TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam BỘ MÔN DƯỢC LÝ Độc lập – Tự – Hạnh phúc KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƯ TRÊN INVITRO VÀ TÁC DỤNG ĐIỀU HÒA MIỄN DỊCH CỦA CÁC MẪU CAO KHÔ HH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BỊ GÂY SUY GIẢM MIỄN DỊCH BẰNG CYCLOPHOSPHAMID Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội Thời gian tiến hành nghiên cứu: 09-10/2018 Hà Nội – 2018 MỤC LỤC CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Thuốc nghiên cứu 1.2 Hóa chất máy móc phục vụ nghiên cứu .1 1.2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro 1.2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm .2 1.3 Đối tượng nghiên cứu 1.4 Phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro 1.4.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm .4 1.5 Xử lý số liệu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro 2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm .7 2.2.1 Đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch 2.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 17 2.4 Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể 20 KẾT LUẬN 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO .22 CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1.Thuốc nghiên cứu - Thuốc nghiên cứu: Các mẫu bột cao khô HH Mẫu bột cao khô HH1 HH2 HH3 Liều người g/ngày g/ngày g/ngày Trong đó, tỷ lệ bột cao khô sau: Mẫu Bán chi liên Tỷ lệ thành phần Bạch hoa xà thiệt Nấm linh chi thảo HH1 3 HH2 HH3 1.2.Hóa chất máy móc phục vụ nghiên cứu 1.2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro - Hóa chất + Trypsin 10x hãng Sigma + RPMI 1640 hãng Gibco, Invitrrogen + DMEM hãng Gibco, Invitrrogen + FBS hãng Gibco, Invitrogen + PBS hãng Gibco, Invitrrogen + Peicilin-streptomycin hãng Gibco, Invitrrogen + Doxorubicin Sigma, Mỹ - Thiết bị, dụng cụ: + Tủ ấm Sanyo (Nhật) + Tủ thao tác laminar Telstar + Kính hiển vi soi ngược Axiovert 25 CFL Carl-Zeiss, Đức + Máy li tâm Beckman Coulter + Bình ổn nhiệt Shellab, Mỹ + Nồi hấp Human, Đức, Model SS-325 + Máy đo ELISA hãng Human Đức + Buồng đếm Thoma (Đức) + Các loại vật tư tiêu hao dùng nuôi cấy tế bào in vitro chai T25, đĩa pettri cỡ, đĩa 96 giếng, ống ly tâm falcon 50ml 15ml, 1,5ml, pipet đầu loại 1.2.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm - Cyclophosphamid: dạng thuốc bột, biệt dược Endoxan lọ 200 mg hãng ASTA Medica, Đức - Levamisol dạng bột trắng hãng Sigma, Mỹ - Nhũ dịch OA + Pha dung dịch Al(OH)3 0,2%: 200 mg + NaCl 0,9% = vừa đủ 100 mL + Pha nhũ dịch OA = lòng trắng trứng + Al(OH)3 theo tỷ lệ 1:4 tương ứng - Máu cừu tube 10 mL Công ty Nam Khoa (Nam Khoa Biotek) cung cấp - Kit ELISA định lượng IL2, TNFα, IgM hãng Cloud-Clone Corp, Mỹ 1.3 Đối tượng nghiên cứu - Các dòng tế bào ung thư dùng nghiên cứu invitro STT Ký hiệu Dòng tế bào ung thư A549 Dòng tế bào ung thư phổi Hela Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HepG2 Dòng tế bào ung thư gan MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú PANC-1 Dòng tế bào ung thư tụy RD Dòng tế bào ung thư tim NCI-N87 Dòng tế bào ung thư dày OVCAR-8 Dòng tế bào ung thư buồng trứng - Chuột nhắt trắng chủng Swiss, chủng, hai giống, nặng 20  gam Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp dùng nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch 1.4.Phương pháp nghiên cứu 1.4.