BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY LAN TỎA DI TRUYỀN CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI- 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY LAN TỎA DI TRUYỀN Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn Cho đề tài: Nghiên cứu đột biến gen CDH1 (E-cadherin) bệnh nhân ung thư dày lan tỏa di truyền Chuyên ngành: Hóa sinh Mã số: 62720112 CHUYÊN ĐỀ TIẾN SĨ HÀ NỘI – 2018 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Sinh học phân tử lĩnh vực thu hút nhiều ý với khả áp dụng nhiều phương pháp nghiên cứu từ ngành khoa học khác để nghiên cứu tìm quy luật sống Nhờ hiểu biết tiến sinh học phân tử, người nắm rõ chế bệnh sinh ung thư xác định gen quan trọng chế ung thư Ung thư dày dạng ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ mắc tử vong cao Có nhiều yếu tố gây ung thư dày, yếu tố di truyền yếu tố nguy quan trọng Hiện khoa học tìm đột biến dòng mầm gen CDH1, gen hay gặp nhất, chiếm 30% số trường hợp mắc ung thư dày di truyền Bài chuyên đề sau hệ thống hóa phương pháp sinh học phân tử dụng để đánh giá đột biến gen CDH1 bệnh ung thư dày di truyền Tổng quan sinh học phân tử 1.1 Định nghĩa Sinh học phân tử ngành lĩnh vực sinh học tập trung nghiên cứu thành phần, cấu trúc tương tác phân tử tế bào vai trò yếu tố sinh lý bình thường người bệnh lý ung thư 1.2 Lịch sử Ngành sinh học phân tử (SHPT) bắt đầu phát triển từ năm 1930 Nhưng đến năm 1950 ngành SHPT thực bùng nổ Trong khoảng thập kỉ này, nghiên cứu tập trung vào chế tự nhân lên DNA giải thích hoạt động mã hóa thơng tin Tuy ngành phát triển từ trước đó, thuật ngữ thức sử dụng từ năm 1938 nhà khoa học người Mỹ Warren Weaver, giám đốc Quỹ Rockefeller khoa học tự nhiên [1] Ban đầu thuật ngữ sinh học phân tử bắt nguồn từ ý tưởng đưa vật lý hóa học để giải thích tượng sống Bằng việc định nghĩa sống qua chế lý hóa học, ngành SHPT tập trung nguồn lực vào vấn đề liên quan đến đại phân tử Để sinh học phân tử phát triển, nhiều công cụ nghiên cứu lĩnh vực khác đưa vào vật lý, tốn học, hóa học nhưg ngành liên quan đến sống (gen, mô phôi, sinh lý, vi sinh…) Thực sự, sinh học phân tử cách mạng xóa bỏ ranh giới ngành khoa học, tạo tương tác rộng lớn chưa có việc tìm quy luật sống Hai trọng tâm nghiên cứu SHPT đại phân tử - (1) acid nucleic (DNA) cấu thành nên gen (2) protein Hiện với lên kĩ thuật, hàng loạt gen giải mã thời gian ngắn với giá thành ngày giảm Nếu đầu kỉ 21, dự án Giải mã gen người phải tiêu tốn chục tỷ la Mỹ để giải mã tồn hệ gen cần 100 triệu la Mỹ giờ, chi phí 1000 la Mỹ [2] Hình Biểu đồ giá thành giải mã toàn hệ gen qua năm Một ứng dụng quan trọng SHPT ngày liệu pháp gen, đặc biệt lĩnh vực ung thư bệnh di truyền phổ biến gặp Sinh học phân tử đóng vai trò quan trọng việc giúp người hiểu hình thành, hoạt động điều hòa cấu trúc tế bào Điều giúp cho người tìm loại thuốc mới, chẩn đoán bệnh sinh lý tế bào Nhiều trung tâm biobank thiết lập nhiều nước để nhà khoa học tận dụng lượng liệu khổng lồ ngân hàng gen nghiên