BỘ Y TẾ BỆNH VIỆN K ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NGHIÊN CỨU SỰ MẤT ỔN ĐỊNH VI VỆ TINH TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH Chủ nhiệm đề tài : TS.BS Nguyễn Văn Chủ Nhóm nghiên cứu : Mai Thị Nhung HÀ NỘI, NĂM 2018 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AJCC cs GPB HE HMMD hpf LS MBH MLH1 MMR MSH2 MSH6 MSI PMS2 TILs TNM UTBM WHO XN : American Joint Committee on Cancer : Cộng : Giải phẫu bệnh : Hematoxylin-Eosin : Hóa mơ miễn dịch : High power field (Vi trường có độ phóng đại lớn) : Lâm sàng : Mô bệnh học : mutL homolog : Mismatch Repair : mutS homolog : mutS homolog : MicroSattelite Instable : postmeiotic segregation increased : Tumor infiltrating lymphocytes (lympho xâm nhập u) : Tumor, Node, Metastasis : Ung thư biểu mô : World Health Organization (Tổ chức y tế giới) : Xâm nhập MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thư đại trực tràng chia thành dạng 1.1.1 Ung thư ĐTT không polyp di truyền - Hội chứng Lynch 1.1.2 Ung thư ĐTT MSI đơn lẻ .5 1.2 Cơ sở phân tử ung thư ĐTT MSI 1.2.1 Tính ổn định vi vệ tinh 1.2.2 Cơ chế MMR 1.2.3 Đột biến gen MMR nguy ung thư 1.3 MSI chế phát triển u .6 1.3.1 MLH1, PMS2, PMS1 MSH6 .7 1.3.2 MSI-H MSI-L 1.4 Chẩn đoán MSI .9 1.4.1 Bộc lộ protein MMR: Hố mơ miễn dịch 1.4.2 Hạn chế HMMD chẩn đoán MSI 12 1.4.3 Ngun lý hố mơ miễn dịch .14 1.5 Vai trò dự báo đáp ứng với hóa trị MSI 16 1.6 Vai trò dự báo tiên lượng MSI 17 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu .18 2.2 Đối tượng nghiên cứu 18 2.3 Thiết kế nghiên cứu .18 2.4 Cỡ mẫu chọn mẫu: 18 2.5 Biến số số nghiên cứu 19 2.6 Công cụ kỹ thuật thu thập thông tin .20 2.6.1 Công cụ thu thập thông tin 20 2.6.2 Kỹ thuật thu thập thông tin 20 2.7 Xử lý phân tích số liệu 23 2.8 Khống chế sai số 23 2.9 Đạo đức nghiên cứu 23 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1 Tình trạng MSI thể lâm sàng 24 3.1.1 Tình trạng MSI .24 3.1.2 Thể lâm sàng ung thư ĐTT 25 3.2 Mối liên quan MSI, thể lâm sàng với số đặc điểm GPB-LS 26 3.2.1 Mối liên quan với nhóm tuổi 26 3.2.2 Mối liên quan với vị trí u 27 3.2.3 Mối liên quan với tình trạng hạch 28 3.2.4 Mối liên quan với giai đoạn TNM sau mổ 29 3.2.5 Mối liên quan với typ MBH 30 3.2.6 Mối liên quan với độ mô học .31 3.2.7 Mối liên quan với xâm nhập lympho vào mô u .32 3.2.8 Mối liên quan với phản ứng lympho dạng Crohn 33 3.2.9 Mối liên quan với xâm nhập thần kinh 34 3.2.10 Mối liên quan với xâm nhập mạch 34 Chương 4: BÀN LUẬN .36 4.1 Tình trạng MSI thể lâm sàng 36 4.1.1 Tình trạng MSI .36 4.1.2 Thể lâm sàng ung thư ĐTT 38 4.2 Mối liên quan MSI, thể lâm sàng với đặc điểm GPB-LS .40 4.2.1 Mối liên quan với số đặc điểm lâm sàng .40 4.2.2 Mối liên quan với đặc điểm giải phẫu bệnh 41 4.2.3 Mối liên quan với phản ứng thể 44 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Tiêu chuẩn HMMD xác định MSI thể lâm sàng 19 Bảng 3.1 Tỷ lệ bộc lộ dấu ấn .24 Bảng 3.2 Tỷ lệ không bộc lộ cặp dấu ấn 24 Bảng 3.3 Tình trạng MSI 25 Bảng 3.4 Thể lâm sàng ung thư ĐTT 25 Bảng 3.5 Mối liên quan với nhóm tuổi .26 