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro Các dòng tế bào lưu giữ nitơ lỏng, đánh thức trì môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), RPMI 1640 có bổ sung huyết bê 10%, dung dịch kháng sinh kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L streptomycin 50 mg/L) Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào dùng làm thí nghiệm Tế bào cấy chuyển vào đĩa 96 với mật độ 8.000 tế bào/giếng, để tế bào bám dính ổn định qua đêm ủ với mẫu nghiên cứu, nuôi cấy điều kiện 370C, 5% CO2, 95% độ ẩm 24 Tiếp theo, từ dung dịch gốc mẫu nghiên cứu mẫu đối chứng dương hòa lỗng với mơi trường nuôi cấy thành dải nồng độ 200 100 µg/mL Mẫu thử sau tra vào giếng có chứa tế bào để thăm dò độc tính mẫu phát triển tế bào Những mẫu thể độc tính mạnh (ở nồng độ 100 µg/ml có khả ức chế 50% phát triển tế bào so với giếng đối chứng) tiến hành thí nghiệm để tìm giá trị IC50 Để tìm giá trị IC50, mẫu thử có nồng độ khác tương ứng 6,25; 12,5; 25; 50; 100 µg/ml tra vào giếng có chứa tế bào Ủ tế bào với mẫu nghiên cứu 48 để mẫu thử phát huy tác dụng Kết thúc 48 ủ mẫu, bổ sung 20 µl MTT 5mg/mL vào giếng ủ điều kiện nuôi cấy Tại tế bào sống 3-(4,5-Dimethyl2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide có màu vàng bị biến đổi thành tinh thể formazan bị hòa tan dung mơi DMSO tạo dung dịch màu tím Đo mật độ quang bước sóng 540 nm với bước sóng tham khảo 630 nm Mật độ quang bước sóng 540 nm phản ánh số lượng tế bào sống sót giếng so sánh với giếng chứng ủ với dung môi pha mẫu Tỷ lệ % tế bào sống sau xử lý thuốc so với chứng trắng (tế bào không ủ với mẫu thử, ủ với dung môi pha mẫu chứa 0,25% DMSO) tính theo cơng thức sau: % tế bào sống = % ức chế = 100% - % tế bào sống sót Mỗi nồng độ mẫu thử tiến hành lặp lại giếng, thí nghiệm lặp lại lần 1.4.2 Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm Tiêm màng bụng cyclophosphamid (CY), liều 200 mg/kg thể trọng để gây suy giảm miễn dịch Chuột nhắt trắng chia ngẫu nhiên thành lô nghiên cứu Chuột lô uống thuốc thử tiêm màng bụng CY gây mô hình suy giảm miễn dịch sau: ST T Lô nghiên cứu Uống thuốc thử Tiêm màng bụng CY Chứng sinh học Mơ hình Chứng dương HH1 liều cao HH1 liều thấp Nước cất 0,2 mL/10 g Nước cất 0,2 mL/10 g Levamisol 100 mg/kg/ngày HH1 liều 2,88 g/kg/ngày HH1 liều 0,96 g/kg/ngày Khơng Có Có Có Có ST T Lô nghiên cứu Uống thuốc thử Tiêm màng bụng CY HH2 liều cao HH2 liều 2,88 g/kg/ngày HH2 liều thấp HH2 liều 0,96 g/kg/ngày HH3 liều cao HH3 liều 2,88 g/kg/ngày HH3 liều thấp HH3 liều 0,96 g/kg/ngày Mơ hình nghiên cứu tiến hành ngày Có Có Có Có Chuột bắt đầu uống nước cất thuốc liên tục từ ngày thứ đến ngày thứ nghiên cứu Trong thời gian uống thuốc: - Ngày thứ 2: chuột tất lô gây mẫn cảm tiêm màng bụng hồng cầu cừu 5% (0,5 mL/chuột) tiêm da gáy kháng nguyên OA (Al(OH)3 + ovalbumin) (0,1 mL/chuột) - Ngày