cứu hiểu sâu sắc thêm chế sinh bệnh, từ đưa phương pháp điều trị trúng đích 1.3 Một số cột mốc quan trọng ngành sinh học phân tử Những năm 1940: Avery, MacLeod McCarty tìm DNA 1953: Watson Crick phát cấu trúc xoắc kép DNA 1972: Thực kĩ thuật tổng hợp gen 1980s: thực tái tổ hợp gen giải trình tự gen 1983: kĩ thuật PCR Mullis phát triển, kĩ thuật shpt 2003: hoàn thành Dự án giải mã đồ gen người 2015: phương pháp giải trình tự gen (next gen sequencing) giúp giảm giá thành giải mã toàn hệ gen xuống 1000 đô la Mỹ 1.4 Ứng dụng sinh học phân tử ngành ung thư Ung thư vấn đề quan tâm dồn nhiều nguồn lực để nghiên cứu thập kỉ gần Với phát triển SHPT, người hiểu nhiều vấn đề ứng dụng tiến ngành SHPT đẩy lùi bệnh SHPT đóng góp vào phát triển tiến cận dự phòng, chẩn đốn điều trị Ví dụ ung thư biểu mô tuyến đại tràng, tỉ lệ sống sau năm giảm từ 90% khối u khu trú xuống 60% di vùng khoảng 5% di xa Nhờ có SHPT mà số bệnh nhân có yếu tố gia đình đánh giá phát đột biến gen ức chế sinh ung thư, giúp phát sớm trường hợp có nguy cao làm tăng thời gian sống bệnh nhân [3] Hình Tỉ lệ sống sau năm giai đoạn ung thư đại tràng [3] Các liệu pháp điều trị hưởng lợi từ phát triển SHPT Bên cạnh biện pháp điều trị truyền thống hóa trị, xạ trị phẫu thuật, liệu pháp gen xu hướng xây dựng nhờ hiểu biết chế sinh ung thư gen bất thường Một thành tựu bật kể đến việc sử dụng trastuzumab, chất kháng thể đơn dòng gắn vào receptor HER2 - yếu tố gặp 25% số bệnh nhân ung thư vú, giúp cải thiện tiên lượng sống bệnh nhân [4, 5] Hình Một số thành tựu ứng dụng từ sinh học phân tử [6] Ứng dụng sinh học phân tử nghiên cứu gen CDH1 HDGC 2.1 Tổng quan dạng đột biến gen CDH1 bệnh HDGC Ung thư dày (UTDD) bệnh nhiều yếu tố gây nên, khoảng 10-30% số trường hợp có tiền sử gia đình mắc bệnh ung thư 1-3% có đột biến gen mầm CDH1 [7] Năm 1998, Guildford người đột biến gen mầm CDH1 mã hóa cho protein E-cadherin chế sinh ung thư gia đình người Maori New Zealand [8] Cơng trình nghiên cứu ơng dựa kĩ thuật RT-PCR phân tích đa hình sợi đơn (SSCP) Sau loại cơng trình nghiên cứu khác kết Nhờ công sức tiến kĩ thuật SHPT, khả phát đột biến gen CDH1 ngày cao Tính đến có khoảng 155 dạng đột biến gây bệnh gen mầm CDH1 tìm thấy [9] Các dạng đột biến gen mầm CDH1 cập nhật https://databases.lovd.nl/shared/genes /CDH1 liên tục website 10 Không phải xuất đột biện gen CDH1 biểu bệnh Nguy mắc tích lũy UTDD tính đến 80 tuổi 70% nam 56% nữ Bên cạnh đó, trường hợp có đột biến gen lành tính, khơng có khả gây bệnh [9] Các dạng đột biến thường gặp cắt đoạn protein (bao gồm đột biến dịch khung đột biến vô nghĩa, đột biến chỗ nối) chiếm 75% Còn lại 25% đột biến sai nghĩa gây ảnh hưởng đến chức Phương pháp phân tích phát phần lớn dạng đột biến gen CDH1 Tuy nhiên có tỉ lệ định trường hợp không phát đột biến sử dụng phương pháp phân tích phổ thơng mà cần phương pháp phân tích khác bên cạnh PCR thông thường để phát bệnh 2.2 Tổng quan phương pháp phân tích, cách tiếp cận chẩn đoán gen CDH1 Bên cạnh yếu tố lâm