họ gen cytochrome P450, P4501B1 Bằng cách phân tích tế bào sinh dưỡng người động vật gặm nhấm, tác giả lập đồ gen CYP1B1 xác định gen nằm nhiễm sắc thể Năm 1996, Tang cộng phát gen CYP1B1 nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể vị trí 2p22.2 bao gồm exon, phần mã hóa gen exon thứ 2, chiều dài gen 1629 cặp base Từ việc xác định vị trí nối intron/exon gen CYP1B1, Stoilov cộng (1997) gen CYP1B1 có exon intron, dài 12 kb, mã hóa phân tử mRNA gồm 1.631 base Cụ thể nữa, gen CYP1B1 nằm từ cặp base số 38.067.602 đến 38.076.180 Trong loạt nghiên cứu nhiễm sắc thể 2, vùng chứa gen CYP1B1 xác định GLC3A Hình Vị trí gen CYP1B1 nhánh ngắn nhiễm sắc thể Năm 1998, Ivaylo Stoilov cộng xây dựng mơ hình ba chiều vùng C' tận (C-terminal) protein CYP1B1 Cấu trúc gồm bốn vùng I, L, J K với vùng gắn heme mô tả đột biến dẫn đến thiếu sản phẩm axit amin 189 254 axit amin từ terminus C Glu387, Arg390 Cys470 Hình Hình ảnh không gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 1.2.2 Chức năng, chế gây bệnh gen CYP1B1 Gen CYP1B1 phân họ cytochrome P450 Các cytochrome dòng P450 biết đến chủ yếu với khả chuyển hóa chất lạ sinh học (xenobiotics) có chức giống phân tử men Các cytochrome tham gia vào phản ứng oxy hóa như: sinh tổng hợp, sản xuất hormon cần thiết đóng vai trò hợp chất trao đổi chất trung gian hầu hết sinh vật sống Đột biến ảnh hưởng đến men thường tạo đột biến lặn Đối với đột biến lặn dạng dị hợp tử, alen bình thường có khả bù đắp chức cho alen bị đột biến Từ quan điểm này, kiểu hình lặn glơcơm bẩm sinh nguyên phát gây đột biến loại men CYP1B1 hợp lý Trong trình hình thành phát triển nhãn cầu, chức men CYP1B1 chưa rõ ràng, giả thiết đóng vai trò việc hình thành cấu trúc phía trước mắt tham gia vào q trình điều chỉnh tiết thủy dịch Schwartzman cộng năm 1987 xác định có mối liên quan arachidonate phụ thuộc cytochrome P450 với ức chế Na +, K +-ATPase giác mạc việc điều chỉnh tính suốt giác mạc tiết thủy dịch Phát phù hợp với mờ đục giác mạc tăng nhãn áp, tiêu chuẩn chẩn đốn cho bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Stoilov I (2000) đưa giả thuyết CYP1B1 chuyển hóa phân tử có nguồn gốc nội sinh (như steroid, axit béo hợp chất prostanoid) cần thiết cho phát triển bình thường chức mắt Hoạt động CYP1B1 hai dạng: tạo hợp chất hoạt động số mục tiêu ngừng tác dụng hợp chất sinh học khác chiếm vị trí Tuy nhiên phân tử chuyển hóa q trình kích hoạt có tổ chức men Vì vậy, CYP1B1 thuộc đường tín hiệu sinh hóa nội sinh chưa biết rõ, liên quan đến trưởng thành cuối góc tiền phòng Đột biến gen CYP1B1 gây rối loạn sản xuất men , làm bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè, nơi có ống tuyến giúp lưu thủy dịch khỏi mắt Sự ứ trệ thủy dịch làm tăng nhãn áp gây bệnh glôcôm Thể đột biến CYP1B1 Mất chức Đích tác động Thể hoang dại CYP1B1 Cơ chất Hoạt hóa hay Bất hoạt gắn heme Đột biến cắt cụt Đột biến vùng lề Đột biến vùng lõi Hình Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 Có khác biệt tác động thể hoang dại thể đột biến phân tử CYP1B1 Phân tử CYP1B1 thể hoang dại neo màng lưới nội nguyên sinh Chức bình thường đòi hỏi tham gia số đối tác oxy hóa khử P450 reductase P450 reductase có khả đưa nguyên tử phân tử oxy vào chất Khi có khả xảy ra: (B) trường hợp chất hoạt hóa tác động mục tiêu xi dòng chưa biết Tuy nhiên, oxy phân tử làm tăng khả ưa nước chất làm dễ dàng cho tiết lọc chất từ tế bào Bởi vậy, đột biến CYP1B1 làm thay đổi khả (C) điều hòa khơng gian thời gian gen kiểm soát phát triển góc tiền phòng bị thay đổi vắng mặt phân tử điều hòa (ví dụ steroid) sản sinh CYP1B1 Bên cạnh đó, dấu hiệu dừng phát triển góc tiền phòng quan sát thấy góc tiền phòng glơcơm