BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HỒNG XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ MINH HỒNG 1401257 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG LUTEIN VÀ ZEAXANTHIN TRONG THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà ThS Nguyễn Thị Hồng Ngọc Nơi thực Bộ mơn Hóa phân tích – Độc chất Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2019 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian nghiên cứu thực đề tài, lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà Th.S Nguyễn Thị Hồng Ngọc – người thầy trực tiếp hướng dẫn, quan tâm bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến anh chị nghiên cứu viên, kĩ thuật viên Viện Kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, thầy giáo Bộ mơn Hóa Phân tích- Độc chất – người tận tình giúp đỡ tạo điều kiện cho em nghiên cứu hoàn thành đề tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Bộ mơn Hóa phân tích- Độc chất Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ Sinh Thực phẩm Quốc gia Đã tạo điều kiện hỗ trợ cho em hoàn thành nghiên cứu Và cuối em xin bày tỏ lòng u thương, biết ơn tới gia đình bạn bè người động viên, đồng hành em trong suốt q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng năm 2019 Sinh viên Lê Minh Hồng Mục lục Đặt vấn đề Chương Tổng quan 1.1 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Thực phẩm bảo vệ sức khỏe mắt .2 1.2 Carotenoid .2 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Tác dụng sinh học chung 1.3 Lutein zeaxanthin .3 1.3.1 Cơng thức cấu tạo tính chất vật lý, hóa học .3 1.3.2 Nguồn gốc tự nhiên lutein zeaxanthin .4 1.3.2.1 Thực phẩm 1.3.2.2 Nguồn nguyên liệu sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe 1.3.3 Công dụng .5 1.3.3.1 Lutein zeaxanthin bệnh thoái hóa điểm vàng lão hóa 1.3.3.2 Các tác dụng khác sức khỏe người (kết từ nghiên cứu in vitro, tập, dịch tễ thử nghiệm lâm sàng) .6 1.3.3.3 Công dụng ngành công nghiệp sản xuất chế biến thực phẩm .7 1.4 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin .7 1.4.1 Các phương pháp chung 1.4.2 Các phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu cao với detector PDA 11 1.4.2.1 Điều kiện phân tích mẫu .11 1.4.2.2 Điều kiện xử lý mẫu .11 Chương Nguyên liệu, thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Nguyên vật liệu, hóa chất .17 2.1.2 Chất chuẩn 17 2.1.2.1 Chất chuẩn 17 2.1.2.2 Phương pháp chuẩn bị dung dịch chuẩn .17 2.1.3 Trang thiết bị, dụng cụ 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2.2 Xây dựng thẩm định phương pháp 19 2.2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích 19 2.2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .19 2.2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích .20 2.2.3 Áp dụng phương pháp phân tích số mẫu thực tế 20 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp 20 2.3.1.1 Phương pháp khảo sát điều kiện phân tích 20 2.3.1.2 Phương pháp khảo sát điều kiện xử lý mẫu 20 2.3.1.3 Phương pháp xác nhận giá trị sử dụng phương pháp phân tích .21 2.3.2 Áp dụng phân tích số mẫu thực tế 22 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 22 Chương Thực nghiệm, kết bàn luận 23 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích .23 3.1.1 Lựa chọn cột phân tích 23 3.1.2 Lựa chọn pha động .23 3.1.3 Lựa chọn bước sóng phát 24 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 25 