sàng, công cụ sinh học phân tử điều cần thiết để xác định xác bất thường hệ gen Phát đột biến gen CDH1 nguyên nhân gây bệnh CDH1 cần cách tiếp cận đa mơ thức chưa có giải pháp tối ưu để đánh giá tổng thể [10, 11] Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng, tùy trường hợp mà đánh giá lựa chọn phương pháp phù hợp Các yếu tố cần cân nhắc để đánh giá khả áp dụng hạn chế phương pháp phân tích, khả kinh tế, tính chất nghiên cứu Ngoài ra, yêu cầu cách tiếp cận đặc điểm nghiên cứu mà từ khâu lựa chọn mô bệnh học có lưu ý định để nghiên cứu đột biến Cách tiếp cận để phát trường hợp có đột biến gen CDH1 tham khảo biểu đồ Đối tượng người thân bệnh nhân bệnh nhân chẩn đốn HDGC Hướng dẫn đồng thuận tổ chức International Gastric Cancer Linkage Consortium 16 Biểu đồ Mức độ biểu E-cadherin [20] 3.2.3 Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) 30-35% số bệnh nhân chẩn đốn HDGC phát đột biến gen CDH1 phương pháp PCR thông thường Tuy nhiên, nhược điểm phương pháp khơng phát đột biến xóa/thêm đoạn lớn exon, tạo biến thể số lượng (Copy number variant CNV) vốn chiếm 4-5% số trường hợp HDGC Vì vậy, với trường hợp khơng phát đột biến có ý nghĩa, cần tiến hành phương pháp MLPA [17] 17 Hình Các dạng biến thể số lượng (CNV) [27] Để thực kĩ thuật này, cần biến tính DNA thành dạng sợi đơn, lai với đoạn dò MLPA vị trí định cấu trúc exon cần nghiên cứu Đoạn dò đoạn oligonucleotid riêng biệt đầu 5’ 3’ có gắn huỳnh quang đoạn cần nghiên cứu Sau tượng gắn xảy đoạn dò chúng lai với đoạn gen cần giải mã (hình 8) Phản ứng PCR sau tiến hành sản phẩm tạo đánh giá dựa lượng huỳnh quang đo sau thực PCR Kết cần đối chứng với nhóm chứng để phân tích [28] 18 Hình Quy trình phản ứng MLPA Biểu đồ thể kết nghiên cứu đoạn gen CDH1 tác giả Olivera Khi đối chiếu với nhóm chứng, kết cho thấy bệnh nhân có đoạn gen exon 14,15 16 19 Biểu đồ Kết phân tích MLPA [29] Ưu điểm kĩ thuật so sánh với nhóm chứng phát hiện tượng xóa/thêm đoạn lớn Tuy nhiên tính chất kĩ thuật mà việc phát xác điểm gây đột biến khó xác Ngồi kết phương pháp không giúp khẳng định nguyên nhân gây tượng lặp đoạn nằm cấu trúc DNA [28] 3.2.4 Multiplex PCR Multiplex PCR kĩ thuật chuyên sâu với đặc trưng khả nhân lên nhiều đoạn gen lúc với lượng mẫu bệnh phẩm ban đầu (hình 8) Nếu PCR thơng thường nhân đoạn gen lần thực kĩ thuật Multiplex PCR nhân nhiều đoạn gen phục vụ cho nghiên cứu lớn Nhờ kĩ thuật mà chi phí phân tích hệ gen giảm đáng kể so với việc PCR đoạn gen đơn lẻ Ngoài ra, ưu điểm quan trọng khác giảm thời gian thao tác tay, khả đối chứng nội kiểm nhằm đánh giá chất lượng PCR, xác định chất lượng mẫu… Tuy nhiên nhược điểm phụ thuộc nhiều vào chất lượng PCR mastermix, khả nhân lên phụ thuộc vào chất lượng DNA Thơng thường phương pháp sử dụng đại trà Ứng dụng quan trọng Multiplex PCR giúp cho nghiên cứu quy mô lớn cần phân tích nhiều gen lúc 20 Hình Phương pháp multiplex PCR Tuy CDH1 xác định gen gây bệnh HDGC, đột biến gen chiếm khoảng 30% số trường hợp chẩn đốn HDGC Có đến 