Bảng 3.6 Mối liên quan thể lâm sàng với nhóm tuổi 26 Bảng 3.7 Mối liên quan với vị trí u 27 Bảng 3.8 Mối liên quan thể lâm sàng với vị trí u 27 Bảng 3.9 Mối liên quan với tình trạng hạch 28 Bảng 3.10 Mối liên quan thể lâm sàng với tình trạng hạch 28 Bảng 3.11 Mối liên quan với giai đoạn TNM sau mổ .29 Bảng 3.12 Mối liên quan thể lâm sàng với giai đoạn TNM sau mổ.29 Bảng 3.13 Mối liên quan với typ MBH .30 Bảng 3.14 Mối liên quan thể lâm sàng với typ MBH 30 Bảng 3.15 Mối liên quan với độ mô học 31 Bảng 3.16 Mối liên quan thể lâm sàng với độ mô học 31 Bảng 3.17 Mối liên quan với mô xâm nhập lympho 32 Bảng 3.18 Mối liên quan thể lâm sàng với mô đệm lympho 32 Bảng 3.19 Mối liên quan với phản ứng lympho dạng Crohn 33 Bảng 3.20 Mối liên quan thể lâm sàng với phản ứng lympho dạng Crohn 33 Bảng 3.21 Mối liên quan với xâm nhập thần kinh .34 Bảng 3.22 Mối liên quan thể lâm sàng với xâm nhập thần kinh 34 Bảng 3.23 Mối liên quan với xâm nhập mạch .34 Bảng 3.24 Mối liên quan thể lâm sàng với xâm nhập mạch 35 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Nguyên lý kỹ thuật HMMD .16 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh sinh ung thư đại trực tràng (ĐTT) chưa rõ, thường xác định đường phân tử ổn định gen Một ổn định nhiễm sắc thể, liên quan tới gen ức chế ung thư gen ung thư APC, KRAS p53 Hai ổn định vi vệ tinh (MSI) khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai chiếm khoảng 15% tất ung thư ĐTT Hầu hết ung thư ĐTT MSI (12%) đơn lẻ, góp phần vào methyl hóa mức chất hoạt hóa MLH1 mắc phải, kèm theo kiểu hình methyl hóa đảo CpG Khoảng 3% ung thư ĐTT MSI ung thư ĐTT liên quan tới hội chứng Lynch, ung thư ĐTT không polyp di truyền (HNPCC - Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer), loại ung thư ĐTT di truyền kinh điển Ung thư ĐTT khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai có đặc trưng GPB-LS rõ ràng: bệnh nhân trẻ, vị trí gần, phản ứng đệm lympho dạng Crohn, typ tế bào nhẫn chế nhày, thể tủy Các bệnh nhân có MSI-H có tiên lượng đáp ứng với điều trị khác với bệnh nhân ổn định vi vệ tinh (MSS) Do việc xác định MSI có ý nghĩa quan trọng, không để sàng lọc hội chứng Lynch mà giúp phân biệt ung thư ĐTT khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai với ung thư ĐTT MSS, cung cấp thơng tin có giá trị cho tiên lượng việc thể hóa điều trị Việc chẩn đoán MSI mảnh sinh thiết cung cấp thơng tin quan trọng việc định xử lý phẫu thuật ung thư ĐTT (cắt đoạn với cắt ĐTT gần toàn bộ) MSI gặp nhiều ung thư ung thư nội mạc tử cung, ung thư dày, ung thư buồng trứng, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư đường gan mật, đường niệu, u não ung thư da Trong ung thư gặp phổ biến ung thư ĐTT … Nhiều nghiên cứu giới cho thấy MSI ung thư ĐTT có nhiều ý nghĩa lâm sàng rõ rệt So với u có ổn định hệ thống sửa chữa bắt cặp sai, u có thiếu hụt có tỉ lệ tái phát di giảm, tỉ lệ sống sót cao Với phát triển vượt bậc ngành sinh học phân tử nay, cho phép phát tương đối xác ngày đầy đủ dạng đột biến gen quan trọng dòng tế bào ung thư ung thư phổi, u lympho, ung