3.2.1 Khảo sát nồng độ dung dịch kiềm 25 3.2.2 Khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa 26 3.2.3 Khảo sát thời gian xà phòng hóa 26 3.2.4 Khảo sát khối lượng cân mẫu .27 3.2.5 Khảo sát số lần chiết mẫu: 28 3.2.6 Quy trình xử lý mẫu tối ưu hóa 30 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích .30 3.3.1 Độ đặc hiệu, chọn lọc 30 3.3.2 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn 31 3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 33 3.3.4 Độ lặp lại độ tái lập nội .35 3.3.5 Độ thu hồi .36 3.4 Áp dụng phương pháp phân tích số mẫu thực tế 39 Kết luận kiến nghị 41 Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt AMD Thối hóa điểm vàng lão hóa ACN Acetolnitril AOAC Hiệp hội nhà hố phân tích thống BHT Butyl hydroxy toluen DCM Dichloro methan HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao JECFA Ủy ban chuyên gia Phụ gia thực phẩm LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MeOH Methanol MPOD Mật độ quang sắc tố MS Khối phổ MtBE Methyl tert-butyl ether PDA Detector mảng diod RSD Độ lệch chuẩn tương đối SD Độ lệch chuẩn TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe TEA Triethylamin UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu Danh mục bảng Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý, hóa học lutein zeaxanthin .4 Bảng 1.2 Các phương pháp xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin sử dụng kĩ thuật khác kĩ thuật HPLC detector PAD Bảng 1.3 Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector PDA xác định hàm lượng lutein và/hoặc zeaxanthin 12 Bảng 2.1 Cách chuẩn bị dung dịch chuẩn làm việc từ dung dịch chuẩn gốc 17 Bảng 3.1 Pha động nghiên cứu sử dụng cột phân tách C18 23 Bảng 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn lutein 31 Bảng 3.3 Kết xây dựng đường chuẩn Zeaxanthin 32 Bảng 3.4 Kết LOD LOQ – mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang mềm 33 Bảng 3.5 Kết LOD LOQ – mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe nang cứng 34 Bảng 3.6 Kết độ lặp lại - mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm 35 Bảng 3.7 Kết độ lặp lại - mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng 35 Bảng 3.8 Kết độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang mềm .37 Bảng 3.9 Kết độ thu hồi – thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng nang cứng .38 Bảng 3.10 Kết áp dụng phương pháp phân tích số mẫu thực tế 39 Danh mục hình vẽ, biểu đồ đồ thị Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo dạng all-trans lutein zeaxanthin Hình 3.1 Sắc ký đồ với pha động hexan:ethyl acetat = 65:35 (v/v) 23 Hình 3.2 Sắc ký đồ với pha động MeOH/dichloromethan/ACN/nước 67,5:22,5:9,5:0,5 .24 Hình 3.3 Sắc ký đồ với pha động ethyl acetat/ACN (12:88) + 0,1% (v/v) n-decanol 24 Hình 3.4 Phổ Lutein Zeaxanthin – dung dịch chuẩn hỗn hợp 25 Hình 3.5 Kết độ đặc hiệu, chọn lọc 31 Biểu đồ 3.1 Kết khảo sát ảnh hưởng nồng độ KOH tới hàm lượng lutein zeaxanthin mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 25 Biểu đồ 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ xà phòng hóa tới hàm lượng lutein zeaxanthin mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 26 Biểu đồ 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian xà phòng hóa với hàm lượng lutein zeaxanthin mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 27 Biểu đồ 