bẩm sinh nguyên phát phản ánh ảnh hưởng q trình chuyển hóa giới hạn loại bỏ phân tử CYP1B1 CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH 2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Năm 1985, kỹ thuật PCR lần Kary Mullis phát minh, trình nhân DNA thực ống nghiệm mà không cần nhờ đến tế bào chủ vi khuẩn hay nấm men, đồng thời mở nhiều triển vọng nghiên cứu ứng dụng 2.1.1 Nguyên tắc chung Dựa vào hoạt tính DNA polymerase xúc tác tổng hợp mạch DNA từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu bốn loại nucleotid Phản ứng đòi hỏi có mặt mồi xi mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu trình tự DNA khn Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba bước: biến tính, bắt cặp, kéo dài chuỗi - Bước 1: giai đoạn biến tính (denaturation) Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm (nhiệt độ nóng chảy) phân tử, thường 94 oC - 95oC vòng 30 giây - phút - Bước 2: giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn, dao động khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây - phút - Bước 3: giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC DNA polymerase polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt Thời gian phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Sau chu kỳ chuỗi đôi ADN tạo thành tiếp tục dùng để làm DNA để tổng hợp DNA chu kỳ Sản phẩm cuối phản ứng PCR đoạn DNA chuỗi đơi có chiều dài khoảng cách hai đoạn gen mồi, hai đầu tận sản phẩm xác định đầu tận 5’ hai đoạn gen mồi Số lượng chu kỳ phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNA ban đầu, thường không vượt 40 chu kỳ Sau chu kỳ làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Như sau n chu kỳ, từ DNA đích nhân thành 2n Nhờ đủ số lượng DNA để tách điện di phát sau nhuộm để tạo dòng giải trình tự Trong trình thực phản ứng PCR, chu kỳ sau lượng khuôn tăng lượng mồi dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate) tự giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính tốn hàm lượng mồi, dNTP enzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết tốt Hình Các bước kỹ thuật PCR (Theo Andy Vierstraete, 1999) 2.1.2 Các thành phần tham gia phản ứng PCR DNA khuôn Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh yếu tố quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo sản phẩm xác Kích thước đoạn DNA khn nhỏ 3kb cho kết nhân gen tốt DNA khn mẫu chiết tách từ bạch cầu máu ngoại vi, từ mô sinh thiết, từ tinh dịch lâu ngày, từ tóc xương người chết, Lượng DNA khuôn thường dùng khoảng 100-1000 ng cho phản ứng PCR 25-50 μl Mồi Mồi đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30 nucleotid Để thực nhân đoạn DNA phản ứng PCR, cần có cặp mồi thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi mồi ngược Mồi xi có trình tự acid nucleic tương đồng với trình tự mạch đơn DNA khơng mang mã (mạch antisense), mồi xuôi bắt cặp đầu 3’ mạch antisense Mồi ngược có trình tự tương đồng với trình tự mạch DNA mang mã di truyền (mạch sense) bắt cặp với mạch sense đầu 3’ Nồng độ mồi phản ứng 0,1-0,5 μM Các nucleotid tự Gồm loại deoxynucleotid triphosphat (dNTPs): dATP, dTTP, dGTP dCTP, dùng làm chất để tổng hợp DNA Nồng độ dNTP loại khoảng 50-200μM cho phản ứng PCR Khi hàm lượng dNTP tự ít, tạo sản phẩm PCR khơng đủ để phát Ngược lại nồng độ dNTP cao phản ứng PCR khó thực Enzym DNA polymerase Là yếu tố đóng vai trò định hiệu phản ứng PCR Enzym thường sử dụng Taq polymerase, phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống nhiệt độ cao Hàm lượng enzym ảnh hưởng lớn đến hiệu PCR Khi hàm lượng enzym q ít, khơng đủ tạo sản phẩm PCR cần thiết Ngược lại, nhiều enzym, tạo sản phẩm PCR không đặc hiệu Thông