50-70% số trường hợp chưa tìm đột biến gây bệnh Đây đột biến gene khác mà nhà khoa học chưa phát Đối với trường hợp này, cần phân tích multiplex PCR giải trình tự nhằm tìm gen gây bệnh HDGC Một số gen tiềm cho có liên quan đến bệnh HDGC CTNNA1, PALB2, RECQL5, MSH2… [17, 30, 31] Tuy nhiên chưa có nghiên cứu khẳng định chắn gen gây bệnh bên cạnh CDH1 Vì vậy, việc phân tích multiplex PCR cần thực cho trường hợp HDGC CDH1 âm tính nhằm tìm đột biến gen giúp hiểu thêm chế gây bệnh 3.3 Giải trình tự gen 21 3.3.1 Direct Sequencing Giải trình tự gen trực tiếp phương pháp kinh điển để phát đột biến gen Các bước tiến hành tương đối tương giản Đầu tiên DNA sợi kép tách thành sợi đơn, sau chia làm ống Mỗi ống bao gồm đoạn mồi oligonucleotid, DNA polymerase hỗn hợp loại nucleotid dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) loại dideoxynucleotid có đánh dấu đồng vị phóng xạ ddNTP (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) để tạo cấu trúc kép đoạn gen ghép đôi dNTP ddNTP gắn vào Quá trình giải trình tự dừng lại vị trí này, tạo đoạn DNA có độ dài khác Sau mẫu đưa vào điện di môi trường gel Polyacrylamide Agarose để giải trình tự gen (hình 9) Hình Kĩ thuật giải trình tự gen trực tiếp 22 Hình 10 Đột biến c.1212delC phát Direct sequencing [32] Ưu điểm phương pháp giá thành rẻ, dễ thực khả phát đột biến tốt Chúng có nhược điểm thời gian để nhận kết lâu, lên đến vài ngày tùy thuộc vào chiều dài đoạn gen Ngồi ra, với mẫu mơ thu thập từ vị trí khối u độ đặc hiệu phương pháp giảm đi, dễ gây âm tính giả Tuy nhờ ưu phương pháp mà phần lớn nghiên cứu gen CDH1 nói riêng gen nói chung mà chúng lựa chọn hàng đầu để phát bất thường 3.3.2 Bisulfite Sequencing Một chế quan trọng khởi phát ung thư thay đổi hệ epigenetic Epigentic hiểu đơn giản “những thay đổi kiểu hình di truyền ổn định chromosome mà khơng thay đổi chuỗi DNA” [33] Bình thường, epigenetic có khả methyl hóa DNA, thay đổi sau dịch mã, tái cấu trúc nucleosome, điều hòa RNA khơng mã hóa…[34, 35] Theo đó, người có biến đổi hệ làm thay đổi biểu gen cân hệ gen Sự methyl hóa vùng promoter gen bật hoạt gen ức chế sinh u, tạo điều kiện để khối u phát triển Một phương pháp đánh giá tác động hệ epigenetic bisulfite sequencing Cơ chế bisulphit sequencing dùng bisulphite để 23 chuyển methyl-Cytosine thành Uracil, mức độ methyl hóa đoạn DNA dựa mức độ methyl hóa cytosine Mức độ methyl hóa nhiều gen dễ bị bất hoạt Một số nghiên cứu ghi nhận bất thường hệ làm bất hoạt gen mầm CDH1 đóng vai trò chế bất hoạt thứ 2, gây ung thư [11, 36, 37] Hình 11 Các bước kĩ thuật Bisulfite sequencing 3.3.3 Next Generation Sequencing (NGS) Với yêu cầu giải trình tự tồn hệ gen hiệu hơn, nhiều nguồn lực đổ vào nhằm nâng cao tốc độ giải trình tự gen giảm giá thành phương pháp Một ứng dụng quan trọng đóng góp vào q trình đời Next generation sequencing (NGS) Công nghệ thực cách mạng Nhờ ưu công suất cao (high throughput), thời gian ngắn, chi phí thấp giúp giấc mơ giải trình tự tồn hệ gen người với mức giá 