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng khối lượng cân mẫu đến hàm lượng lutein zeaxanthin mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 28 Biểu đồ 3.5 Kết khảo sát ảnh hưởng số lần chiết đến hiệu suất chiết mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe 29 Đồ thị 3.1 Đường chuẩn lutein 32 Đồ thị 3.2 Đường chuẩn zeaxanthin 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Sử dụng TPBVSK ngày trở thành thói quen nhiều người dân giới nói chung Việt Nam nói riêng, nhằm mục đích cung cấp dưỡng chất lành mạnh cho thể Trong số đó, dưỡng chất có nguồn gốc từ thực vật (phytonutrient) nhắc đến ngày nhiều, dưỡng chất thiết yếu cho thể vitamin hay chất khống, chúng lại có vai trò bảo vệ thể chống lại bệnh tật Khi ô nhiễm môi trường gia tăng tình hình dịch tễ bệnh diễn biến phức tạp, việc tiêu thụ dưỡng chất thực vật khuyến cáo mạnh mẽ nhằm mục đích bảo vệ sức khỏe Carotenoid nhóm dưỡng chất thực vật có tác dụng bảo vệ mắt, bao gồm phân nhóm xanthophyll với hai đại diện tiêu biểu lutein zeaxanthin chứng minh có tác dụng chống lại làm chậm tiến triển thối hóa điểm vàng lão hóa Lutein zeaxanthin hai thành phần cấu tạo nên điểm vàng mắt, thường kèm với tự nhiên Cấu tạo hoàn chỉnh giúp mắt nhìn rõ vật Khi mắt khơng phải điều tiết nhiều, tránh nhức mỏi mắt, giảm nguy mắc bệnh Chúng gọi carotenoid võng mạc Mức lutein khuyến cáo cần tiêu thụ 6mg ngày để đạt tác dụng có hiệu Tuy nhiên thực tế nạp lượng so với mức khuyến cáo, cần bổ sung thêm Do đó, TPBVSK chứa lutein zeaxanthin đời sử dụng ngày phổ biến Từ đó, nảy sinh yêu cầu cần thiết phải quản lý chất lượng TPBVSK trên, đồng thời Việt Nam chưa có phương pháp thống xác định đồng thời hàm lượng lutein zeaxanthin TPBVSK, tiến hành đề tài: “Xác định hàm lượng lutein zeaxanthin thực phẩm bảo vệ sức khỏe sắc ký lỏng hiệu cao” Với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng lutein zeaxanthin hai mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào chế viên nang mềm viên nang cứng Áp dụng phương pháp để xác định hàm lượng lutein zeaxanthin số TPBVSK thị trường 40 Regal, Patricia & Amorim-Carrilho, K.T & Cepeda, Alberto & Fente, Cristina (2014), “Review of methods for analysis of carotenoids”, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 56 41 Ribaya‐Mercado, Judy & Blumberg, Jeffrey (2005), “Lutein and Zeaxanthin and Their Potential Roles in Disease Prevention”, Journal of the American College of Nutrition, 23 567S-587S 42 Rivera, S., Vilaro, F., and Canela, R (2011), “Determination of carotenoids by liquid chromatography/mass spectrometry: Effect of several dopants”, Anal Bioanal Chem., 400 1339-1346 43 SanGiovanni, J.P.; Chew, E.Y.; Clemons, T.E.; Ferris, F.L., 3rd; Gensler, G.; Lindblad, A.S.; Milton, R.C.; Seddon, J.M.; Sperduto, R.D (2007), “The relationship of dietary carotenoid and vitamin A, E, and C intake with age-related macular degeneration in a case-control study: Areds report No 22”, Arch Ophthalmol., 125 1225–1232 44 Seddon, J.M.; Ajani, U.A.; Sperduto, R.D.; Hiller, R.; Blair, N.; Burton, T.C.; Farber, M.D.; Gragoudas, E.S.; Haller, J.; Miller, D.T.; et al (1994), “Dietary carotenoids, vitamins A, C, and E, and advanced age-related macular degeneration: Eye disease case-control study group”, JAMA, 272 1413–1420 45 Shi, X.