thường lượng enzym Taq polymerase cần cho phản ứng tích 25 μl 0,5 U , Dung dịch đệm phản ứng Dung dịch đệm phản ứng PCR cần đảm bảo thành phần cần thiết cho hoạt động enzym DNA polymerase MgCl 2, KCl, Tris-HCl, Trong đó, Mg2+ thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu phản ứng PCR ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả bắt cặp gắn mồi với mạch khuôn Nồng độ Mg2+ thường 1-5mM 2.1.3 Phương pháp PCR thường sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - PCR đơn mồi (monoplex PCR) Là PCR kinh điển nhất, phản ứng PCR, sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại đoạn gen đặc hiệu từ phân tử DNA tế bào 10 Các tác giả sử dụng cặp mồi để khuếch đại exon gen CYP1B1 phản ứng PCR, sau điện di gel agarose, mẫu bệnh nhân tiến hành song song với mẫu đối chứng Nếu mẫu đối chứng xuất vạch DNA tương ứng với kích thước exon khuếch đại, mẫu bệnh nhân khơng xuất vạch bệnh nhân bị đột biến đoạn exon Để khuếch đại gen CYP1B1 bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, nghiên cứu trước sử dụng phương pháp PCR Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, gen CYP1B1 đột biến G61E nghiên cứu I Stoilov năm 1998 Hình Hình ảnh PCR-RFLP đột biến E229K 2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing) Giải trình tự gen (DNA sequencing) phương pháp xác định vị trí xếp nuceotid phân tử DNA Hiện nay, người ta thường sử dụng hai phương pháp giải trình tự phương pháp dideoxynucleotid giải trình tự máy tự động 2.2.1 Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid Phương pháp F Sanger, Smith Coulson phát năm 1977 Nguyên lý phương pháp sau: dideoxynucleotid (ddNTP) phân tử nhân tạo, cấu trúc tương tự phân tử deoxynucleotid 16 Hình 11 Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.3905del23bp Hình 12 Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.7900-7901delCG Nghiên cứu Ezequiel Campos-Mollo (2009) tiến hành 38 bệnh nhân phát 16 đột biến gen CYP1B1 có đột biến A106D, E173X, F261L, E262X, W341X P513_K514del 17 Hình 13 Hình ảnh đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân Tây Ban Nha Hình 14 Sơ đồ vị trí đột biến gen CYP1B1 Nghiên cứu tác giả Hee-Jung Kim Hàn Quốc năm 2011 sử dụng phương pháp Bi-directional sequencing phân tích 85 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát 22 bệnh nhân (chiếm 25,9%) mang 11 đột biến gen khác nhau, có trường hợp đồng hợp tử trường hợp dị hợp tử đột biến thay acid amin (1 đột biến p.G329S) đột biến xóa đoạn (1 đột biến làm lệch khung dịch mã p.V419Gfs11X) 18 Người bình thường Bệnh nhân Hình 15 Hình ảnh giải trình tự gen đột biến xóa đoạn làm lệch khung dịch mã p.V419Gfs11X Nghiên cứu Gronskov K cộng năm 2016 Đan Mạch dùng phương pháp Sanger sequencing để xác định 12 đột biến gen CYP1B1 gây bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát, có đột biến 12 đột biến gen bao gồm đột biến thay acid amin, đột biến tạo mã kết thúc (2 đột biến vô nghĩa đột biến lệch khung dịch mã), đột biến xóa đoạn đột biến lặp đoạn Nghiên cứu Đỗ Tấn cộng năm 2016 Việt Nam dùng phương pháp Bi-directional sequencing 30 bệnh nhân phát đột biến (chiếm 16,7%), có dạng đồng hợp tử dị hợp tử Bệnh nhân Bệnh nhân Người bình thường Người bình thường Hình 16 Hình ảnh giải trình tự gen đột biến c.364_363 insGACCGGCCGGCCTTCGCC, thêm acid amin (p.A121_S122insDRPAFA) đột biến thay acid amin p.L107V 19 2.3 Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) Hiện nay, kỹ thuật MLPA sử dụng nhiều nghiên cứu bệnh lý di truyền, cho phép phát tổn thương gen cách nhanh chóng 2.3.1 Chuẩn bị probe Trong phản ứng MLPA, vấn đế thiết kế probe gắn đặc hiệu với đoạn DNA đích đóng vai trò quan trọng Thông