thứ 4: tiêm màng bụng CYP liều 200 mg/kg cho lô đến 16 - Ngày thứ 7: tiêm phát 50 μl kháng nguyên OA vào bên gan bàn chân chuột, bên lại tiêm thể tích tương tự dung dịch NaCl 0,9% Sau 24 tiêm phát vào gan bàn chân chuột, tiến hành xác định số nghiên cứu bao gồm: - Cân trọng lượng - Đo bề dày bàn chân chuột thước palmer → xác định % tăng bề dày chân chân tiêm OA chân tiêm NaCl 0,9% - Lấy máu động mạch cảnh + Xác định số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu + Nồng độ IL2, TNFα, IgM huyết - Lấy lách, tuyến ức: + Cân trọng lượng + Quan sát hình ảnh đại thể lách, tuyến ức lô chuột + Giải phẫu mô bệnh học lách, tuyến ức 30% số chuột lô 1.5 Xử lý số liệu Các số liệu nghiên cứu biểu diễn dạng ± SD ± SE, xử lý thống kê theo thuật toán thống kê T-test Student phần mềm Microsoft Excel 2010 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 p < 0,05 p < 0,01 p < 0,001 Khác biệt so với lô chứng sinh học * ** *** Khác biệt so với lô mô hình + ++ +++ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 2.1 Nghiên cứu sàng lọc tác dụng chống ung thư invitro Các mẫu thử pha tan hoàn toàn Dimethyl Sulfoxide (DMSO) sau pha lỗng thành nồng độ thử dòng tế bào ung thư Ban đầu mẫu thử tiến hành sàng lọc độc tính nồng độ 200 100 µg/mL Do nồng độ 200 µg/ml xuất hiện tượng mẫu cao chiết tủa lại giếng nuôi cấy tế bào, mẫu có khả ức chế lớn 50% nồng độ 100 µg/ml tiến hành tìm giá trị IC50 Kết sàng lọc trình bày Bảng Bảng Tỷ lệ % ức chế sống sót tế bào tác dụng mẫu thử Dòng tế bào ung thư HepG2 Nồng độ HH1 100 200 PANC-1 NCI-N87 RD Nồng độ HH3 100 200 µg/mL 17,13 ± µg/mL 22,51 ± µg/mL 21,23 ± µg/mL 24,91 ± µg/mL 23,54 ± µg/mL 32,85 ± 1,71 1,04 14,44 ± 0,81 1,29 14,17 ± 1,41 1,72 A549 MCF7 Nồng độ HH2 100 200 / / / 23,94 ± 4,60 48,62 ± 25,50 ± 47,02 ± 1,78 18,79 ± 2,38 9,17 ± 1,57 13,87 ± 2,71 6,65 ± 0,99 10,29 ± 3,20 3,27 ± 3,19 4,41± 4,40 3,29 0,43 37,75± / 2,74 12,34 ± 0,58 21,33 ± / 3,78 8,23 ± 8,66 ± 32,37 ± 2,88 30,85± 3,74 51,68 ± 3,04 3,32 6,32 ± 3,42 2,00 3,01 1,84 10,99 ± 13,48 ± 3,59 44,65 ± 0,91 11,84 ± Hela / OVCAR / / 1,29 8,03 ± / / / 3,27± 10,47 ± 4,51 ± 3,79 6,58 ± 1,34 1,60 1,85 1,41 1,52 Kết bảng cho thấy: Nồng độ 200 µg/mL, ba mẫu cao chiết HH1, HH2 HH3 thể tác dụng độc tế bào dòng tế bào: dòng tế bào ung thư vú MCF7, dòng tế bào ung thư tim RD dòng tế bào ung thư gan HepG2 Tuy nhiên mức độ gây độc chưa cao, dao động từ khoảng 20% đến 50% Trong số mẫu thử, mẫu HH3 có % ức chế cao hai mẫu lại ba dòng tế bào Như vậy, ba mẫu cao nghiên cứu khơng có độc tính mạnh nồng độ 200 µg/mL dòng tế bào ung thư thực thí nghiệm Do khơng có mẫu cao lựa chọn để nghiên cứu tiếp tìm giá trị nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào (IC50) Bảng Giá trị IC50 doxorubucin dòng tế bào ung thư Dòng tế bào HepG2 A549 IC50 1,31 4,50 Dòng tế bào NCI-N87 RD IC50 2,09 0,80 MCF7 PANC-1 1,85 2,76 Hela OVCAR8 2,13 2,33 Thí nghiệm tiến hành song song với chất đối chứng dương doxorubucin hãng Sigma, giá trị IC50 chất đối chứng dương trình bày Bảng Chất đối chứng dương thể độc tính mạnh dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 