-M & Chen, F (1997), “Stability of lutein under various storage conditions”, Nahrung-food – NAHRUNG, 41 38-41 46 Shi, J., Yi, C., Ye, X Q., Xue, S., Jiang, Y M., Ma, Y., and Liu, D H (2010), “Effects of supercritical CO2 fluid parameters on chemical composition and yield of carotenoids extracted from pumpkin”, LWT-Food Sci.Technol., 43 39-44 47 Sujak, A., Gabrielska, J., Grudzinski, W., Borc, R., Mazurek, P., & Gruszecki, W I (1999), “Lutein and zeaxanthin as protectors of lipid membranes against oxidative damage: the structural aspects”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 371 301–307 48 Tlili, N., Nasri, N., Saadaoui, E., Khaldi, A., and Triki, S (2009), “Carotenoid and tocopherol composition of leaves, buds, and flowers of Capparis spinosa grown wild in Tunisia”, J Agr Food Chem., 57 5381-5385 49 Tsai, Y C., Wu, W B., and Chen, B H (2010), “Preparation of carotenoids and chlorophylls from Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino and their antiproliferation effect on hepatoma cell”, J Med Food, 13 1431-1442 50 Wang, M.-X., Jiao, J.-H., Li, Z.-Y., Liu, R.-R., Shi, Q., & Ma, L (2013), “Lutein supplementation reduces lipid peroxidation and C-reactive protein in healthy nonsmokers”, Atherosclerosis, 227 380–385 51 Wang, J.J.; Buitendijk, G.H.; Rochtchina, E.; Lee, K.E.; Klein, B.E.; van Duijn, C.M.; Flood, V.M.; Meuer, S.M.; Attia, J.; Myers, C.; et al (2014), “Genetic susceptibility, dietary antioxidants, and long-term incidence of age-related macular degeneration in two populations”, Ophthalmology, 121 667–675 52 Wenzel J.Adam, Gerweck Catherine, Barbato Damian, Nicolosi Robert, Handelman Garry, Curran-Celentano Joanne (2006), “A 12-Wk Egg Intervention Increases Serum Zeaxanthin and Macular Pigment Optical Density in Women”, The Journal of nutrition, 136 2568-73 53 Xu, X.-R., Zou, Z.-Y., Huang, Y.-M., Xiao, X., Ma, L., & Lin, X.-M (2012), “Serum carotenoids in relation to risk factors for the development of atherosclerosis”, Clinical Biochemistry, 45 1357–1361 54 Yuhas Rebecca, Mccormick Megan, Yachetti Stephen, Burgher Anita, Kong Kadeline, Walsh John (2011), ”A Method for the Measurement of Lutein in Infant Formula”, Food and Nutrition Science, 145-149 55 Zaghdoudi Khalil, Ngomo Orleans, Vanderesse Regis, Arnoux Philippe, Myrzakhmetov Bauyrzhan, Frochot Celine, Guiavarc’h Yann (2017), “Extraction, Identification and Photo-Physical Characterization of Persimmon (Diospyros kaki L.) Carotenoids”, Foods, 56 Zorn, Holger & E Breithaupt, Dietmar & Takenberg, Meike & Schwack, Wolfgang & G Berger, Ralf (2003), “Enzymatic hydrolysis of carotenoid esters of marigold flowers (Tagetes erecta L.) and red paprika (Capsicum annuum L.) by commercial lipases and Pleurotus sapidus extracellular lipase”, Enzyme and Microbial Technology, 32 623-628 PHỤ LỤC KẾT QUẢ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN XỬ LÝ MẪU 1.1 Bảng số liệu kết khảo sát nồng độ dung dịch kiềm Nồng Khối độ lượng KOH cân (g) Thể tích định mức Lutein Hệ số Zeaxanthin pha Diện Hàm Diện Hàm loãng tích pic lượng tích pic lượng Nang mềm 35% 1,1052 878646 0,0593% 81066 0,0672‰ 40% 0,9382 983504 0,0776% 70391 0,0699‰ 45% 0,9420 1100496 0,0859% 92645 0,0888‰ 50% 1,0631 1010382 0,0702% 92279 0,0784‰ 55% 1,0037 844058 0,0629% 75021 0,0691‰ 25mL 10 Nang cứng 35% 0,1269 54960 0,0371% 57726 0,0436% 40% 0,1485 81964 0,0457% 84152 0,0517% 45% 0,1004 57000 0,0485% 68890 0,0641% 50% 0,1176 64804 0,0465% 66710 0,0532% 55% 0,1476 