1000 đô la Mỹ thành thực [38] Trong sản phẩm thị trường phương pháp dẫn đầu 454 Pyrosequencing, Ilumina SOLiD Ion Torrent Dù áp dụng công nghệ khác trải qua bước chính: chuẩn bị thư viện DNA (cắt DNA thành đoạn nhỏ) gắn lên giá bám, khuếch đại giải trình tự Tùy 24 theo mục đích mà sử dụng NGS việc giải mã toàn hệ gen (whole genome sequencing), toàn đoạn exon (whole exome sequencing) vị trí đặc biệt cần nghiên cứu (target sequencing) [19] Hình 12 Hình ảnh minh họa bước NGS 3.3.3.1 Whole genome sequencing (WGS) Whole exome sequencing (WES) Với khả nghiên cứu toàn hệ gen, WGS WES thường áp dụng nghiên cứu SHPT ung thư dày [31, 39, 40] Bên cạnh CDH1 nhiều gen gây HDGC chưa tìm WGS WES phương pháp giúp nhà khoa học tìm khoảng trống Tuy nhiên ưu điểm NGS nhược điểm Dữ liệu khổng lồ mà phương pháp đưa gây khó khăn việc phân tích kết quả, xác định loại đột biến gây bệnh Ngoài giá thành cao cản trở cho việc áp dụng rộng rãi phương pháp nghiên cứu thực hành lâm sàng Ngoài đặc điểm kể riêng với WES nhược điểm khơng bao phủ hết tồn exon Chỉ có khoảng 80-90% số exon giải mã nên làm tăng nguy xuất âm tính giả Ngồi WES khơng có khả phát hết biến thể số lượng (CNV) [41] Khả ứng dụng rộng rãi cho bác sĩ lâm sàng yếu tố cần phải lưu ý [42] 25 3.3.3.2 Pyrosequencing Pyrosequencing kĩ thuật NGS với ứng dụng phát bất thường hệ epigenetics tương tự kĩ thuật bisulfite sequencing Tuy nhiên, pyrosequencing cho phương pháp có độ tin cậy cao Phương pháp ứng dụng cảm ứng quang protein luciferase tạo q trình tổng hợp Ngồi ra, chúng ưu khả phát methyl hóa DNA mà khơng cần tạo dòng DNA bisulfite sequencing [43] Tuy nhiên nhược điểm phương pháp tốn chiều dài trình tự phân tích ngắn Hình 13 Quy trình kĩ thuật 454 Pyrosequencing TÀI LIỆU THAM KHẢO Kay, L.E., Monographs on the History and Philosophy of Biology 1996: Oxford University Press 320 Hayden, E.C., Technology: The $1,000 genome Nature, 2014 507(7492): p 294-5 GM, C., The Cell: A Molecular Approach 2nd edition ed 2000 Morrow, P.K.H., F Zambrana, and F.J Esteva, Recent advances in systemic therapy: Advances in systemic therapy for HER2-positive metastatic breast cancer Breast Cancer Research, 2009 11(4): p 207 Pegram, M.D., G Konecny, and D.J Slamon, The molecular and cellular biology of HER2/neu gene amplification/overexpression and the clinical development of herceptin (trastuzumab) therapy for breast cancer Cancer Treat Res, 2000 103: p 57-75 Blanco, E., et al., Molecular-targeted nanotherapies in cancer: Enabling treatment specificity Molecular Oncology, 2011 5(6): p 492-503 Corso, G., D Marrelli, and F Roviello, Familial gastric cancer and germline mutations of E-cadherin Ann Ital Chir, 2012 83(3): p 177-82 Guilford, P., et al., E-cadherin germline mutations in familial gastric cancer Nature, 1998 392(6674): p 402-5 Kaurah P, H.D., Hereditary Diffuse Gastric Cancer GeneReviews® [Internet] 2002 Nov [Updated 2018 Mar 22]: Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018 10 Zhang, H., et al., Germline mutations in hereditary diffuse gastric cancer Chin J Cancer Res, 2018 30(1): p 122-30 11 Molinaro, V., et al., Complementary molecular approaches reveal heterogeneous CDH1 germline defects in Italian patients with hereditary diffuse gastric cancer (HDGC) syndrome Genes Chromosomes Cancer, 2014 53(5): p 432-45 12 van der Post, R.S., et al., Hereditary diffuse gastric cancer: updated clinical guidelines with an emphasis on germline CDH1 mutation carriers J Med Genet, 2015 52(6): p 361-74 13 Richards, S., et al., Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology Genet Med, 2015 17(5): p 405-24 14 Carneiro, F., et al., Molecular pathology of familial gastric cancer, with an emphasis on hereditary diffuse gastric cancer J Clin Pathol, 2008 61(1): p 25-30 15 Bacani, J.T., et al., CDH1/E-cadherin germline mutations in early-onset gastric cancer J Med Genet, 2006 43(11): p 867-72 16 Lajus, T.B and R.M Sales, CDH1 germ-line missense mutation identified by multigene sequencing in a family with no history of diffuse gastric cancer Gene, 2015 568(2): p 215-9 17 Hansford, S., et al., Hereditary Diffuse Gastric Cancer Syndrome: CDH1 Mutations and Beyond JAMA Oncol, 2015 1(1): p 23-32 18 Kaurah, P., et al., Founder and recurrent cdh1 mutations in families with hereditary diffuse gastric cancer JAMA, 2007 297(21): p 2360-2372 19 Verma, R and P.C Sharma, Next generation sequencing-based emerging trends in molecular biology of gastric cancer Am J Cancer Res, 2018 8(2): p 207-25 20 Barber, M., et al., Mechanisms and sequelae of E-cadherin silencing in hereditary diffuse gastric cancer J Pathol, 2008 216(3): p 295-306 21 Pikor, L.A., et al., DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses J Vis Exp, 2011(49) 22 Clark, D.P and N.J Pazdernik, Chapter e6 - Polymerase Chain Reaction, in Molecular Biology (Second Edition), D.P Clark and N.J Pazdernik, Editors 2013, Academic Press: Boston p e55-e61 23 Suriano, G., et al., Characterization of a recurrent germ line mutation of the E-cadherin gene: implications for genetic testing and clinical management Clin Cancer Res, 2005 11(15): p 5401-9 24 Oliveira, C., et al., Role of pathology in the identification of hereditary diffuse gastric cancer: report of a Portuguese family Virchows Arch, 2005 446(2): p 181-4 25 Keller, G., et al., Germline mutations of the E-cadherin(CDH1) and TP53 genes, rather than of RUNX3 and HPP1, contribute to genetic predisposition in German gastric cancer patients J Med Genet, 2004 41(6): p e89 26 Garziera, M., Identification and Characterization of CDH1 Germline Variants in Sporadic Gastric Cancer Patients and in Individuals at Risk of Gastric Cancer 2013 8(10) 27 Estivill, X and L Armengol, Copy Number Variants and Common Disorders: Filling the Gaps and Exploring Complexity in Genome-Wide Association Studies PLOS Genetics, 2007 3(10): p e190 28 Gomes, A and B Korf, Chapter - Genetic Testing Techniques, in Pediatric Cancer Genetics, N.H