Trường Đại học Y Hà Nội Bộ môn Dược lý Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam Độc lập - Tự - Hạnh phúc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN- KHÁNG NẤM CỦA VIÊN TRÌ THIÊN DƯỢC TRÊN IN VITRO Nơi tiến hành: - Khoa Vi sinh, bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương - Bộ môn Dược lý, trường Đại học Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: 7-8/2018 Cán tham gia nghiên cứu: PGS TS Phạm Thị Vân Anh PGS.TS Nguyễn Vũ Trung PGS.TS Vũ Thị Ngọc Thanh Ths.DS Nguyễn Thị Thanh Loan KTV Nguyễn Kiều Vân KTV Đinh Quang Trường KTV Đàm Đình Tranh I Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Thuốc nghiên cứu: Viên nang cứng Trĩ Thiên Dược sản xuất Công ty TNHH Thiên Dược, đạt tiêu chuẩn sở Bảng 3.1 Bảng cơng thức đóng viên nang Trĩ Thiên Dược STT Thành phần Tỷ lệ % viên (mg) 90,77% 590 Cao khô (hỗn hợp phân đoạn flavonoid DỀN GAI THS RAU SAM THS) Aerosil 0,62% Tinh bột 6,15% 40 Sodium Starch Glycolate 1,54% 10 Talc 0,46% Magnesi stearate 0,46% Tổng cộng 100% 650 Mỗi viên nang chứa 590mg hỗn hợp phân đoạn rau dền gai rau sam (gọi cao phân đoạn) Liều dùng dự kiến người: viên/ngày Tác dụng kháng khuẩn: Vật liệu nghiên cứu: Chủng vi sinh vật: 05 chủng chuẩn quốc tế Chủng vi khuẩn: S aureus, E coli, E faecalis, S pneumonia, P aeruginosa Thử tác dụng kháng nấm: chủng Nấm chủng: Candida albicans  Vật liệu cho nuôi cấy chủng vi sinh vật, phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thử: -Thạch máu -Thạch Uri select -Thạch thường -Thạch sabouraud Vật liệu cho xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dụng cụ khác: - Ống tube vô trùng - Nước muối sinh lý vô trùng - Thạch máu - Pipet nhựa vô trùng - Que cấy, đèn cồn, găng tay, lam kính Phương pháp nghiên cứu:  Thiết kế nghiên cứu: thử nghiệm phòng thí nghiệm Kỹ thuật tiến hành:  Ni cấy, phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thử: - Dùng que cấy lấy lượng dung dịch cần thử cấy lên môi trường thạch máu, uri select Ủ 370 C/18-24h - Định danh vi khuẩn mọc Chỉ thực bước không mọc số chủng thử nghiệm  Xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm: - Dùng pipet hút ml dung dịch thử nghiệm vào ống tube vô trùng - Pha loãng bậc dung dịch thử nghiệm vào ống tube (1, 2, 4, 8, 16…) nước muối sinh lý vô trùng, đánh dấu ống tube với độ pha loãng - ống chứng ống có nước muối sinh lý - Chuẩn bị huyền dịch: • Chủng vi khuẩn cần thử ni cấy thuần, qua đêm • Dùng que cấy lấy 3-5 khuẩn lạc hòa tan vào ống tube đựng nước muối sinh lý vô trùng 0,9%, điều chỉnh để đạt huyền dịch có nồng độ 0,5 Mac Farland (tương đương 108 CFU/1ml) • Trong vòng 15 phút sau, tiếp tục pha lỗng huyền dịch canh thang Muller-Hinton vô trùng (MHB) (đối với vi khuẩn dễ mọc) canh thang Muller-Hinton có 2,5 - 5% máu cừu (đối với S pneumoniae S agalactiae), để đạt nồng độ x 10 CFU/1ml (pha loãng 1:100 để đạt nồng độ 106 CFU/1ml, sau tiếp tục pha lỗng 1:2 để đạt nồng độ x 105 CFU/1ml) • Huyền dịch pha lỗng tiếp 1:100 sau 1:2 canh thang RPMI 1640 để đạt nồng độ x 103 - 2,5 x 104 tế bào/ 1ml - Dùng pipet hút 1ml huyền dịch sau pha loãng bước cuối cho vào ống chứng, tiếp đến ống tube chứa dung dịch thử nghiệm pha loãng từ nồng độ thấp đến nồng độ cao Như vậy, ống chứa ml, nồng độ tác nhân cần thử nồng độ vi khuẩn 1:2 - Ủ ống tube 350 C/18-24 h vi khuẩn, 48-96 với nấm - Sau thời gian ủ ấm trên, dùng que cấy lấy lượng dịch tube cấy vào đĩa thạch máu, đánh dấu đĩa thạch tương ứng với nồng độ pha loãng Ủ đĩa thạch 370 C/18-24 h, có khơng có CO tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, nấm cần thử - Kiểm tra đĩa thạch máu xem mọc vi khuẩn: đạt đĩa chứng, vi khuẩn mọc tốt tất đĩa vi khuẩn mọc nhất, tìm nồng độ ức chế tối thiểu: nồng độ mà tương ứng vi khuẩn khơng mọc mọc < 10 % so với đĩa chứng (bị ức chế >90 %) Trong nghiên cứu với chủng vi khuẩn pha loãng nồng độ: 1/1,1/2,1/4, 1/8, 1/16 so với dung dịch gốc Mỗi nồng độ n=5 cho chủng vi khuẩn, nấm Nhận định kết quả: tìm nồng độ thấp có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn nấm II Kết nghiên cứu: 2.1 Tác dụng kháng khuẩn Bảng 1: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên dược lên phát triển chủng vi khuẩn S