thư ĐTT,…Có đường thay đổi gen nhận biết rõ ung thư ĐTT: đường ổn định nhiễm sắc thể (CIN), đường ổn định vi vệ tinh (MSI) đường methyl hóa đảo CpG Đa số ung thư ĐTT phát triển theo đường ổn định nhiễm sắc thể (CIN), khoảng 15% từ đường ổn định vi vệ tinh (MSI) Sự ổn định vi vệ tinh phát giải trình tự DNA phòng sinh học phân tử gián tiếp qua việc xác định biểu protein tương ứng với gen sửa chữa bắt cặp sai phương pháp hóa mơ miễn dịch phòng xét nghiệm thơng thường bệnh viện Ở Việt Nam, có nhiều nghiên cứu lâm sàng, nội soi đặc điểm mô bệnh học ung thư ĐTT Bên cạnh có số nghiên cứu đột biến gen theo đường CIN (đột biến K-ras, APC,…) Tuy nhiên nghiên cứu ổn định vi vệ tinh ung thư ĐTT Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu ổn định vi vệ tinh ung thư đại trực tràng phương pháp hóa mơ miễn dịch” với mục tiêu: Xác định tình trạng ổn định vi vệ tinh (MSI) thể lâm sàng ung thư đại trực tràng Nhận xét số mối liên quan tình trạng ổn định vi vệ tinh (MSI), thể lâm sàng với số đặc điểm GPB-LS ung thư ĐTT 39 lặng liên quan đến CIMP gen MLH1 nguyên nhân gây khoảng 80% trường hợp, biểu protein MLH1/PMS2 bị Khoảng 50% trường hợp dMMR đơn lẻ có đột biến BRAF (V600E) cần để phân biệt chúng với hội chứng Lynch Bệnh nhân có ung thư ĐTT MSI-H đơn lẻ có hầu hết đặc điểm lâm sàng hội chứng Lynch, nhiên có đặc điểm dịch tễ khác bao gồm tuổi chẩn đoán cao hơn, ưu nữ tỷ lệ hút thuốc cao Hội chứng Lynch chiếm khoảng 3-4% tổng số ung thư ĐTT chiếm 1/3 tất ung thư ĐTT liên quan đến dMMR / MSI Bệnh nhân có hội chứng Lynch bắt đầu phát triển ung thư ĐTT thời trẻ tỷ lệ ung thư ĐTT tăng theo tuổi Bệnh nhân có hội chứng Lynch có nguy phát triển ung thư ĐTT cao nhất, tiếp đến ung thư nội mạc tử cung Bệnh nhân có nguy mắc ung thư dày, buồng trứng, đường tiết niệu, ruột non tuyến tiền liệt Nguy ước tính tích lũy ung thư ĐTT đến 70 tuổi bệnh nhân hội chứng Lynch khoảng 50% trường hợp đột biến MLH1 MSH2 Các tiêu chuẩn Bethesda sửa đổi vào năm 2004 để hướng dẫn lựa chọn bệnh nhân cho xét nghiệm hội chứng Lynch Những bệnh nhân có nghi ngờ ung thư ĐTT di truyền cần tư vấn di truyền học, từ xác định đột biến dòng họ đánh giá / sàng lọc thành viên gia đình Các gia đình đáp ứng tiêu chí Amsterdam khơng có đột biến gen MMR khối u MSI-H, gọi ung thư ĐTT gia đình, type X Một nghiên cứu 175 bệnh nhân bị hội chứng Lynch (120 người số họ có hội chứng Lynch - loại MLH1), so sánh với 14.000 bệnh nhân ung thư ĐTT dựa vào quần thể, cho thấy thời gian sống cộng dồn năm bệnh nhân bị hội chứng Lynch 65%, so với 44% bệnh nhân ung thư ĐTT đơn lẻ, 65 tuổi Bệnh nhân có hội chứng Lynch mắc bệnh giai 40 đoạn thấp so với bệnh nhân với loại ung thư ĐTT khác, biểu di Gryfe et al báo cáo 17% bệnh nhân ung thư ĐTT có MSI trẻ 50 tuổi; tỷ suất chênh bệnh nhân có khối u liên quan MSI 0,42, so với bệnh nhân nhóm với khối u khơng MSI 4.2 Mối liên quan MSI, thể lâm sàng với đặc điểm GPB-LS Các nghiên cứu cho thấy khối u MSI-H thường đại tràng gần bên phải) Các u typ MBH thể nhày, biệt hóa, có phản ứng lympho dạng Crohn, xâm nhập lympho