Nghiên cứu xác định hàm lượng một số độc tố pyrolizidin alkaloids trong thảo dược bằng sắc ký lỏng khối phổ

67 26 0
  • Loading ...
1/67 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 26/07/2019, 22:16

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘC TỐ PYROLIZIDIN ALKALOIDS TRONG THẢO DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO Mã sinh viên: 1401558 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘC TỐ PYRROLIZIDIN ALKALOIDS TRONG THẢO DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Bùi Cao Tiến TS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm an tồn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Bộ mơn Hóa phân tích Độc chất HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người giúp đỡ q trình thực khóa luận Xin chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Ngọc Lan, giảng viên mơn Hố phân tích Độc chất, ĐH Dược Hà Nội Cô người theo sát, hướng dẫn, động viên tơi ngày đầu làm khóa luận, truyền cho tinh thần làm việc sôi nổi, sáng tạo, miệt mài Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy trường ĐH Dược Hà Nội nói chung mơn Hố phân tích Độc chất nói riêng trang bị cho kiến thức quý giá để chuẩn bị sẵn sàng cho việc làm khóa luận Xin chân thành cảm ơn TS Trần Cao Sơn, trưởng khoa Độc học Dị nguyên, Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia Anh nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn, tận tình trao đổi nhiều vấn đề có liên quan Đặc biệt, tơi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Bùi Cao Tiến, kiểm nghiệm viên Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, người trực tiếp hướng dẫn, thảo luận, giải vấn đề, cho lời khuyên tháo gỡ khó khăn q trình thực khóa luận viện Xin gửi lời cảm ơn đến anh chị kĩ thuật viên viện, tạo cho mơi trường thân thiện, vui vẻ để hồn thành tốt cơng việc Cuối cùng, xin tri ân gia đình bạn bè, ln đồng hành bên tơi lúc khó khăn, ln tạo điều kiện nguồn động lực để làm việc phấn đấu vươn lên Tôi xin chân thành cảm ơn tới tất người! Hà Nội, tháng năm 2019 Đặng Thị Phương Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan pyrrolizidin alkaloids .2 1.1.1 Khái quát pyrrolizidin alkaloids 1.1.2 Nguồn thực vật chứa độc tố pyrrolizidin alkaloids .4 1.1.3 Độc tính PAs 1.1.4 Quy định hành PAs 1.2 Phƣơng pháp xác định độc tố PAs 1.2.1 Phương pháp chiết .8 1.2.2 Phương pháp làm .10 1.2.3 Phương pháp phân tích 11 CHƢƠNG II ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị .13 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 13 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 14 2.2.3 Chất chuẩn 14 2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 14 2.3 Nội dung nghiên cứu 15 2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích .15 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 15 2.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 15 2.3.4 Đánh giá hàm lượng độc tố PAs thảo dược có thị trường 15 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .15 2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu .15 2.