TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ MÔN DƯỢC LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG AN THẦN CỦA CAO ĐẶC DƯỠNG TÂM AN THẦN TRÊN THỰC NGHIỆM Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dược lý Trường Đại học Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: Tháng 9-12/2015 Cán tham gia nghiên cứu: BSCK II Nguyễn Văn Tâm PGS.TS.Nguyễn Trần Thị Giáng Hương TS.Phạm Thị Vân Anh TS.Trần Thanh Tùng BS Nguyễn Chí Dũng BS.Phùng Văn Long ThS.Nguyễn Thanh Loan BS.Đinh Thị Tuyết Lan KTV Nguyễn Thành Long KTV Đàm Đình Tranh 1 NGUYÊN LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Cao lỏng Dưỡng tâm an thần túi 170mL 1,7kg cao đặc tương đương 7500 mL cao lỏng Liều người: túi cao lỏng/ngày x 170mL/túi = 340 mL cao lỏng/ngày (77,07 gam cao đặc/ngày) ≈ 1,54 gam cao đặc/kg/ngày Cao lỏng Dưỡng tâm an thần sản xuất bệnh viện Y dược học cổ truyền Thanh Hóa, đạt tiêu chuẩn sở 1.1.2 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủngSwiss, trọng lượng 22 - 25g, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột nuôi điều kiện đầy đủ thức ăn chuẩn, nước uống, độ ẩm, độ thơng khí ánh sáng thích hợp ngày trước nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu 1.1.3 Hóa chất,dụng cụ trang thiết bịnghiên cứu 1.1.3.1 Thuốc - hóa chất - Diazepam viên nén 5mg, tên biệt dược Seduxen (của công ty Gedeon Richter) - Nước muối 0,9% chai 500ml (của công ty B.Braun, Việt Nam) 1.1.3.2 Dụng cụ trang thiết bị - Trục quay Rotarod 7650, máy đo sức bám 7106, máy đo hoạt động ký Activity cage - Hãng Ugo-Basile – Italy - Mơ hình dấu cộng nâng cao theo cấu trúc kích thước theo hướng dẫn [1] - Găng tay, cốc nghiệm thủy tinh, kim đầu tù chuyên dụng dành cho chuột nhắt uống thuốc, bơm kim tiêm dùng lần - Bông, cồn 70% để vệ sinh máy móc sau lần đo 1.1.3.3 Dụng cụ trang thiết bị - Mơ hình dấu cộng nâng cao - Camera - Đồng hồ bấm giây 1.2 Phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Mơ hình dấu cộng nâng cao Mơ hình dấu cộng nâng cao thực theo phương pháp G Olayiwola cộng (2013) [1] Nghiên cứu thực nhằm mục đích đánh giá tác dụng giải lo âu thuốctrên chuột nhắt dựa tâm lý căng thẳng sợ hãi chuột khu vực hở, cao Mơ hình gồm có nhánh mở nhánh đóng đặt cao Hành vi lo sợ đặc trưng thời gian nhánh đóng số lần chuột vào nhánh đóng Tăng thời gian số lần nhánh mở hay giảm thời gian số lần nhánh đóng thể tác dụng an thần thuốc Cấu tạo mơ hình: Mơ hình chữ thập nâng cao (elevated plus maze) cho chuột nhắt bao gồm hai nhánh mở (30x5cm) vng góc với hai nhánh đóng (30x5x15cm), nối với vùng trung tâm (5x5cm), mơ hình nâng cao 60 cm so với mặt đất Ngồi rìa nhánh mở có gờ nhơ cao 0,4cm để chuột khơng bị rơi khỏi mơ hình Cường độ chiếu sáng thời gian làm thực nghiệm trì bóng đèn 60W Hình Mơ hình dấu cộng nâng cao [1] Tiến hành nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 15  Lô (n =10): (chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g  Lô (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg  Lô (n = 10): (DTAT liều tương đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12):uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg  Lô (n = 10): (DTAT liều gấp lâm sàng): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg - Chuột uống nước thuốc thử tương ứng ngày liên tiếp - Trước thử nghiệm thức chuột khám phá làm quen với chiều cao mơ hình vào ngày phút.Thử nghiệm thức tiến hành vào ngày - Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 60 phút trước tiến hành