thường, probe chứa hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác (hình 14): - Phân tử oligonucleotid ngắn: Gồm đoạn: + Đoạn 1: Có trình tự nucleotid đặc hiệu với đoạn DNA đích lai với DNA đích tiến hành phản ứng lai, đoạn có khoảng 21-30 nucleotid nằm đầu 3’ probe + Đoạn 2: Nằm đầu 5’, chứa khoảng 19 nucleotid Trình tự nucleotid đoạn giống cho tất probe, vị trí gắn với mồi Y để khuyếch đại probe tiến hành phản ứng PCR - Phân tử oligonucleotid dài: cấu tạo gồm đoạn: + Đoạn 1’: Chứa 25-43 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích đầu tận 5’ + Đoạn 2’: Gồm 36 nucleotid đầu 3’, trình tự nucleotid giống cho tất probe Là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuyếch đại probe + Đoạn 3’: Còn gọi đoạn nucleotid đệm (stuffer) nằm hai đoạn 1’ 2’, cấu tạo gồm từ 19 đến 370 nucleotid Trình tự nucleotid khơng đặc hiệu với DNA đích nên khơng gắn vào DNA đích Chiều dài đoạn stuffer khác probe, probe khác có chiều dài 20 khác Do đó, sản phẩm khuyếch đại probe phân tách điện di , Hình 17 Các giai đoạn Kỹ thuật MLPA (theo Jan P Schouten, 2002) 2.3.2 Các bước tiến hành phản ứng MLPA - Mẫu DNA hòa với μl TE biến tính 98°C 5’ - Cho hỗn hợp chứa đoạn oligonucleotid probe vào - Hỗn hợp ủ 60°C vòng 16 (qua đêm) Hai đoạn lai phân tử oligonucleotid gắn với DNA đích đặc hiệu vị trí sát - Cho enzym ligase vào ủ 54°C 15 phút, enzym lipase xúc tác, nối hai đoạn oligonucleotid probe lại với Phản ứng nối chấm 21 dứt tăng nhiệt độ lên 98°C phút phản ứng PCR để khuyếch đại probe - Hai đầu 5’ 3’ probe có trình tự nucleotid hoàn toàn giống nhau, vị trí gắn mồi tiến hành phản ứng PCR Do vậy, cần dùng cặp mồi khuyếch đại toàn probe khác có hỗn hợp - Sau phản ứng PCR, probe khuyếch đại thành nhiều Các probe khác có kích thước khác độ dài đoạn đệm (stuffer) chúng khác Do vậy, chúng phân tách phương pháp điện di (thường sử dụng phương pháp điện di mao quản) Số lượng sản phẩm khuyếch đại probe tỷ lệ thuận với số copy đoạn DNA đích đặc hiệu với probe , 2.3.3 Phương pháp MLPA sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Nghiên cứu Kristy Damjanovich (2013) ứng dụng phương pháp MLPA để phát đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử gen CYP1B1 22 nhiễm sắc thể số bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Hình 18 Hình ảnh đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử (vùng màu hồng) gen CYP1B1 KẾT LUẬN Sự phát triển nhanh chóng cơng nghệ sinh học phân tử năm gần thay đổi cách rõ rệt hiểu biết mức độ phân tử nhiều bệnh lý khác có bệnh glơcơm bẩm sinh ngun phát Nhờ kỹ thuật sinh học phân tử đại, việc xác định đột biến gen CYP1B1 đưa nhìn đầy đủ nguyên nhân gây bệnh, phối hợp với lâm sàng giúp chẩn đoán, điều trị sớm, tiên lượng phòng bệnh cho bệnh nhân Với phát triển không ngừng sinh học phân tử, kỹ thuật chẩn đốn ngày hồn thiện cho kết nhanh, xác Song song với việc chẩn đốn bệnh, ngành cơng nghệ sinh học giúp tạo nhiều thuốc kỹ thuật DNA tái tổ hợp Bên cạnh đó, nhờ kỹ thuật sinh học phân tử, có nhiều phương pháp điều trị đời thu thành tốt liệu pháp điều trị thay gen, ghép tế bào gốc Hy vọng tương lai, bệnh lý di truyền nói chung bệnh glơcơm bẩm sinh 23 ngun phát nói riêng chẩn đốn sớm biện pháp can thiệp hợp lý nhằm giảm tỷ lệ mù lòa trẻ giảm tỷ lệ mắc bệnh cộng đồng TÀI LIỆU THAM KHẢO J D Watson F H Crick (1974), "Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid J.D Watson and F.H.C Crick Published in Nature, number 4356 April 25, 1953", Nature, 248(5451), tr 765 Robert N Weiss, Shaffer Daniel I (1970), "Congenital and pediatric glaucomas", Mosby, St Louis, tr 37 M Yang, X Guo, X Liu cộng (2009), "Investigation of CYP1B1 mutations in Chinese