u (TIL) chẩn đoán trước 50 tuổi Sau điều chỉnh tất đặc điểm, tỷ suất chênh cao gấp lần u có TIL cao xấp xỉ gấp lần u biệt hóa, tỷ suất chênh đặc điểm khác 3-5 Các khối u có đặc điểm dự báo có khả bị u MSI-H cao gấp 20 lần u khơng có đặc điểm dự báo 4.2.1 Mối liên quan với số đặc điểm lâm sàng Gryfe et al báo cáo 17% bệnh nhân ung thư ĐTT có MSI trẻ 50 tuổi; tỷ suất chênh bệnh nhân có khối u liên quan MSI 0,42, so với bệnh nhân nhóm với khối u khơng MSI Bệnh nhân có khối u với MSI có tỷ lệ tử vong thấp hơn, gồm bệnh nhân bị ung thư giai đoạn IV Tỷ lệ u MSI-H giảm từ 24% độ tuổi 40 xuống 12% tuổi 55-59 lúc chẩn đoán 43% chẩn đoán trước 50 tuổi Qua nghiên cứu 71 bệnh nhân (bảng 3.5), chúng tơi nhận thấy ung thư ĐTT có MSS/MSI-L chủ yếu gặp độ tuổi sau 50, u có MSI-H xu hướng gặp lứa tuổi trẻ: 0,05 (p=0,508) Khi đánh giá nhóm tuổi mắc với thể lâm sàng (bảng 3.6), nhận thấy hội chứng Lynch gặp độ tuổi trước 60, đặc biệt nhóm 0,05 (p=0,547) 41 Trong nhiều nghiên cứu cho thấy vị trí gần (đại tràng phải đại tràng ngang), khối u có tiên lượng tốt so với u vị trí xa (đại tràng xuống, đại tràng sigma), điều phù hợp với ung thư ĐTT có MSI-H LS Trong nghiên cứu (bảng 3.7) cho thấy u có MSI-H chủ yếu gặp vị trí gần (61,1%), trái lại u có MSS/MSI-L gặp tỷ lệ cao vị trí xa (83,0%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p0,005 (p=0,585) Giai đoạn TNM sau mổ Bệnh nhân có hội chứng Lynch mắc bệnh giai đoạn thấp so với bệnh nhân với loại ung thư ĐTT khác biểu di Gryfe et al báo cáo 17% bệnh nhân ung thư ĐTT có MSI trẻ 50 tuổi; tỷ suất 42 chênh bệnh nhân có khối u liên quan MSI 0,42, so với bệnh nhân nhóm với khối u khơng MSI Bệnh nhân có khối u với MSI có tỷ lệ tử vong thấp hơn, gồm bệnh nhân bị ung thư giai đoạn IV Kết HMMD MSH2 MLH1 bất thường dự đoán độc lập kết tốt bệnh nhân với khối u ĐTT giai đoạn II-T3 Do đó, phát MSI bệnh nhân với ung thư ĐTT yếu tố tiên lượng tốt, đặc biệt bệnh nhân trẻ tuổi Qua nghiên cứu 71 bệnh nhân xếp giai đoạn theo AJCC lần thứ năm 2017 , bảng 3.11 cho thấy khối u MSI-H gặp giai đoạn IV u MSI-H có tỷ lệ mắc cao u MMSS/MSI-L giai đoạn I II (lần lượt 27,8; 61,1 so với 17,0; 52,8%) Sự khác biệt ý nghĩa thống kê, với p>0,005 (p=0,372) Trong bảng 3.12, thể LS đơn lẻ/LS gặp tỷ lệ cao giai đoạn I (12,5 40,0%) giai đoạn II 75,0 50,0% Trong UTĐTT đơn lẻ chiếm tỷ lệ cao giai đoạn III (24,5%) gặp giai đoạn IV (5,7%) Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, với p>0,005 (p=0,499) Typ MBH ĐMH Ung thư ĐTT khiếm khuyết hệ thống sửa chữa bắt cặp sai có đặc trưng GPB-LS rõ ràng: bệnh nhân trẻ, vị trí gần, phản ứng đệm lympho dạng Crohn, typ tế bào nhẫn chế nhày, thể tủy Các typ MBH gồm ung thư tuyến, ung thư biểu mô tế bào nhẫn, ung thư biểu mô tuyến nhày ung thư biểu mô tủy Ung thư biểu mơ nhầy gồm 50% mô u chất nhày Tương tự, ung thư biểu mơ tế bào có 50% mơ u tế bào nhẫn Ung thư biểu mô tủy u khơng biệt hóa gồm đám có ranh giới rõ mơ đệm xâm nhập nhiều lympho mô u quanh mô u Chúng tơi nhận thấy (bảng 3.13) u MSI-H có tỷ lệ typ nhày, tế bào nhẫn tỷ cao so với