66737 0,0380% 76723 0,0479% 25mL 10 1.2 Khảo sát nhiệt độ xà phòng hóa 1.2.1 Bảng số liệu Nhiệt độ Khối lượng cân (g) Thể tích định mức Lutein Hệ số Zeaxanthin pha Diện Hàm Diện Hàm lỗng tích pic lượng tích pic lượng Nang mềm 40°C 1,0760 707140 0,0696% 10459 0,0297‰ 50°C 1,0942 818727 0,0789% 15788 0,0412‰ 60°C 1,0035 1066024 0,1113% 19580 0,0543‰ 70°C 0,9843 945325 0,1009% 12576 0,0378‰ 80°C 1,0186 862880 0,0892% 12882 0,0373‰ 50875 0,0355% 55940 0,0430% 78209 0,0448% 83031 0,0517% 25mL 10 Nang cứng 40°C 0,1269 50°C 0,1485 25mL 10 60°C 0,1004 57791 0,0503% 69414 0,0654% 70°C 0,1176 64361 0,0473% 61429 0,0502% 80°C 0,1476 64590 0,0378% 75923 0,0481% 1.2.2 Sắc ký đồ Nhiệt độ Nang mềm Nang cứng 0.004 AU 9.362 - 707140 0.04 40°C 0.02 0.00 6.00 8.00 AU 10.110 - 10459 0.06 0.002 9.856 - 23677 9.127 - 21204 0.08 0.000 10.00 6.00 12.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Minutes 0.004 0.02 0.00 6.00 8.00 AU 9.352 - 818727 AU 0.04 50°C 10.100 - 15788 0.06 0.002 9.940 - 23274 9.220 - 24424 0.08 0.000 10.00 6.00 12.00 8.00 10.00 12.00 Minutes Minutes 0.08 0.02 AU 0.000 0.00 6.00 0.002 8.00 10.00 6.00 12.00 8.00 10.063 - 51746 60°C 10.079 - 19580 9.330 - 1066024 AU 0.04 9.314 - 42325 0.004 0.06 10.00 12.00 Minutes Minutes 0.08 0.004 0.000 0.00 6.00 8.00 10.00 Minutes 12.00 6.00 8.00 9.894 - 34923 0.02 0.002 9.179 - 33190 70°C AU AU 0.04 9.896 - 12576 9.157 - 945325 0.06 10.00 Minutes 12.00 0.06 6.00 0.000 8.00 10.00 6.00 12.00 8.00 9.905 - 33908 0.00 0.002 9.168 - 33289 0.02 AU AU 80°C 10.041 - 12882 9.300 - 862880 0.004 0.04 10.00 12.00 Minutes Minutes 1.3 Bảng số liệu kết khảo sát thời gian xà phòng hóa Thời Khối gian lượng (phút) cân (g) Thể tích định mức Lutein Hệ số Zeaxanthin pha Diện Hàm Diện Hàm lỗng tích pic lượng tích pic lượng Nang mềm 1,0052 1005873 0,0740% 10459 0,0534‰ 10 1,0422 1413294 0,0985% 15788 0,0686‰ 15 1,0120 3356687 0,2348% 19580 0,1832‰ 20 1,0107 2952554 0,2073% 12576 0,1733‰ 25 1,0225 1777114 0,1251% 12882 0,0952‰ 25mL 10 Nang cứng 0,1390 73104 0,0439% 73091 0,0487% 10 0,1330 84513 0,0524% 96485 0,0652% 15 0,1149 118765 0,0835% 235033 0,1736% 20 0,1107 109446 0,0803% 192728 0,1491% 25 0,1062 72753 0,0572% 99399 0,0839% 25mL 10 1.4 Bảng số liệu kết khảo sát khối lượng cân Khối Stt lượng cân (g) Thể tích định mức Lutein Hệ số Zeaxanthin pha Diện Hàm Diện Hàm lỗng tích pic lượng tích pic lượng Nang mềm 0,1099 20 mL 589683 0,1654% 33156 0,0118% 0,5098 25 mL 25 420043 0,1651% 29627 0,0173% 1,0020 25 mL 20 1100496 0,1615% 92645 0,0167% 1,5019 25 mL 20 1390246 0,1345% 68750 0,0086% 2,0187 25 mL 20 1593703 0,1141% 76769 0,0070% Nang cứng 0,1008 20 mL 20 57000 0,0772% 68890 0,1021% 0,2005 25 mL 25 78974 0,0817% 88777 0,1004% 0,5005 25 mL 25 124567 0,0502% 84067 0,0383% 1,0247 25 mL 25 197843 0,0382% 110975 0,0240% 1,5013 25 mL 25 231600 0,0304% 105245 0,0156% 1.5 Bảng số liệu kết khảo sát số lần chiết Stt Khối mẫu lượng cân Số lần chiết Thể tích định mức Hệ số Lutein pha Diện tích Hàm lượng lỗng pic (%) Zeaxanthin Tỷ lệ % Diện tích Hàm lượng pic (%) Tỷ lệ % Nang mềm 1,0079 0,9906 1,0746 25 20 1141827 0,1663 78,02 46337 0,0091 67,88 25 10 465078 0,2028 95,15 30177 0,0124 92,13 10 10 266806 0,2119 99,44 18264 0,0133 98,97 10 226232 0,2127 99,82 15701 0,0134 99,59 10 76882 0,2131 100,00 6720 0,0134 100,00 25 20 1126758 0,1671 79,59 47698 0,0095 70,38 25 10 417678 0,2009 95,71 26627 0,0125 