patients with primary congenital glaucoma", Mol Vis, 15, tr 432-7 Ji Hyun Lee, Chang-Seok Ki, Hee-Jung Kim cộng (2011), "Analysis of copy number variation using whole genome exon-focused array CGH in Korean patients with primary congenital glaucoma", Mol Vis , 17, tr 3583–3590 Mukesh Tanwar, Tanuj Dada, Ramanjit Sihota cộng (2009), "Mutation spectrum of CYP1B1 in North Indian congenital glaucoma patients", Mol Vis., 15, tr 1200–1209 Fuse N., Miyazawa A., Takahashi K cộng (2010), "Mutation spectrum of the CYP1B1 gene for congenital glaucoma in the Japanese population", Jpn J Ophthalmol., 54(1), tr 1-6 K Damjanovich, E E Baldwin, T Lewis cộng (2013), "Novel homozygous CYP1B1 deletion in siblings with primary congenital glaucoma", Ophthalmic Genet, 34(3), tr 180-1 T R Sutter, Y M Tang, C L Hayes cộng (1994), "Complete cDNA sequence of a human dioxin-inducible mRNA identifies a new gene subfamily of cytochrome P450 that maps to chromosome 2", J Biol Chem, 269(18), tr 13092-9 Y M Tang, Y Y Wo, J Stewart cộng (1996), "Isolation and characterization of the human cytochrome P450 CYP1B1 gene", J Biol Chem, 271(45), tr 28324-30 10 Stoilov I., Akarsu A N Sarfarazi M (1997), "Identification of three different truncating mutations in cytochrome P4501B1 (CYP1B1) as the principal cause of primary congenital glaucoma (buphthalmos) in families linked to the GLC3A locus on chromosome 2p21", Hum Molec Genet, 6, tr 641-647 11 M Sarfarazi, A N Akarsu, A Hossain cộng (1995), "Assignment of a locus (GLC3A) for primary congenital glaucoma (Buphthalmos) to 2p21 and evidence for genetic heterogeneity", Genomics, 30(2), tr 171-7 12 https://ghr.nlm.nih.gov/gene 13 Stoilov I., Akarsu A N., Alozie I cộng (1998), "Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1", Am J Hum Genet, 62, tr 573-584 14 Schwartzman M L., Balazy M., Masferrer J cộng (1987), "12(R)-hydroxyicosatetraenoic acid: a cytochrome-P450-dependent arachidonate metabolite that inhibits Na+,K+-ATPase in the cornea", 84(22), tr 8125-9 15 M Sarfarazi I Stoilov (2000), "Molecular genetics of primary congenital glaucoma", Eye (Lond), 14 ( Pt 3B), tr 422-8 16 Khất Hữu Thanh (2006), "Một số phương pháp sử dụng kỹ thuật gen", Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, chủ biên, Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, tr 137-64 17 Morse SA Lee HH, Olsvik O (1997), "Nucleic acid amplification technologies: application to disease diagnosis", Eaton Publishing, tr 49-60 18 Hames BD McPherson MJ, Taylor GR (1995), "Optimizing PCR", Oxford University Press, chủ biên, PCR 2- A practical approach, tr 1-22 19 Sorscher DH (1997), "DNA amplification techniques", Humana Press, chủ biên, Molecular Diagnostics, tr 98-101 20 Reece RJ (2004), "Polymerase chain reaction", John Wiley & Sons Ltd, chủ biên, Analysis of Genes and Genomes, tr 153-82 21 Thompson MW Worton RG (1988), "Genetics of Duchenne muscular dystrophy", Annu Rev Genet, 22 tr 601-29 22 Koolman J (2005), "DNA sequencing", Color Atlas of Biochemistry 2nd edition, tr 260-2 23 E Campos-Mollo, M P Lopez-Garrido, C Blanco-Marchite cộng (2009), "CYP1B1 mutations in Spanish patients with primary congenital glaucoma: phenotypic and functional variability", Mol Vis, 15, tr 417-31 24 H J Kim, W Suh, S C Park cộng (2011), "Mutation spectrum of CYP1B1 and MYOC genes in Korean patients with primary congenital glaucoma", Mol Vis, 17, tr 2093-101 25 K Gronskov, A Redo-Riveiro, L Sandfeld cộng (2016), "CYP1B1 Mutations in Individuals With Primary Congenital Glaucoma and Residing in Denmark", J Glaucoma, 25(12), tr 926-930 26 T Do, W Shei, P T Chau cộng (2016), "CYP1B1 and MYOC Mutations in