u MSS/MSI-L, tỷ lệ 33,3% so với 43 20,8%; 5,6% so với 0% typ tế bào nhẫn typ thể tủy Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p0,05 (p=0,192) Jenkins et al cho thấy 11% u MSI-H typ nhày typ MBH tuyến khác (10 trường hợp tế bào nhẫn typ tủy), 21% u MSI-H biệt hóa Tác giả nhận thấy tất đặc điểm đặc hiệu cho u MSI-H typ MBH đặc biệt, có xấp xỉ 90% UTB tuyến (không chế nhày) MSI-L MSS Trong nghiên cứu Alexander et al thấy typ tủy, tuyến biệt hóa đặc biệt hay kết hợp với MSI-H Typ tế bào nhẫn phát 13% u MSI-H (12/ 92) 5% u MSS (12/231) (P = 0,02; OR 2.7) UTBM nhày xác định 15% u MSI-H (14/92) 5% u MSS (12/231; P = 0,005; OR 3.3) Có khác biệt có ý nghĩa tỷ lệ thành phần nhày u MSI-H MSS (P = 0.0003; odd ratio, 3.7), độ nhạy để xác định u MSI-H thấp (22%) Các đặc điểm MBH phân biệt u MSI-H u MSS sử dụng kết hợp để cố gắng tăng độ nhạy để xác định MSI-H 44 trì độ đặc hiệu Sử dụng xâm nhập lympho u rõ tiêu nhuộm HE, tiếp đến sử dụng vùng mô học nhày trường hợp lại, có độ nhạy (74%) độ đặc hiệu (83%) phân biệt u MSI-H với u MSS Phân tích kết hợp dương tính gợi ý yếu tố để xác định u MSI-H vớiUTBM ĐTT đơn lẻ xâm nhập lympho u, đặc điểm không giúp phát 10% u MSI-H tiêu HE khơng có xâm nhập lympho u Sự xâm nhập mạch thần kinh Sự xâm nhập mạch và/hoặc thần kinh dấu hiệu tiên lượng xấu Các thông tin giúp ích cho nhà lâm sàng tiên lượng điều trị bệnh, định điều trị bổ trợ trường hợp u T1-T2, có biểu u xâm nhập và/hoặc thần kinh Trong nghiên cứu (bảng 3.21), u MSI-H có tỷ lệ xâm nhập thần kinh thấp MSS/MSI-L 5,6% 17,0% (p=0,228) Tương tự, tình trạng u xâm nhập mạch (bảng 3.22), u MSI-H có tỷ lệ xâm nhập mạch thấp MSS/MSI-L 27,8% 37,7% (p=0,444) Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê với p>0,05 Khi đánh giá thể lâm sàng (bảng 3.23 3.24), chúng tơi nhận thấy thể LS khơng có trường hợp xâm nhập thần kinh, thể đơn lẻ/LS chiếm 10%, u đơn lẻ chiếm 17% (p=0,403) Khi xem xét mô u xâm nhập mạch, thấy thể đơn lẻ/LS có tỷ lệ xâm nhập mạch thấp 20,0%, tiếp đến thể LS (37,5% thể đơn lẻ 37,7% (p=0,554) Tuy nhiên khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, với p>0,05 4.2.3 Mối liên quan với phản ứng thể Sự xâm nhập lympho vào mô u Sự xâm nhập lympho u xác định tế bào lympho xâm nhập vào tế bào u có tế bào lympho vi trường có độ phóng đại cao (×40) 10 vi trường có độ phóng đại cao 45 Khối u với MSI có số lượng lớn tế bào lympho xâm nhập khối u kích hoạt gây độc tế bào; phản ứng lympho bào có liên quan cách độc lập với thời gian sống thêm kéo dài Nghiên cứu báo cáo khối u ĐTT có xâm nhập lympho bào có liên quan với thời gian sống thêm lâu hơn; thực tế, xâm nhập lympho yếu tố tiên lượng tốt so với giai đoạn GPB Kết HMMD MSH2 MLH1 bất thường dự đoán độc lập kết tốt bệnh nhân với khối u ĐTT giai đoạn II-T3 Do đó, phát MSI bệnh nhân với ung thư ĐTT yếu tố tiên lượng tốt, đặc biệt bệnh nhân trẻ tuổi Trong nghiên cứu (bảng 3.17), nhận thấy u MSI-H hay có biểu xâm nhập lympho vào u (61,1%), trái lại nhóm MSS/MSI-L gặp tượng (71,1%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p