aureus Nồng độ pha S aureus Lần Lần Lần Lần Lần loãng 1/1 + + + + 1/2 + + + + 1/4 + + + 1/8 + + + + 1/16 + + + + + Với chủng vi khuẩn S Aureus, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển vi khuẩn tất tỷ lệ pha loãng lần Do đó, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn Bảng 2: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên phát triển chủng vi khuẩn E coli Nồng độ pha E coli Lần Lần Lần Lần Lần loãng 1/1 + + + + 1/2 + + + + + 1/4 + + + 1/8 + + + + + 1/16 + + + + + Với chủng vi khuẩn E coli, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển vi khuẩn tất nồng độ pha loãng Vì vậy, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn Bảng 3: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên phát triển chủng vi khuẩn S faecalis Nồng độ pha S faecalis loãng Lần Lần Lần Lần Lần 1/1 - - - + - 1/2 + + - - + + + + - 1/4 1/8 + + + + + 1/16 + + + + + Với chủng vi khuẩn S faecalis, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển vi khuẩn tỷ lệ pha loãng lần Do đó, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn Bảng 4: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên phát triển chủng vi khuẩn S pneumoniae Nồng độ pha S pneumoniae loãng Lần Lần Lần Lần Lần 1/1 + + + + - 1/2 + + + + + 1/4 - + + + + 1/8 + + + + - 1/16 + + + + + Với chủng vi khuẩn S pneumoniae, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển vi khuẩn tất nồng độ pha loãng 1/1, 1/2, 1/4, 1/8 1/16 Vì vậy, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn Bảng 5: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên phát triển chủng vi khuẩn P aeruginosa Nồng độ pha P aeruginosa Lần Lần Lần Lần Lần loãng 1/1 + + + 1/2 + + + + 1/4 + + + + 1/8 + + + + + 1/16 + + + + + Với chủng vi khuẩn P aeruginosa, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển vi khuẩn tất tỷ lệ pha loãng Vì vậy, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi khuẩn 2.2 Tác dụng kháng nấm Bảng 6: Xác định tỷ lệ pha loãng thuốc thử Trĩ Thiên Dược lên phát triển chủng nấm Candida albican Nồng độ pha Candida albican Lần Lần Lần Lần Lần loãng 1/1 + + + + + + 1/2 + + + + 1/4 + + + + + 1/8 + + + + + 1/16 + + + + + Với chủng nấm Candida albican, thuốc thử Trĩ Thiên Dược không ức chế phát triển nấm tất tỷ lệ pha lỗng Vì vậy, chưa xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC thuốc thử Trĩ Thiên Dược với chủng vi nấm III Kết luận 3.1 Tác dụng kháng khuẩn: Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể tác dụng kháng chủng vi khuẩn 3.2 Tác dụng kháng nấm: Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể tác dụng kháng nấm Candida albican TÀI LIỆU THAM KHẢO Andrews, J M (2001), "Determination of minimum inhibitory concentrations".Journal of Antimicrobial Chemotherapy 48 (suppl 1): 5–16 Jump up^ Turnidge JD, Ferraro MJ, Jorgensen JH (2003), Susceptibility Test Methods: General Considerations In PR Murray, EJ Baron, JH Jorgensen, MA Pfaller, RH Yolken Manual of Clinical Microbiology 8th Ed Washington American Society of Clinical Microbiology p 1103 Jump up^ Davison, HC; Low, JC; Woolhouse, ME (2000), "What is antibiotic resistance and how can we measure it?" Trends in Microbiology (12): 554–9 Jump up^ O'Neill, AJ; Chopra, I (2004), "Preclinical evaluation of novel antibacterial agents by microbiological and molecular techniques." Expert Opinion on Investigational Drugs 13 (8): 1045–63 Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Trưởng nhóm nghiên cứu PGS.TS Phạm Thị Vân Anh Trường Đại học Y Hà Nội xác nhận Chữ ký PGS.TS Phạm Thị Vân Anh Trưởng phòng Tổ chức Cán ... III Kết luận 3.1 Tác dụng kháng khuẩn: Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể tác dụng kháng chủng vi khuẩn 3.2 Tác dụng kháng nấm: Thuốc thử Trĩ Thiên Dược chưa thể tác dụng kháng nấm Candida albican... người: viên/ ngày Tác dụng kháng khuẩn: Vật liệu nghiên cứu: Chủng vi sinh vật: 05 chủng chuẩn quốc tế Chủng vi khuẩn: S aureus, E coli, E faecalis, S pneumonia, P aeruginosa Thử tác dụng kháng nấm: ...Thuốc nghiên cứu: Viên nang cứng Trĩ Thiên Dược sản xuất Công ty TNHH Thiên Dược, đạt tiêu chuẩn sở Bảng 3.1 Bảng cơng thức đóng viên nang Trĩ Thiên Dược STT Thành phần Tỷ lệ % viên (mg)