Vietnamese Primary Congenital Glaucoma Patients", J Glaucoma, 25(5), tr 0000000000000331 27 T Lalic, R H Vossen, J Coffa cộng (2005), "Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA", Eur J Hum Genet, 13(11), tr 1231-4 28 McElgunn CJ Schouten JP, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002), "Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification", Nucleic Acids Res, tr 30(12):e57 29 Taylor GR Sellner LN (2004), "MLPA and MAPH: New Techniques for Detection of Gene Deletions", Human Mutation, 23, tr 413-9 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THU HÀ CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 TRONG BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 GEN CYP1B1 VÀ ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT 1.1 Cấu trúc vị trí gen CYP1B1 1.2.2 Chức năng, chế gây bệnh gen CYP1B1 CÁC KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 VÀ PHÁT HIỆN NGƯỜI LÀNH MANG GEN BỆNH 2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.1.1 Nguyên tắc chung 2.1.2 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 2.1.3 Phương pháp PCR thường sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát - PCR đơn mồi (monoplex PCR) 2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen (DNA sequencing) .10 2.2.1 Giải trình tự theo phương pháp dideoxynucleotid 10 2.2.2 Giải trình tự máy tự động 13 2.2.3 Phương pháp giải trình tự gen thường sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 15 2.3 Phương pháp MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) 19 2.3.1 Chuẩn bị probe 19 2.3.2 Các bước tiến hành phản ứng MLPA 20 2.3.3 Phương pháp MLPA sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát 21 KẾT LUẬN 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC HÌNH Hình Vị trí gen CYP1B1 nhánh ngắn nhiễm sắc thể .3 Hình Hình ảnh khơng gian chiều vùng C' tận protein CYP1B1 Hình Sơ đồ minh họa chế ảnh hưởng đột biến gen CYP1B1 Hình Các bước kỹ thuật PCR (Theo Andy Vierstraete, 1999) .8 Hình Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 2, 10 gen CYP1B1 đột biến G61E nghiên cứu I Stoilov năm 1998 .10 Hình Hình ảnh PCR-RFLP đột biến E229K .10 Hình Cấu trúc phân tử dNTP ddNTP 11 Hình Quá trình tổng hợp DNA bình thường (A) tổng hợp DNA bị ức chế (B) 12 Hình Quy trình giải trình tự theo phương pháp ddNTP 12 Hình 10 Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 bệnh nhân glơcơm bẩm sinh nguyên phát (Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein) 15 Hình 11 Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.3905del23bp 16 Hình 12 Hình ảnh đột biến xóa đoạn g.7900-7901delCG 16 Hình 13 Hình ảnh đột biến gen CYP1B1 bệnh nhân Tây Ban Nha 17 Hình 14 Sơ đồ vị trí đột biến gen CYP1B1 17 Hình 15 Hình ảnh giải trình tự gen đột biến xóa đoạn .18 làm lệch khung dịch mã p.V419Gfs11X 18 Hình 16 Hình ảnh giải trình tự gen đột biến 18 Hình 17 Các giai đoạn Kỹ thuật MLPA (theo Jan P Schouten, 2002) 20 Hình 18 Hình ảnh đột biến xóa đoạn dạng đồng hợp tử 22 ... nội dung "Các kỹ thuật thông dụng để xác định đột biến gen CYP1B1 bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát phát người lành mang gen bệnh " GEN CYP1B1 VÀ ĐỘT BIẾN GÂY BỆNH GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT 1.1... xác định 12 đột biến gen CYP1B1 gây bệnh Glơcơm bẩm sinh ngun phát, có đột biến 12 đột biến gen bao gồm đột biến thay acid amin, đột biến tạo mã kết thúc (2 đột biến vô nghĩa đột biến lệch khung... sử dụng phát đột biến gen CYP1B1 gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát Nghiên cứu Reddy A B (2004) Ấn Độ dùng phương pháp DNA sequencing phát 16 đột biến gen CYP1B1, có đột biến gồm đột biến xóa