nhỏ 2.2.Nghiên cứu tác dụng kích thích miễn dịch động vật thực nghiệm 2.2.1 Đánh giá tình trạng chung hệ miễn dịch Bảng Ảnh hưởng mẫu cao khô HH lên trọng lượng lách tuyến ức tương đối ST T Trọng lượng tương đối (‰) Lách Tuyến ức Chứng sinh học 6,43 ± 1,03 3,22 ± 0,64 Mơ hình 2,99 ± 0,59*** 0,82 ± 0,18*** Levamisol 3,32 ± 0,71 0,67 ± 0,22 + HH1 liều cao 3,93 ± 1,25 0,67 ± 0,21 HH1 liều thấp 3,60 ± 1,08 0,74 ± 0,13 HH2 liều cao 2,98 ± 0,79 0,93 ± 0,23 HH2 liều thấp 3,52 ± 0,77 0,70 ± 0,10 HH3 liều cao 2,65 ± 0,82 0,68 ± 0,19 HH3 liều thấp 2,85 ± 0,64 0,77 ± 0,17 Kết bảng cho thấy: Lơ nghiên cứu - Lơ mơ hình: Trọng lượng lách tương đối trọng lượng tuyến ức tương đối giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 - Lô uống levamisol: + Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lơ mơ hình, nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) + Trọng lượng tuyến ức tương đối khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) - Các lơ uống cao khơ HH1: + Trọng lượng lách tương đối có xu hướng tăng so với lơ mơ hình, mức tăng lơ uống liều cao có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình (p < 0,05) + Trọng lượng tuyến ức tương đối lô uống cao khơ HH1 khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) - Các lô uống cao khô HH2 HH3: Trọng lượng lách tuyến ức tương đối khơng có khác biệt so với lơ mơ hình (p > 0,05) Bảng Kết giải phẫu vi thể lách (Tổ chức lympho ngoại biên lớn thể) Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lô Lách 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào tủy trắng 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nặng tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào tủy trắng 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh lách bình thường 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ nhẹ tế bào tủy trắng 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm mức độ vừa tế bào tủy trắng Bảng Kết giải phẫu vi thể tuyến ức (Tổ chức lympho trung ương quan trọng thể) Tuyến ức Lơ 3/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường Lơ 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lô 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào 1/3 mẫu bệnh phẩm có hình ảnh tuyến ức bình thường Lơ 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lô 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lô 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lô 3/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào Lô 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm nhẹ lympho bào Lô Tuyến ức 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lô 2/3 mẫu bệnh phẩm giảm vừa lympho bào 1/3 mẫu bệnh phẩm giảm nặng lympho bào Lách bình thường Tuyến ức bình thường Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô chứng sinh học (chuột số 3) Lách giảm nặng tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lơ mơ hình (chuột số 99) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 15) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 108) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức bình thường Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô uống levamisol (chuột số 109) 10 Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH1 liều cao (chuột số 38) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH1 liều cao (chuột số 134) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH1 liều thấp (chuột số 139) 11 Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lơ HH1 liều thấp (chuột số 142) Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình 10 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH2 liều cao (chuột số 50) Lách giảm nặng tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình 11 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH2 liều cao (chuột số 143) 12 Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình 12 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH2 liều thấp (chuột số 152) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình 13 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH2 liều thấp (chuột số 154) Lách bình thường Tuyến ức giảm nhẹ lympho bào Hình 14 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH3 liều cao (chuột số 59) 13 Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình 15 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH3 liều cao (chuột số 160) Lách giảm nhẹ tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm vừa lympho bào Hình 16 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH3 liều thấp (chuột số 66) Lách giảm vừa tế bào tủy trắng Tuyến ức giảm nặng lympho bào Hình 17 Hình ảnh vi thể lách tuyến ức lô HH3 liều thấp (chuột số 164) 14 Số lượng bạch cầu (G/l) 4.5 3.5 2.5 1.5 0.5 *** Lô (chứng sinh học) Lô (HH1 liều cao) Lô (HH2 liều thấp) +++ Lơ (mơ hình) Lơ (HH1 liều thấp) Lô (HH3 liều cao) Lô (Levamisol) Lô (HH2 liều cao) Lô (HH3 liều thấp) Biểu đồ Ảnh hưởng mẫu cao khô HH đến số lượng bạch cầu máu ngoại vi Kết biểu đồ cho thấy: - SLBC lơ mơ hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,001) - Levamisol làm tăng có ý nghĩa thống kê SLBC so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Các mẫu cao khô HH không làm thay đổi số lượng bạch cầu so với lơ mơ hình (p > 0,05) Bảng Ảnh hưởng mẫu cao khô HH đến công thức bạch cầu máu ngoại vi Số lượng tuyệt đối loại bạch cầu (BC/mm3) Lô nghiên cứu BC lympho BC trung tính BC mono Chứng sinh học 3080 ± 940 1080 ± 340 420 ± 120 Mô hình 1030 ± 320*** 380 ± 120*** 190 ± 60*** + ++ Levamisol 1410 ± 550 550 ± 180 140 ± 50+ HH1 liều cao 660 ± 200++ 560 ± 180++ 220 ± 60 + ++ HH1 liều thấp 740 ± 270 590 ± 180 220 ± 40 HH2 liều cao 920 ± 230 330 ± 100 150 ± 50 HH2 liều thấp 890 ± 240 430 ± 140 240 ± 80 HH3 liều cao 1040 ± 240 290 ± 90 140 ± 50 HH3 liều thấp 1140 ± 390 390 ± 130 180 ± 60 Kết bảng cho thấy: - Số lượng tuyệt đối dòng BC lơ mơ hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,001) Levamisol liều 100 mg/kg/ngày có tác dụng khơi phục số lượng tuyệt đối dòng BC trung tính lympho so sánh với lơ mơ hình (p < 0,05 p < 0,01) 15 - Các lô uống cao khô HH1 có số lượng tuyệt đối dòng BC trung tính tăng có ý nghĩa thống kê so với lơ mơ hình (p < 0,05), khơng có tác dụng phục hồi số lượng tuyệt đối dòng BC lympho mono so với lơ mơ hình (p > 0,05) - Các mẫu cao khô HH2 HH3 không làm thay đổi số lượng tuyệt đối dòng BC so với lơ mơ hình (p > 0,05) 16 2.3.