92,78 10 10 216055 0,2087 99,46 15357 0,0134 99,00 10 217317 0,2095 99,83 16180 0,0135 99,64 10 59189 0,2099 100,00 4686 0,0135 100,00 25 20 1197240 0,1631 78,94 54260 0,0098 70,40 25 10 494023 0,1992 96,41 33555 0,0131 94,30 10 10 181232 0,2056 99,49 11861 0,0137 99,12 10 215167 0,2063 99,84 14821 0,0140 99,67 10 63968 0,2066 100,00 4854 0,0140 100,00 Stt Khối mẫu lượng cân Số lần chiết Thể tích định mức Hệ số Lutein pha Diện tích Hàm lượng loãng pic (%) Zeaxanthin Tỷ lệ % Diện tích Hàm lượng pic (%) Tỷ lệ % Nang cứng 0,1035 0,1084 0,1149 50 20 43139 0,0735 81,4 35072 0,0712 69,8 25 20 12181 0,0874 96,7 22832 0,0972 95,3 25 10 2071 0,0899 99,5 2493 0,1012 99,2 10 880 0,0901 99,8 2888 0,1016 99,7 10 818 0,0903 100,0 963 0,1020 100,0 50 20 47859 0,0769 81,5 33998 0,0664 66,7 25 20 14523 0,0917 97,3 27925 0,0950 95,4 25 10 1058 0,0939 99,6 2666 0,0989 99,3 10 1131 0,0941 99,8 1941 0,0992 99,7 10 446 0,0943 100,0 618 0,0996 100,0 50 20 47841 0,0729 83,8 42727 0,0754 75,7 25 20 11606 0,0846 97,3 18910 0,0956 96,1 25 10 976 0,0866 99,6 1248 0,0989 99,3 10 1198 0,0868 99,8 1772 0,0992 99,7 10 390 0,0870 100,0 728 0,0995 100,0 PHỤ LỤC KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH 2.1 Độ đặc hiệu chọn lọc Phổ chuẩn đơn lutein Sắc ký đồ chuẩn đơn lutein 8.683 Peak 0.040 444.9 8.683 - 727827 0.040 471.6 0.030 216.6 0.030 0.020 AU AU 230.8 0.010 0.020 331.8 265.1 0.010 609.7 650.2677.2 0.000 0.000 -0.010 -0.020 0.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 5.00 800.00 10.00 15.00 Minutes nm Phổ chuẩn đơn zeaxanthin Sắc ký đồ chuẩn đơn zeaxanthin 8.790 Peak 0.10 453.4 0.10 8.789 - 1675629 0.08 AU AU 0.06 0.04 0.05 220.1 0.02 278.2 343.8 608.4 648.9 0.00 300.00 400.00 500.00 600.00 710.4 743.6 700.00 798.9 0.00 800.00 0.00 5.00 nm 10.00 15.00 Minutes Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp Phổ chuẩn hỗn hợp lutein/zeaxanthin lutein/zeaxanthin 8.740 Peak 221.3 0.030 446.1 474.1 0.020 0.010 336.6 554.6 0.000 607.2 641.6 705.4 741.1 0.030 8.739 - 311671 9.082 - 291263 AU 268.6 -0.010 0.020 AU -0.020 9.081 Peak 0.030 217.8 0.010 452.2 480.2 0.020 0.010 0.000 240.2 AU 278.2 0.00 346.2 -0.010 -0.020 -0.030 300.00 400.00 500.00 nm 600.00 700.00 5.00 10.00 Minutes 662.4 704.2720.2743.6 554.6 0.000 800.00 15.00 Sắc ký đồ mẫu thực tế Phổ mẫu thực tế 8.501 Peak 222.5 0.020 446.1 472.9 AU 268.6 337.8 725.1 558.2 608.4647.7666.1 0.000 794.0 8.501 - 109446 8.839 - 192728 0.010 0.015 -0.010 0.010 AU -0.020 8.838 Peak 0.025 211.9 0.005 0.020 452.2 478.9 0.015 0.000 AU 0.010 0.00 0.005 5.00 278.2 10.00 15.00 Minutes 625.6645.2662.4 0.000 721.4744.8 -0.005 -0.010 -0.015 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 nm Sắc ký đồ mẫu thực tế thêm chuẩn Phổ mẫu thực tế thêm chuẩn hỗn hợp hỗn hợp 8.501 Peak 222.5 0.020 446.1 472.9 AU 268.6 337.8 725.1 558.2 608.4647.7666.1 0.000 794.0 8.501 - 109446 8.839 - 192728 0.010 0.015 -0.010 0.010 AU -0.020 8.838 Peak 0.025 211.9 0.005 0.020 452.2 478.9 0.015 0.000 AU 0.010 0.005 0.00 278.2 625.6645.2662.4 0.000 -0.005 -0.010 -0.015 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 nm 2.2 Khoảng tuyến tính, đường chuẩn Sắc ký đồ overlay 5.00 10.00 Minutes 721.4744.8 800.00 15.00 0.30 0.25 0.20 AU 0.15 0.10 0.05 0.00 -0.05 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 Minutes 2.3 Độ lặp lại 2.3.1 Nang mềm AU 0.04 0.02 9.829 - 9126 9.110 - 813672 0.06 0.00 8.00 10.00 12.00 Minutes 2.3.2 Nang cứng 0.001 9.780 - 25355 9.068 - 26205 AU 0.002 0.000 6.00 8.00 Minutes 10.00 12.00 12.00 PHỤ LỤC ÁP DỤNG PHÂN TÍCH MẪU THỰC TẾ 3.1 Mẫu nang mềm 8.456 - 1478466 8.683 - 87795 0.15 AU 0.10 0.05 0.