Robin and M.B Farmer, Editors 2018, Elsevier p 47-64 29 Oliveira, C., et al., Germline CDH1 deletions in hereditary diffuse gastric cancer families Hum Mol Genet, 2009 18(9): p 1545-55 30 Majewski, I.J., et al., An alpha-E-catenin (CTNNA1) mutation in hereditary diffuse gastric cancer J Pathol, 2013 229(4): p 621-9 31 Fewings, E., et al., Germline pathogenic variants in PALB2 and other cancer-predisposing genes in families with hereditary diffuse gastric cancer without CDH1 mutation: a whole-exome sequencing study Lancet Gastroenterol Hepatol, 2018 3(7): p 489-98 32 Yamada, H., et al., Germline alterations in the CDH1 gene in familial gastric cancer in the Japanese population Cancer Science, 2011 102(10): p 1782-1788 33 Berger, S.L., et al., An operational definition of epigenetics Genes Dev, 2009 23(7): p 781-3 34 Sandoval, J and M Esteller, Cancer epigenomics: beyond genomics Curr Opin Genet Dev, 2012 22(1): p 50-5 35 Ellis, L., P.W Atadja, and R.W Johnstone, Epigenetics in cancer: targeting chromatin modifications Mol Cancer Ther, 2009 8(6): p 1409-20 36 Oliveira, C., et al., Quantification of epigenetic and genetic 2nd hits in CDH1 during hereditary diffuse gastric cancer syndrome progression Gastroenterology, 2009 136(7): p 2137-48 37 Wu, P.Y., et al., Germline promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in gastric cancer World J Gastroenterol, 2012 18(1): p 70-8 38 Shendure, J and H Ji, Next-generation DNA sequencing Nat Biotechnol, 2008 26(10): p 1135-45 39 Vogelaar, I.P., et al., Unraveling genetic predisposition to familial or early onset gastric cancer using germline whole-exome sequencing European Journal Of Human Genetics, 2017 25: p 1246 40 Johnston, J.J., et al., Secondary Variants in Individuals Undergoing Exome Sequencing: Screening of 572 Individuals Identifies High-Penetrance Mutations in Cancer-Susceptibility Genes The American Journal of Human Genetics, 2012 91(1): p 97-108 41 Tan, R., et al., An evaluation of copy number variation detection tools from whole-exome sequencing data Hum Mutat, 2014 35(7): p 899-907 42 Volk, A., et al., Whole-Exome Sequencing in the Clinic: Lessons from Six Consecutive Cases from the Clinician's Perspective Mol Syndromol, 2015 6(1): p 23-31 43 Reed, K., et al., Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation Anal Biochem, 2010 397(1): p 96-106 ... TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG VIỆC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CDH1 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY LAN TỎA DI TRUYỀN Người hướng dẫn khoa học: GS.TS... người nắm rõ chế bệnh sinh ung thư xác định gen quan trọng chế ung thư Ung thư dày dạng ung thư phổ biến nhất, với tỉ lệ mắc tử vong cao Có nhiều yếu tố gây ung thư dày, yếu tố di truyền yếu tố... biến gen CDH1 bệnh ung thư dày di truyền Tổng quan sinh học phân tử 1.1 Định nghĩa Sinh học phân tử ngành lĩnh vực sinh học tập trung nghiên cứu thành phần, cấu trúc tương tác phân tử tế bào