thử nghiệm - Sau uống thuốc 1h, chuột đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm mô hình hướng đầu vào nhánh mở, theo dõi phút - Chuột tính vào nhánh chân chuột đặt vào nhánh - Sau thử nghiệm, mơ hình lau cồn ethanol 70% - Các thử nghiệm ghi hình camera Chỉ số đánh giá: - Số lần chuột vào nhánh mở, số lần chuột vào nhánh đóng, thời gian chuột nhánh mở, thời gian chuột nhánh đóng - Tỷ lệ né tránh nhánh mở = (% số lần chuột nhánh đóng + % thời gian chuột nhánh đóng) x100%/2 Làm quen Đánh giá Ngày Chuột uống nước thuốc tương ứng Sơ đồứng nghiên cứu tác dụng an thần mô hình dấu cộng nâng cao 1.2.2 Mơ hình trục quay Rotarod: Nghiên cứu đánh giá tác dụng an thần tiến hành trục quay Rotarod, dựa theo mơ hình tác giả Shiotsuki H cộng [4] Hình Trục quay Rotarod Tiến hành nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô:  Lô (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g  Lô (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg (DTAT liều tương đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12)  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg.(DTAT liều gấp lâm sàng) - Chuột uống nước thuốc thử tương ứng ngày liên tiếp - Số liệu lấy vào thời điểm trước dùng thuốc; ngày thứ sau uống thuốc 1h sau uống thuốc 3h - Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước tiến hành thử nghiệm - Sau uống thuốc 1h 3h, chuột theo dõi thời gian bám chuột trục quay Chỉ số đánh giá: - Thời gian chuột trục quay thời điểm bắt đầu nghiên cứu, ngày thứ sau uống thuốc 1h 3h Ngày Ngày Sau 1h Chuột uống nước thuốc tương ứng ứng Ngày Sau 3h Thời điểm Sơ đồ nghiên cứu thời gian bám chuột trục quay Rotarod 1.2.3 Mơ hình đo hoạt động ký Mơ hình Hoạt động ký thực theo phương pháp Mill J cộng (2002) [3] Nghiên cứu thực nhằm mục đích đánh giá tác dụng giải lo âu thuốctrên chuột nhắt dựa hoạt động bình thường chuột điều kiện tối tiếng ồn Mơ hình gồm có lồng kính hình hộp chữ nhật với kích thước 40 x 40 x 30 cm, cảm biến di chuyển chuột thiết bị tự động ghi lại số lần hoạt động chuột Khi chuột mơi trường tối tiếng ồn chuột có xu hướng khám phá lồng biểu hoạt động di chuyển theo chiều ngang hoạt động di chuyển lên cao theo chiều dọc Giảm số lần di chuyển theo chiều ngang giảm số lần di chuyển theo chiều dọc thể tác dụng an thần thuốc Cấu tạo máy đo Hoạt động ký: Gồm có phần: - Phần 1: Một lồng nhựa suốt hình hộp chữ nhật có kích thước 40x 40x 30 cm, nắp phía có lỗ thơng khí mở để đưa chuột vào - Phần 2: Bốn cảm biến hoạt động chuột đặt song song bên thành lồng Hai song song phía cảm biến hoạt động di chuyển theo chiều ngang chuột, hai phía cảm biến hoạt động lên xuống theo chiều dọc chuột Cả di chuyển lên xuống để phù hợp với kích thước loại động vật - Phần 3: Thiết bị điện tử có hình hiển thị giúp tự động ghi lại hiển thị số lần di chuyển theo chiều ngang số lần di chuyển theo chiều dọc chuột Lồng ghi đặt mơi trường ánh sáng, tiếng ồn nhiệt độ phòng ổn định để giúp cho chuột có hoạt động bình thường Hình 2.1 Mơ hình máy đo hoạt động ký Tiến hành nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 15  Lô (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g  Lô (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3ml/kg (DTAT liều tương đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12)  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg.(DTAT liều gấp lâm sàng) - Chuột uống nước thuốc thử tương ứng ngày liên tiếp (chuột uống thuốc đói) - Số liệu lấy vào thời điểm trước uống thuốc, ngày thứ sau uống thuốc 1h sau uống thuốc 3h - Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước tiến hành thử nghiệm - Sau uống thuốc 1h 3h, chuột đặt nhẹ nhàng vào lồng hoạt động ký theo dõi phút - Khi chuột di chuyển thiết bị điện tử ghi lại sau hết phút ta ghi lại số liệu giấy - Sau thử nghiệm, lồng hoạt động ký lau chùi với cồn 70% - Để đảm bảo thời gian tác dụng thuốc, chia lô chuột thành lô nhỏ, cho uống thuốc cách 1h Chỉ số đánh giá: - Số lần chuột di chuyển theo chiều ngang - Số lần chuột di chuyển theo chiều dọc Ngày Ngày Sau 1h Sau 3h Thời điểm Chuột uống nước thuốc tương ứng ứng Sơ đồ nghiên cứu tác dụng an thần mơ hình Hoạt động ký 1.2.4 Mơ hình đo sức bám Mơ hình đo sức kéo chuột thực theo phương pháp Robert M.J Deacon [5] Hình Máy đo sức bám Tiến hành nghiên cứu: Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô, lô 15  Lô (n =10): (Chứng sinh học): uống nước cất 0,2 ml/10g  Lô (n = 10): (diazepam): uống diazepam liều 2,4 mg/kg  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 13,3 ml/kg (DTAT liều tương đương lâm sàng - hệ số ngoại suy 12)  Lô (n = 10): uống Dưỡng tâm an thần liều 39,9 ml/kg (DTAT liều gấp lâm sàng) - Chuột uống nước thuốc thử tương ứng ngày liên tiếp - Số liệu lấy vào thời điểm ngày thứ sau uống thuốc 1h sau uống thuốc 3h - Đưa chuột vào phòng nghiên cứu 30 phút trước tiến hành thử nghiệm - Sau uống thuốc 1h 3h, chuột đo sức bám máy Chỉ số đánh giá: - Sức bám thời điểm 1h 3h Ngày Ngày Sau 1h Sau 3h Thời điểm Chuột uống nước thuốc tương ứng ứng Hình 2.Sơ đồ nghiên cứu tác dụng thuốc sức bám 1.3 Phân tích xử lý số liệu Các số liệu xử lý thống kê phần mềm phần mềm Excel 2010 Số liệu biểu diễn dạng X±SD Kiểm định giá trị trung bình test T-Student Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê p ≤ 0,05 KẾT QUẢ 2.1 Mơ hình dấu cộng nâng cao Bảng 1: Ảnh hưởng cao đặc Dưỡng tâm an thần đến thời gian, số lần lưu lại nhánh mở, thời gian lưu lại nhánh đóng, tỷ số né tránh nhánh mở Thời gian lưu Thời gian lưu lại nhánh mở lại nhánh đóng (giây) (giây) Lô (Chứng sinh học) 53,1 ± 20,12 173,6 ± 38,75 2,3 ± 1,25 76,26 ± 8,47 Lô (Diazepam liều 2,4g/kg) 115,3 ± 31,67 128,8 ± 40,25 8,7 ± 3,62 53,06 ± 11,36 p < 0,001 p < 0,05 p < 0,001 p < 0,001 111,4 ± 42,3 106,9 ± 38,6 5,8 ± 2,49 50,97 ± 19,67 p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,01 p < 0,001 p < 0,01 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 123,4 ± 46,15 135,5 ± 36,03 4,1 ± 2,28 56,63 ± 12,17 p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,05 p < 0,05 p < 0,001 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p 0,05 p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 Lô p (so lô 1) Lô (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) Lô (Dưỡng tâm an thần liều gấp lâm sàng) Số lần vào nhánh mở Tỷ lệ né tránh nhánh mở (%) Nhận xét: Kết bảng cho thấy: Trên mơ hình dấu cộng nâng cao chuột lô uống diazepam lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần liều thể tác dụng giải lo âu so với lô chứng sinh học cách rõ rệt, kết thể hiện: Tăng thời gian lưu lại nhánh mở, tăng số lần vào nhánh mở, giảm tỷ lệ né tránh nhánh mở, rút ngắn thời gian lưu lại nhánh đóng Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với tất số, giá trị p 0,05 229,0 ± 95,2 178,5 ± 63,8 239,1 ± 62,6 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p > 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 232,9 ± 123,6 146,2 ± 94,0 244,3 ± 54,0 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p > 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 1) Lô (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) Lô (Dưỡng tâm an thần liều gấp lâm sàng) Nhận xét: Kết bảng cho thấy: Khơng có khác biệt lô thời gian bám chuột trục quay Rotarod thời điểm bắt đầu nghiên cứu - Tại thời điểm 1h sau dùng thuốc, diazepam lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần thể tác dụng an thần qua việc giảm thời gian bám trục quay Rotarod chuột nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p < 0,05) Tác dụng liều Dưỡng tâm an thần tương đương tương đương với diazepam (p>0,05) - Tại thời điểm 3h, lô uống diazepam uống cao đặc Dưỡng tâm an thần không tác dụng giảm thời gian bám chuột nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p> 0,05) 2.3 Mơ hình đo hoạt động ký Bảng 3: Ảnh hưởng cao đặc Dưỡng tâm an thần đến hoạt động di chuyển theo chiều ngang chuột 11 Số lần di chuyển theo chiều ngang Lô Trước NC Sau uống thuốc Sau uống thuốc 1h 3h (Sinh học) 241,80 ± 40,93 247,40 ± 37,30 247,20 ± 33,99 2(Diazepam liều 2,4g/kg) 245,20 ± 59,62 201,00 ± 47,40 196,53 ± 64,15 p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 243,40 ± 44,72 209,10 ± 40,75 208,43 ± 40,18 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 246,40 ± 47,40 208,30 ± 41,16 202,21 ± 46,27 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 1) (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) (Dưỡng tâm an thần liều gấp lâm sàng) Nhận xét: Kết bảng cho thấy: Trên mơ hình Hoạt động ký, chuột lô uống diazepam lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần thể tác dụng giải lo âu so với lô chứng sinh học thời điểm 1h 3h sau uống thuốc, kết thể hiện: Giảm số lần chuột di chuyển theo chiều ngang có ý nghĩa thống kê (p 0,05) Bảng 4: Ảnh hưởng cao đặc Dưỡng tâm an thần đến hoạt động di chuyển theo chiều dọc chuột Số lần di chuyển theo chiều dọc Lô (Sinh học) Trước NC 19,30 ± 6,07 12 Sau uống thuốc Sau uống thuốc 1h 3h 20,60 ± 5,46 20,20 ± 3,65 2(Diazepam liều 2,4g/kg) 18,87 ± 5,14 12,67 ± 3,81 13,53 ± 3,58 p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 19,14 ± 4,69 16,00 ± 3,04 15,64 ± 3,61 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 19,79 ± 6,99 14,93 ± 4,45 14,43 ± 4,20 p (so lô 1) p > 0,05 p < 0,05 p < 0,05 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 1) (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) (Dưỡng tâm an thần liều gấp lâm sàng) Nhận xét: Kết bảng cho thấy: Trên mơ hình Hoạt động ký, chuột lô uống diazepam lô uống cao đặc Dưỡng tâm an thần thể tác dụng giải lo âu so với lô chứng sinh học thời điểm 1h 3h sau uống thuốc, kết thể hiện: Giảm số lần chuột di chuyển theo chiều dọc có ý nghĩa thống kê (với p 0,05) 2.4 Mơ hình đo sức bám: Bảng 1: Ảnh hưởng cao đặc Dưỡng tâm an thần đến sức bám chuột Lô Lực bám chuột (g) Sau uống thuốc 1h Sau uống thuốc 3h Lô (Chứng sinh học) 353,20 ± 60,85 352,13 ± 63,13 Lô (Diazepam liều 2,4g/kg) 261,73 ± 62,64 286,20 ± 72,83 p < 0,001 p < 0,05 226,93 ± 71,52 247,33 ± 63,06 p < 0,001 p < 0,001 p (so lô 1) Lô (Dưỡng tâm an thần liều lâm sàng) p (so lô 1) 13 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 248,20 ± 46,89 250,40 ± 41,06 p (so lô 1) p < 0,001 p < 0,001 p (so lô 2) p > 0,05 p > 0,05 p (so lô 3) p > 0,05 p > 0,05 Lô (Dưỡng tâm an thần liều gấp lâm sàng) Nhận xét: Kết bảng cho thấy: Tại thời điểm 1h 3h sau dùng thuốc, diazepam thể tác dụng giảm rõ rệt sức bám chuột nghiên cứu so với lô chứng sinh học (p