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 Minutes 3.2 Mẫu nang cứng 0.010 AU 0.006 0.004 0.002 8.970 - 93518 8.653 - 99694 0.008 0.000 -0.002 6.00 8.00 Minutes 10.00 PHỤ LỤC CERTIFICATE OF ANALYSIS CỦA HAI CHẤT CHUẨN 3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103 USA Email USA: techserv@sial.com Outside USA: eurtechserv@sial.com Certificate of Analysis Product Name: Product Number: Batch Number: Brand: CAS Number: Formula: Formula Weight: Storage Temperature: Quality Release Date: Recommended Retest Date: ZEAXANTHIN analytical standard 14681 BCBW1637 Sigma-Aldrich 144-68-3 C40H56O2 568.87 -20 C 30 NOV 2017 APR 2021 TEST SPECIFICATION RESULT APPEARANCE (COLOR) RED TO DARK RED DARK RED APPEARANCE (FORM) POWDER POWDER PURITY (HPLC AREA %) ≥ 95.0 % 98.7 % PROTON NMR SPECTRUM CONFORMS TO STRUCTURE CONFORMS Dr Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication The current specification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com For further inquiries, please contact Technical Service Purchaser must determine the suitability of the product for its particular use See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale Sigma-Aldrich Certificate of Analysis - Product 14681 Lot BCBW1637 Page of 3050 Spruce Street, Saint Louis, MO 63103 USA Email USA: techserv@sial.com Outside USA: eurtechserv@sial.com Certificate of Analysis Product Name: Product Number: Batch Number: Brand: CAS Number: Formula: Formula Weight: Storage Temperature: Expiration Date: Quality Release Date: LUTEIN analytical standard 07168 BCBT2895 Sigma-Aldrich 127-40-2 C40H56O2 568.87 -20 C OCT 2019 21 NOV 2016 TEST SPECIFICATION RESULT APPEARANCE (COLOR) YELLOW TO VERY DARK YELLOW AND VERY DARK RED ORANGE TO VERY DARK ORANGE AND RED TO VERY DARK RED APPEARANCE (FORM) POWDER POWDER PURITY (HPLC AREA %) ≥ 97.0 % 97.6 % PROTON NMR SPECTRUM CONFORMS TO STRUCTURE CONFORMS Dr Claudia Geitner Manager Quality Control Buchs, Switzerland Sigma-Aldrich warrants that at the time of the quality release or subsequent retest date this product conformed to the information contained in this publication The current specification sheet may be available at Sigma-Aldrich.com For further inquiries, please contact Technical Service Purchaser must determine the suitability of the product for its particular use See reverse side of invoice or packing slip for additional terms and conditions of sale Sigma-Aldrich Certificate of Analysis - Product 07168 Lot BCBT2895 Page of ... thực phẩm chức năng; chương I, điều 2: Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (Health Supplement, Food Supplement, Dietary Supplement) sản phẩm chế biến dạng viên nang, viên hoàn, viên nén, cao, cốm, bột,... auroxanthin ester, violaxanthin ester Helen Carotenoid (lutein, Gạo (Oryza Quang phổ - Khả phân tích Belefant- zeaxanthin β- sativa L.) huỳnh quang tương đương HPLC, đặc Miller & carotene) Cần số lượng... 186007749) kèm - Cân phân tích (có độ xác 0,0001 g) XS105, Metter Toledo - Máy lắc vortex - Máy lắc ngang IKA – KS501 - Máy ly tâm Hermle - Máy cô quay Buchi Rotavapor R-300 - Bể điều nhiệt, Buchi