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 16 2.4.3 Phương pháp thẩm định .16 2.4.4 Phương pháp lấy mẫu 17 2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 17 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời số PAs thảo dƣợc 18 3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 18 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 22 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng 29 3.2 Thẩm định phƣơng pháp .29 3.2.1 Độ đặc hiệu 30 3.2.2 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .31 3.2.3 Khoảng tuyến tính đường chuẩn chất phân tích 33 3.2.4 Độ lặp lại độ thu hồi 35 3.3 Ứng dụng phƣơng pháp để phân tích số thảo dƣợc thị trƣờng 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Commodities tích thức Atmospheric pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất khí ionization Collisionally Activated Dissociation Gas Áp suất bắn phá Collision energy Năng lượng va chạm CUR Curtain Gas Áp suất khí màng DAD Diod Array Detector Detector mảng diod d-SPE Dispersive solid phase extraction Chiết phân tán pha rắn AOAC APCI CAD CE ELISA Enzyme-linked Immune-sorbent Assay Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ESI Electrospray Ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluorescence detector Detector huỳnh quang GC Gas chromatography Sắc ký khí GS1 Ion Source Gas Áp suất khí nguồn GS2 Ion Source Gas Áp suất khí nguồn HLB Hydrophylic lipophilic balance Cân thân nước, thân dầu ISV Ion Spray Voltage Thế ion hóa KPH LC-MS/MS LOD - Không phát Liquid chromatography tandem mass Sắc ký lỏng khối phổ hai lần spectrometry Limit of Detection Giới hạn phát Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt Limit of Qualification Giới hạn định lượng MS Mass spectrometry Khối phổ NPD Nito phospho detector Detector nitơ photpho Recovery Hiệu suất thu hồi RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SCX Strong cation exchange Cột trao đổi cation mạnh SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn LOQ R TCVN TEM Temparature Tiêu chuẩn Việt Nam Nhiệt độ nguồn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các loài thực vật chứa PAs gây độc ngƣời động vật Bảng 1.2 Một số phƣơng pháp chiết sử dụng acid loãng Bảng 1.3 Tổng quan số nghiên cứu có sử dụng cột SPE SCX 10 Bảng 1.4 Một số nghiên cứu xác định PAs LC-MS/MS .12 Bảng 2.1 Các độc tố PAs đƣợc sử dụng nghiên cứu 13 Bảng 2.2 Dung dịch chuẩn trung gian 14 Bảng 2.3 Dung dịch chuẩn làm việc PAs 15 Bảng 3.1 Các điều kiện MS/MS phân tích PAs 18 Bảng 3.2 Các thơng số MS để phân tích PAs 19 Bảng 3.3 Chƣơng trình gradient pha động .21 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng mẫu 29 Bảng 3.5 Tỷ lệ ion PAs 30 Bảng 3.6 Độ lặp lại độ thu hồi echimidin .35 Bảng 3.7 Độ lặp lại độ thu hồi intermidin 35 Bảng 3.8 Độ lặp lại độ thu hồi jacobin 36 Bảng 3.9 Độ lặp lại độ thu hồi senecionin 36 Bảng 3.10 Kết phân tích mẫu thực tế 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc PAs dạng khác Hình 1.2 Các nhóm PAs phân loại theo base necin Hình 1.3 Cấu trúc số acid necic điển hình Hình 1.4 Một số PAs phổ biến .4 Hình 2.1 Sắc đồ Ichimidin Jacobin sử dụng cột C18 cột TSK Gel 20 Hình 2.2 Sắc đồ tổng PAs 21 Hình 2.3 Sắc đồ MRM PAs 22 Hình 2.4 Biểu đồ kết khảo sát dung mơi chiết 24 Hình 2.5 Biểu đồ kết khảo sát nhiệt độ .25 Hình 2.6 Biểu đồ kết khảo sát nồng độ acid .26 Hình 2.7 Biểu đồ kết khảo sát cột SPE 27 Hình 2.8 Sắc đồ khảo sát dung mơi rửa giải với intermidin 28 Hình 2.9 Quy trình xử lí mẫu 28 Hình 2.10 Đƣờng chuẩn dung môi mẫu thực .29 Hình 2.11 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn mẫu trắng thêm chuẩn PAs 31 Hình 2.12 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức nồng độ 0,3 µg/kg 32 Hình 2.13 Đƣờng chuẩn phân tích Echimidin 33 Hình 2.14 Đƣờng chuẩn phân tích Intermedin 33 Hình 2.15 Đƣờng chuẩn phân tích Jacobin 34 Hình 2.16 Đƣờng chuẩn phân tích Senecionin .34 