Đánh giá đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào Bảng Ảnh hưởng mẫu cao khơ HH đến phản ứng bì với kháng ngun OA Lơ nghiên cứu Phản ứng bì (% tăng) Lô (chứng sinh học) 59,42 ± 13,79 Lô (mơ hình) 43,75 ± 10,08** Lơ (levamisol) 68,01 ± 14,22+++ Lô (HH1 liều cao) 40,61 ± 11,28 Lô (HH1 liều thấp) 51,04 ± 11,64 Lô (HH2 liều cao) 40,76 ± 12,81 Lô (HH2 liều thấp) 47,23 ± 13,25 Lô (HH3 liều cao) 58,58 ± 16,88+ Lô (HH3 liều thấp) 46,19 ± 13,31 Số liệu bảng cho thấy: - Phản ứng bì lơ mơ hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học (p < 0,01) - Levamisol làm tăng có ý nghĩa thống kê phản ứng bì với kháng ngun OA so với lơ mơ hình (p < 0,05 p < 0,001) - Các mẫu cao khô HH1, HH2 khơng ảnh hưởng đến phản ứng bì với kháng ngun OA so sánh với lơ mơ hình (p > 0,05) - Mẫu cao khơ HH3 có xu hướng làm tăng phản ứng bì với kháng nguyên OA so với lơ mơ hình, mức tăng lơ uống HH3 liều cao có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 17 Bảng Ảnh hưởng mẫu cao khô HH đến nồng độ TNFα Lô nghiên cứu Nồng độ TNFα (pg/mL) Lô (chứng sinh học) 786,59 ± 124,84 Lơ (mơ hình) 666,66 ± 118,77* Lô (levamisol) 876,63 ± 119,04+++ Lô (HH1 liều cao) 726,56 ± 199,20 Lô (HH1 liều thấp) 723,85 ± 147,85 Lô (HH2 liều cao) 626,59 ± 191,16 Lô (HH2 liều thấp) 758,94 ± 189,04 Lô (HH3 liều cao) 599,17 ± 192,36 Lô (HH3 liều thấp) 699,78 ± 206,43 Kết bảng cho thấy: - Nồng độ TNFα huyết lơ mơ hình giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh học (p < 0,05) - Levamisol làm tăng đáng kể nồng độ TNFα so với lơ mơ hình (p < 0,001) - Các mẫu cao khô HH1, HH2, HH3 không làm thay đổi nồng độ TNFα huyết so với lơ mơ hình (p > 0,05) 18 Bảng Ảnh hưởng mẫu cao khô HH đến nồng độ IL-2 Lô nghiên cứu Nồng độ IL-2 (pg/mL) Lô (chứng sinh học) 68,57 ± 12,75 Lơ (mơ hình) 62,58 ± 12,98 Lơ (levamisol) 56,31 ± 10,10 Lô (HH1 liều cao) 54,98 ± 14,24 Lô (HH1 liều thấp) 51,10 ± 15,91 Lô (HH2 liều cao) 53,35 ± 16,68 Lô (HH2 liều thấp) 54,19 ± 13,68 Lô (HH3 liều cao) 57,57 ± 11,88 Lô (HH3 liều thấp) 55,61 ± 11,29 Kết bảng cho thấy: - Nồng độ IL-2 lô tiêm CYP (lô đến lơ 9) có xu hướng giảm so với lô chứng sinh học), nhiên khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p>0,05) - Các lơ uống levamisol mẫu cao khô HH tác dụng cải thiện nồng độ IL-2 so với lơ mơ hình (p>0,05) 19 2.4.Đánh giá đáp ứng miễn dịch dịch thể Bảng 10 Ảnh hưởng mẫu cao khô HH đến nồng độ IgM Lô nghiên cứu Nồng độ IgM (ng/mL) Lô (chứng sinh học) 45083,33 ± 14285,77 Lơ (mơ hình) 31818,18 ± 6735,25* Lơ (levamisol) 42000,00 ± 12093,39+ Lô (HH1 liều cao) 46700,00 ± 13848,79++ Lô (HH1 liều thấp) 47222,22 ± 13245,54++ Lô (HH2 liều cao) 51166,67 ± 14571,66+++ Lô (HH2 liều thấp) 34000,00 ± 9291,57 Lô (HH3 liều cao) 47545,45 ± 14949,00++ Lô (HH3 liều thấp) 40100,00 ± 12269,66 Kết bảng 10 cho thấy: - Nồng độ IgM lơ mơ hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p