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, xu hướng việc sử dụng loại thảo dược tự nhiên, chủ yếu xuất phát từ thuốc y học cổ truyền ngày phổ biến Tuy nhiên đa số loại thảo dược có thành phần phức tạp, số có dược tính mạnh, khó kiểm sốt độc tính tiềm ẩn Nhiều loại thảo dược có chứa độc tố tự nhiên gây hại đến sức khỏe người sử dụng Một số độc tố tự nhiên ngày thu hút quan tâm nhà khoa học giới alkaloid nhân pyrrolizidin (Pyrrolizidin alkaloids PAs) PAs nhóm hợp chất có độc tính, sinh số lồi thực vật xếp vào nhóm độc tố thực vật (phytotoxin) Khi sử dụng lồi thực vật có chứa độc tố PAs trà thảo dược, sản phẩm ngũ cốc bị nhiễm độc tố, người xuất triệu chứng ngộ độc cấp tính mãn tính gan, độc tính gen nhiễm sắc thể, đơi có liên quan đến hình thành số khối u phát triển da, bàng quang, não, tủy sống, tụy đường tiêu hóa Ngày nay, 6.000 loài thực vật (chiếm khoảng 3% thực vật tồn giới) biết có khả sinh tổng hợp PAs, chủ yếu thuộc họ Mồ hôi (Boraginaceae), họ Cúc (Asteraceae) họ Đậu (Fabaceae) Trong đó, khoảng 600 loại PAs xác định mô tả có khả gây nhiễm độc Giới hạn tối đa cho phép PAs thực phẩm thiết lập số nước giới Tuy nhiên Việt Nam ban hành TCVN 12053:2017 quy phạm thực hành kiểm soát cỏ dại để ngăn ngừa giảm thiểu nhiễm pyrrolizidin alkaloid thực phẩm thức ăn chăn nuôi [1] Hiện nay, chưa có phương pháp thức để kiểm nghiệm độc tố PAs thực phẩm nói chung thảo dược nói riêng Do đó, đề tài “Nghiên cứu xác định hàm lượng số độc tố pyrrolizidin alkaloids thảo dược sắc ký lỏng khổi phổ” thực với hai mục tiêu sau: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng số độc tố PAs thảo dược kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs số loại thảo dược, trà thảo dược thị trường STT Mã số mẫu Echimidine µg/kg Senecionine µg/kg Jacobine µg/kg Intermidine µg/kg 29 Trà - 29 KPH 2,7 10 14 30 Trà - 30 KPH KPH KPH KPH 31 Thảo dược - 01 KPH 5,0 13,8 KPH 32 Thảo dược - 02 KPH 4,0 KPH 2,8 33 Thảo dược - 03 KPH 307 14,9 KPH PL-2 Phụ lục Kết khảo sát phƣơng pháp sắc ký đồ Phụ lục 2-1 Kết khảo sát dung môi chiết Echimidin Intermidin PL-3 Jacobin Senecionin PL-4 Phụ lục 2-2 Kết khảo sát nhiệt độ Echimidin Intermidine PL-5 Jacobin Senecionin PL-6 Phụ lục 2-3 Kết khảo sát nồng độ acid Echimidin Intermidin PL-7 Jacobin Senecionin PL-8 Phụ lục 2-4 Kết khảo sát cột SPE Echimidin Intermidin PL-9 Jacobin Senecionin PL-10 Phụ lục Kết xác định độ lặp lại PAs sắc ký đồ Echimidin PL-11 Intermidin PL-12 Jacobin PL-13 Senecionin PL-14 Phụ lục Sắc ký đồ phân tích mẫu thực Echimidin Intermidin PL-15 Jacobin Senecionin PL-16 ... dựng thẩm định phương pháp xác định hàm lượng số độc tố PAs thảo dược kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ Ứng dụng phương pháp để sơ đánh giá mức nhiễm độc tố PAs số loại thảo dược, trà thảo dược thị... thức để kiểm nghiệm độc tố PAs thực phẩm nói chung thảo dược nói riêng Do đó, đề tài Nghiên cứu xác định hàm lượng số độc tố pyrrolizidin alkaloids thảo dược sắc ký lỏng khổi phổ thực với hai... HÀ NỘI ĐẶNG THỊ PHƢƠNG THẢO Mã sinh viên: 1401558 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG MỘT SỐ ĐỘC TỐ PYRROLIZIDIN ALKALOIDS TRONG THẢO DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỔI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu xác định hàm lượng một số độc tố pyrolizidin alkaloids trong thảo dược bằng sắc ký lỏng khối phổ, Nghiên cứu xác định hàm lượng một số độc tố pyrolizidin alkaloids trong thảo dược bằng sắc ký lỏng khối phổ

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn