1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Ý nghĩa đề tài Các sản phẩm tự nhiên dược phẩm bào chế từ thiên nhiên ngày thu hút ý so với loại thuốc Tây bán phổ biến thị trường Các hợp chất sinh học xem gốc rễ tốt để bào chế loại thuốc dẫn xuất chúng Ngoài ra, việc sử dụng hợp chất có hoạt tính sinh học từ thiên nhiên cho việc trị bệnh đem lại nhiều lợi ích việc bào chế chúng không để lại chất thải độc hại Bên cạnh đem lại nguồn thu kinh tế không nhỏ việc chữa loại bệnh thơng thường rối loạn tiêu hóa, biếng ăn, táo bón, buồn nơn,…vì từ thiên nhiên nên người tiêu dùng ưa chuộng Nấm dại gây hại tác nhân truyền nhiễm ni trồng nấm rơm, loài gây thay đổi giai đoạn phát triển sau thu hoạch Ngoài ra, số trường hợp, nấm nguyên nhân gián tiếp gây rối loạn dị ứng gây chết người cho người tiêu dùng tiết độc tố chất gây dị ứng Thơng thường, nấm gây hại kiểm sốt thuốc diệt nấm tổng hợp; nhiên, việc sử dụng chúng ngày bị hạn chế tác hại thuốc trừ sâu sức khỏe người môi trường ngày lớn [10] Một hướng nghiên cứu cần khai thác cho vấn đề tách chiết hợp chất từ thực vật tự nhiên có khả kháng lại nấm dại gây hại ni trồng nấm rơm Có khoảng 6000 lồi thực vật nhắc tới y học cổ truyền có khoảng 350 lồi sử dụng Vì số nên việc khảo sát chúng mang đến ý nghĩa lớn cho y học cổ truyền nước nhà Việt Nam nằm khu vực nhiệt đới gió mùa, có mưa quanh năm nên việc tìm hiểu tuyên truyền đến người thuốc dân gian thông qua cỏ để chữa bệnh việc làm cần thiết để hạn chế chi phí tốn dùng thuốc ngoại Ngồi đối tượng nghiên cứu hơm lồi Eclipta prostrata L (Cỏ mực) loại người biết đến cơng dụng nên để giúp bảo vệ nguồn gen phong phú phát huy giá trị loài em xin thực đề tài khảo sát khả kháng khuẩn, kháng nấm dại gây hại từ hợp chất sinh học tách từ cỏ mực nuôi trồng nấm rơm 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trong đề tài mục tiêu khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm hợp chất sinh học có thực vật Eclipta prostrata L (Cỏ mực) - Để thực điều cần tìm hiểu rõ hợp chất sinh học có đối tượng nghiên cứu - Xác định phương pháp phù hợp đem lại kết xác, khả quan - Định tính sơ thành phần hóa học có dịch chiết cỏ mực - Phân lập, định danh lồi nấm dại gây hại tới ni trồng nấm rơm - Thí nghiệm chế đối kháng nấm rơm với loài nấm thể nấm sợi - Đánh giá khả kháng khuẩn Salmonella, kháng khuẩn gây sâu Streptococcus mutans kháng loài nấm dại dịch chiết cỏ mực Lentinus squarrosulus, Paecilomyces formosus, Coprinus ephemeroides CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Đặc điểm cỏ mực 2.1.1 Danh pháp [22] Eclipta prostrata L loại thực vật thuộc chi Eclipta, họ Asteraceae biết đến với tên gọi cỏ mực Sở dĩ gọi cỏ mực vò nát thấy có nước chảy đen mực Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Spermatophyta (Thực vật có hạt) Phân ngành: Angiospermae (Thực vật hạt kín) Lớp: Dicotyledonae (Thực vật hai mầm) Bộ: Asterales (Cúc) Họ: Asteraceae (Cúc) Chi: Eclita Hình 2.1 Eclipta prostrata (Eclipta alba) (Nguồn: www.amazon.in) Loài: Eclipta prostrata L Tên thường gọi: Cỏ mực, nhọ nồi, hạn liên thảo, lệ trường, phong trường Tên khoa học: Eclipta alba (L.) Hassk.; Eclipta prostrata L Tên nước ngoài: False Daisy, yerba de tago, bhringraj, Dyer’s weed, Dye-weed, White eclipta, Éclipte droite (Pháp) 2.1.2 Đặc điểm hình thái [24] Cỏ mực thuộc loại hàng năm mọc bò thẳng đứng, có lơng thưa, cứng với chiều cao trung bình từ 0,2 – 0,4 m, đến 0,8 m Thân: màu nâu, lục nhạt đỏ tía Lá: mọc đối, phiến hẹp dài tầm 2,5 cm x 1,2 cm Mép nguyên có cưa cạn, có lơng hai mặt Lá mọc đối có lơng mặt, dài – cm, rộng – 15 mm Hoa: màu trắng hợp thành đầu, mọc đầu cành kẽ lá, có hoa lưỡng tính hoa bên ngồi Cụm hoa hình đầu màu trắng kẽ đầu cành, thon dài – mm, có lơng Quả: dẹt, có cạnh màu đen dài tầm mm, rộng 1,5 cm, có – vảy nhỏ đầu 2.1.3 Phân bố [24] Cỏ mực sử dụng phận khác vùng nhiệt đới vùng cận nhiệt đới Nam Mỹ, Châu Á Châu Phi Có loại cỏ mực: cỏ mực hoa trắng, cỏ mực hoa vàng, cỏ mực trái đen tất loại diện khắp nơi Ấn Độ, vùng đầm lầy, ao hồ, sông rạch hay chân dãy Himalalaya Cỏ mực phân bố vùng Nam Đông Nam châu Á phân phối rộng khắp nơi Ấn Độ, Trung Hoa, Việt Nam, Thái Lan, Brazil, Ở Việt Nam phân bố khắp tỉnh, ưa ẩm, ưa sáng Mùa hoa quả: quanh năm 2.1.4 Công dụng cỏ mực [24] Ở Việt Nam: Cỏ mực dùng để chữa xuất huyết nội tạng xuất huyết ruột, ho máu, chảy máu lợi, nướu, răng; trị sưng gan, bàng quang, đường tiểu, mụn nhọt đầu đinh, băng bó ngồi giúp liền xương Trên giới: - Đài Loan: thường dùng điều trị: chảy máu, ho máu, tiểu máu, ngứa, viêm gan, bệnh bạch hầu, tiêu chảy - Trung Quốc: người ta dùng cỏ mực loại dược thảo thực phẩm để hỗ trợ tim, dây thần kinh, gan mắt Dung dịch trích từ vị thuốc bổ gan mạnh, trẻ hoá đặc biệt cho tóc Đây loại thuốc nhuộm thiên nhiên dùng để xăm Khi dùng ngồi da trị chứng: đau nhức xương khớp, viêm da, dùng da đầu trị chứng rụng tóc chống độc bò cạp chích 2.2 Các nghiên cứu hóa học dược tính cỏ mực Hóa học: Các hợp chất hóa học có alkaloid, ecliptine, nicotine, glucoside, coumarine wedelolacton [22] Wedelolactone báo cáo có đặc tính trị liệu để chữa trị viêm gan xơ gan (Wagner et al 1986), kháng khuẩn chống xuất huyết (Kosuge et al 1985) Dược tính: Cây cỏ mực có đặc tính dược lý kéo mài vết thương, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, chống nhiễm độc gan, chống mỡ máu cao, hoạt động điều hòa miễn dịch, tăng trưởng tóc rụng tóc,…[22] 2.2.1 Tình hình nghiên cứu nước [5], [8], [9] Tạp chí khoa học 2015 có “Khảo sốt hoạt tính kháng oxy hóa kháng vi khuẩn Enterobacter cloacae cao chiết từ Cỏ mực (Eclipta alba Hassk.)” trường Đại học Cần Thơ thực Đái Thị Xuân Trang Võ Thị Tú Anh cho kết tất loại cao chiết từ lá, thân, rễ cỏ mực chiết với bốn loại dung môi methanol, hexane, chloroform ethyl acetate cho hoạt tính kháng dòng vi khuẩn Enterobacter cloacae Bên cạnh báo hoạt tính kháng oxy hóa từ cao chiết cỏ mực cao cao ethyl acetate Một báo cáo khoa học khác tạp chí khoa học 2015 “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực (Eclipta alba) vi khuẩn phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon)” cho kết luận dịch chiết cỏ mực có khả ức chế phát triển 10/12 chủng vi khuẩn phân lập từ 30 mẫu tôm sú Trong 10 chủng vi khuẩn có khả gồm Vibrio parahaemolycus, Vibrio brasiliensis, Enterobacter kobei, Staphylococcus aureus, Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila,… Trần Hoàng Hải (2015) thực đề tài khóa luận “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao methanol cao phân đoạn ly trích từ thân cỏ mực (Eclipta alba)”, báo cáo cho thấy loại cao chiết từ thân có hoạt tính kháng khuẩn dòng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus Vibrio parahaemolyticus 2.2.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước [14] Theo báo cáo khoa học (Karunambigai, A Gayathri Devi et al 2014) khả kháng khuẩn cao chiết từ rễ cỏ mực với hai dung môi benzene chloroform cho kháng lại chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri Điều chứng tỏ cỏ mực có khả kháng đa dạng chủng vi khuẩn 2.3 Một số chủng nấm gây hại ni trồng nấm rơm Nấm rơm lồi nấm phổ biến sử dụng nhiều ăn người Việt Nam Để tạo môi trường tốt việc ni trồng chúng ngồi vấn đề thời gian ni trồng, tưới tiêu, loại phân bón sử dụng mà phải kể đến thành phần gây độc hại gây bệnh gây chết nấm rơm loài nấm dại Trong đề tài nghiên cứu loài nấm dại gây hại thu hoạch từ trại nấm rơm Bình Chánh sau đem phòng thí nghiệm phân lập định danh loài Sau phân lập hoàn toàn, chủng nấm khảo sát mật độ lan tơ mức độ đối kháng chúng với nấm rơm điều kiện phát triển Thêm vào để tìm phương pháp khả quan loại bỏ loài nấm dại ta khảo sát thêm khả kháng chúng dịch chiết từ cỏ mực 2.4.1 Lentinus squarrosulus [25], [29] Giới: Fungi Ngành: Basidiomycota Lớp: Agaricomycetes Bộ: Polyporales Họ: Polyporaceae Chi: Lentinus Loài: Lentinus squarrosulus Đặc điểm chung Hình 2.2 Lentinus squarrosulus Lentinus squarrosulus loại nấm hoang dã ăn thường thấy châu Á Lồi có số tính thú vị tăng trưởng sợi nấm nhanh chóng, có tiềm sử dụng làm thực phẩm, thực phẩm chức dược phẩm Đây loại nấm màu trắng có khả sống hoại sinh, sống gỗ chết gỗ mục nát rừng, kích thước khoảng – 12 x – µm Sợi nấm Lentinus squarrosulus chứa protein cao (57,6%) tổng chất béo thấp (0,5%), giàu magie (0,4%), kali (3,8%) vitamin B3 (0,2%) Lentinus squarrosulus trồng thành công vỏ sắn, rơm rạ vỏ Nó tìm thấy có hàm lượng chất xơ cao (Fasidi Kadiri, 1999) Hàm lượng protein loại nấm báo cáo gấp đôi so với khoai tây Ireland sáu lần so với cam (Atikpo et al., 2008), bên cạnh hàm lượng axit amin thiết yếu vượt bậc so với đậu thận 2.4.2 Paecilomyces formosus [19], [27] Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sodariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipitaceae Chi: Paecilomyces Loài: Paecilomyces formosus Hình 2.3 Paecilomyces formosus Đặc điểm chung Paecilomyces lồi nấm có nguồn gốc từ đất phổ biến tự nhiên Nấm Paecilomyces ký sinh nhiều lồi trùng thuộc cánh cứng, nửa cứng, cánh màng, cánh vảy hai cánh Bào tử nấm nẩy mầm, xâm nhiễm vào bên thể sinh sản xoang máu làm yếu phá hoại chức trao đổi chất cuối gây côn trùng chết 2.4.3 Coprinus ephemeroides [26], [28] Giới: Fungi Ngành: Basidiomycota Lớp: Agaricomycetes Bộ: Agaricales Họ: Psathyrellaceae Chi: Coprinus Lồi: Coprinus ephemeroides Hình 2.4 Coprinus ephemeroides (Nguồn: mykoweb.com) Đặc điểm chung Coprinus ephemeroides loài nấm mực Lồi chủ yếu tìm thấy mẩu phân, phân bón hữu cơ, vụn gỗ nằm vùi đất Mũ nấm nhỏ, đụng vào dễ bị nát, lúc non có hình cầu, sau xòe to cuối cuộn vào phía mũ nấm Đỉnh mũ nấm có màu nâu nhạt, xung quanh phủ dày đặc hạt màu trắng hạt chuyển sang màu nâu nhạt nấm già Giai đoạn đầu mũ nấm có màu trắng suốt, tiếp chuyển sang màu nâu nhạt cuối màu đen 2.4 Giới thiệu chủng vi sinh vật nghiên cứu 2.4.1 Streptococcus mutans – Vi khuẩn gây sâu [3], [6] Giới: Bacteria Ngành: Firmicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillales Họ: Streptococcaceae Chi: Streptococcus Loài: Streptococcus mutans 2.4.1.1 Đặc điểm hình thái Hình 2.5 Sreptococcus mutans (Nguồn: microbewiki.kenyon.edu) Streptococcus mutans giống cầu khuẩn gram dương, đường kính khoảng 0,6 - 0,8 μm, xếp liên tiếp với thành chuỗi, dài ngắn khác đứng với thành đơi đám Liên cầu khơng có lơng, khơng di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (+) số lồi có vỏ 2.4.1.2 Đặc điểm ni cấy Liên cầu, hiếu khí tùy tiện thường đòi hỏi mơi trường ni cấy có nhiều chất dinh dưỡng máu, huyết thanh, đường Vi khuẩn phát triển tốt điều kiện mơi trường có thêm 5-10 % CO Nhiệt độ ni cấy thích hợp 37 oC, số phát triển 10 - 40oC liên cầu đường ruột Trong môi trường lỏng (canh thang): Liên cầu dễ tạo thành chuỗi dài không bị gãy, sau tạo thành hạt nhỏ hạt lắng xuống đáy môi trường ni cấy Do sau 24 giờ, mơi trường trở nên có lắng cặn Trên mơi trường đặc: Liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khơ, màu xám Những chủng có vỏ khuẩn lạc lầy nhầy Trên môi trường thạch máu: Liên cầu phát triển tốt, làm tan máu hình thức α, β, γ tuỳ thuộc nhóm liên cầu 2.4.1.3 Đặc tính sinh hóa Streptococcus có enzym oxidase, catalase âm tính hơ hấp hiếu khí, kỵ khí tùy tiện.Vi khuẩn chuyển hóa loại carbohydrate khác tạo môi trường acid miệng 2.4.1.4 Sức đề kháng Nó phát triển mạnh nhiệt độ từ 18 – 40oC 2.4.1.5 Độc tố Streptolysin O: độc tố bị hoạt tính oxy nên mơi trường ni cấy, chúng gây tan máu phía sâu thạch Độc tố streptolysin O mang tính chất ngoại độc tố, có tính kháng ngun mạnh kích thích thể hình thành 10 kháng thể (anti streptolysin O) Việc định lượng kháng thể có giá trị chẩn đoán bệnh liên cầu đặc biệt bệnh thấp tim viêm cầu thận cấp Streptolysin S: đa số vi khuẩn Streptococcus thường tiết loại men này, men gây tan máu bề mặt môi trường ni cấy, có tính kháng ngun yếu khơng kích thích thể hình thành kháng thể 2.4.1.6 Khả gây bệnh Vi khuẩn phát triển miệng tạo môi trường acid Acid gây phá hủy men tạo vơi đóng bám thành lâu ngày làm phá hủy tủy dẫn tới sâu Đây nguyên nhân hàng đầu gây bệnh sâu toàn giới Ngoài vi khuẩn gây nhiễm trùng sinh vấn đề khác khả giao tiếp 2.4.2 Salmonella typhi [3], [6] Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gammaproteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Lồi: Salmonella typhi Hình 2.6 Salmonella (Nguồn: www.sciencephoto.com) 2.3.1.1 Đặc điểm hình thái Salmonella vi khuẩn Gram âm (khi nhuộm kỹ thuật Gram vi khuẩn bắt màu đỏ hồng), hình que, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 mm; hiếu khí kị khí tùy ý, có tiên mao, di động (trừ Salmonella gallinarum Salmonella pullorum), không tạo bào tử 2.3.1.2 Đặc điểm ni cấy Salmonella vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển môi trường nuôi cấy thơng thường Trên mơi trường thích hợp, vi khuẩn phát triển sau 24 Có thể mọc mơi trường có chất ức chế chọn lọc DCA (deoxycholate citrate 32 4.4 Kết phân lập định danh chủng nấm gây hại nuôi trồng nấm rơm a b Hình 4.5 Kết phân lập định danh nấm gây hại (a) Nấm Paecilomyces formosus (b) Nấm Lentinus squarrosulus Sau đồng mẫu, pha loãng cấy chuyền nhiều ngày ta có kết phân lập hai chủng nấm dại Paecilomyces formosus Lentinus squarrosulus hình 4.5 a b Hình 4.6 Kết phân lập định danh nấm Coprinus ephemeroides (a) Sau 48h nuôi cấy (b) Sau ngày nuôi cấy 33 Hình 4.6 cho thấy kết phân lập sau 48h sau ngày ni cấy có kết lồi nấm mực Coprinus ephemeroides sau pha lỗng mẫu cấy chuyền nhiều ngày 4.5 Kết khảo sát mức độ đối kháng nấm rơm với nấm sợi a b Hình 4.7 Mức độ đối kháng nấm rơm với nấm dại (a) Nấm Lentinus squarrosulus (b) Nấm Paecilomyces formosus Dựa vào hình 4.7.a cho thấy mức độ đối kháng nấm Lentinus squarrosulus với nấm rơm tương đương Tơ nấm rơm phát triển mọc lan ngang với tơ nấm sợi Lentinus squarrosulus Điều chưa chứng tỏ nấm Lentinus squarrosulus gây hại tới nấm rơm khả mặt cạnh tranh dinh dưỡng cao Việc nuôi trồng nầm rơm không đủ chất dinh dưỡng để nấm rơm kịp thời thu hoạch chất dinh dưỡng để chúng phát triển gây ảnh hưởng lớn đến suất thời vụ thu hoạch Vấn đề gây hại tới nấm rơm chưa nhiều xuất chủng lồi khác so với lồi nấm rơm ban đầu gây nhiều hậu sau, vấn đề cung cấp dinh dưỡng thường xuyên khó lây nhiễm lồi nấm khác khiến cho chất lượng ban đầu nấm rơm bị giảm sút, dễ dẫn đến tình trạng ngộ độc nấm chưa xác định thành phần hóa học hay độc tố tiết chủng nấm dại lại 34 Ở hình 4.7.b khơng thấy phát triển nấm rơm Paecilomyces formosus gây chết nấm rơm hoàn toàn Nguyên nhân cho tượng Paecilomyces formosus cho loài nấm ký sinh sinh vật khác – vật chủ, việc sống chung phát triển với loài nấm yếu dễ dàng gây chết loại nấm đồng thời hút cạn chất dinh dưỡng cung cấp cho loài nấm bị ký sinh Một khả khác giải thích tượng Paecilomyces formosus có khả tiết loại kháng sinh enzyme đặc hiệu kháng lại phát triển tơ nấm rơm Điều khiến nấm rơm phát triển điều kiện sinh trưởng phát triển Qua thí nghiệm khảo sát mức độ đối kháng kết luận nấm rơm dễ bị cạnh tranh ngừng phát triển điều kiện tối ưu có diện loài nấm dại khác Cần để biện pháp hiệu để loại bỏ thành phần gây hại giúp việc nuôi trồng nấm rơm hiệu 4.6 Kết khảo sát mức độ đối kháng nấm rơm với nấm thể Hình 4.8 Mức độ đối kháng nấm rơm với nấm Coprinus ephemeroides Dựa vào hình 4.8 cho thấy mức độ đối kháng nấm Coprinus ephemeroides (nấm mực) lấn át so với phát triển nấm rơm Cơ chế đối kháng hai lồi có khả cạnh tranh dinh dưỡng mật độ cao tơ nấm rơm phát triển ngược lại nấm Coprinus ephemeroides lại cho vùng lan tơ mạnh mẽ Sự 35 cạnh tranh dinh dưỡng nấm rơm thấp phát triển yếu sau – ngày quan sát Qua thực nghiệm khảo sát nói nhu cầu dinh dưỡng nấm Coprinus ephemeroides cao hấp thụ chất dinh dưỡng nhanh so với nấm rơm, điều có khả dẫn đến việc nấm rơm phát triển yếu cho số lượng nấm tới mùa thu hoạch 4.7 Kết khảo sát khả kháng nấm gây hại dịch chiết cỏ mực nuôi trồng nấm rơm Bảng 4.7 Kết khảo sát hoạt tính kháng nấm dịch chiết cỏ mực Số lần lặp lại Đường kính vòng vơ khuẩn (mm) 12,56 12,7 12,64 6,12 6,23 6,05 6,24 7,15 6,32 6,12 6,14 6,16 11,67 11,78 11,84 6,1 6,13 6,16 Loại nấm Paecilomyces formosus Đối chứng Lentinus squarrosulus Đối chứng Coprinus ephemeroides Đối chứng Đường kính trung bình (mm) 12,63a ± 0.07 6,13b ± 0,09 6,57b ± 0,05 6,13b ± 0,01 11,76c ± 0,08 6,13b ± 0,03 36 Ghi chú: X ± D: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Các ký tự cột khác biểu thị khác mặt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) a a ĐC ĐC Hình 4.9 Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm dịch chiết cỏ mực Paecilomyces formosus (trái) Lentinus squarrosulus (phải) sau 24h nuôi cấy (ĐC): Nước cất (a): Dịch chiết cỏ mực a ĐC Hình 4.10 Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm dịch chiết cỏ mực Coprinus ephemeroides sau 24h nuôi cấy (ĐC): Nước cất(a): Dịch chiết cỏ mực 37 Bảng 4.8 Đánh giá mức độ kháng nấm dịch chiết cỏ mực Đánh giá mức độ kháng nấm Loại nấm Paecilomyces formosus Đối chứng (nước cất) - Lentinus squarrosulus - - Coprinus ephemeroides - + Dịch chiết cỏ mực + Ghi chú: Khả kháng khuẩn khơng có khả kháng khuẩn (-) Khả kháng khuẩn trung bình (+) Khả kháng khuẩn tốt (++) Dựa vào bảng 4.7 dịch chiết cỏ mực kháng hai loài nấm dại Paecilomyces formosus Coprinus ephemeroides mức độ trung bình Nấm Paecilomyces formosus cho đường kính vòng kháng nấm lớn (12,63 ± 0.07 mm) sau lồi Coprinus ephemeroides (11,76 ± 0,08 mm) Hình 4.9 cho thấy dịch chiết cỏ mực khơng có hoạt tính kháng lại nấm Lentinus squarrosulus số liệu đường kính vòng vơ khuẩn lồi gần tương đương với số liệu mẫu đối chứng (6,57 ± 0,05 mm) 38 4.8 Kết khảo sát khả kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực Bảng 4.9 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực Số lần lặp lại Đường kính Đường kính Loại vi khuẩn vòng vơ khuẩn trung bình (mm) (mm) 9,85 Samolnella 10,3 10,07a ± 0,31 Đối chứng Streptococcus mutans Đối chứng 10,48 6,25 6,16 6,28 11,74 10,25 11,31 6,38 6,42 6,34 6,2 ± 0,06 11,49b ± 0,35 6,4 ± 0,03 Ghi chú: X ± D: giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn Các ký tự cột khác biểu thị khác mặt ý nghĩa thống kê (p < 0,05) 39 ĐC b a Hình 4.11 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực Salmonella typhi sau 24h nuôi cấy (ĐC): Nước cất Đ C (a), (b): Dịch chiết cỏ mực a Hình 4.12 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực Streptococcus mutans sau 24h nuôi cấy (ĐC): Nước cất (a): Dịch chiết cỏ mực 40 Bảng 4.10 Đánh giá mức độ kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực Đánh giá mức độ kháng khuẩn Loại vi khuẩn Samolnella Streptococcus mutans Đối chứng (nước cất) - Dịch chiết cỏ mực - + + Ghi chú: Khả kháng khuẩn khơng có khả kháng khuẩn (-) Khả kháng khuẩn trung bình (+) Khả kháng khuẩn tốt (++) Bảng 4.9 thấy rõ dịch chiết cỏ mực cho hoạt tính kháng khuẩn Salmonella typhi (10,07 ± 0,31 mm) thấp vi khuẩn Streptococcus mutans (11,49 ± 0,35 mm) Hai loài vi khuẩn cho kết kháng khuẩn mức độ trung bình Trong cơng dụng lồi cỏ mực đề cập đến vấn đề trị bệnh chảy máu răng, lợi, sưng nướu,… điều phần cho thấy dịch chiết có khả có thành phần kháng vi khuẩn gây sâu flour, acid yếu, hydro peroxide muối kim loại 41 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Dịch chiết từ Cỏ mực tạo tốt điều kiện sau: - Chiết dung môi: nước cất - Tỉ lệ mẫu/dung môi: 1:20 - Thời gian tạo dịch chiết tốt nhất: 60 phút - Nhiệt độ chiết tốt nhất: 60oC Sau đem phân lập định danh ta thu chủng nấm dại sau: nấm Paecilomyces formosus, Lentinus squarrosulus Coprinus ephemeroides Ở điều kiện môi trường, nhiệt độ, nồng độ mức độ đối kháng nấm rơm nấm dại cho kết khác Nấm dại Paecilomyces formosus làm chết nấm rơm ngăn cản không cho nấm rơm phát triển Đối với nấm dại Lentinus squarrosulus không gây hại nhiều tình trạng cạnh tranh dinh dưỡng có khả cao Cuối nấm mực Coprinus ephemeroides mức độ đối kháng cao tơ nấm mọc lan lấn át phát triển tơ nấm rơm Khả kháng khuẩn Salmonella typhi (10,07 ± 0,31 mm) dịch chiết từ cỏ mực mức độ thấp Còn vi khuẩn gây sâu Streptococcus mutans (11,49 ± 0,35 mm) cho mức độ kháng khuẩn mức độ trung bình Khả kháng loài nấm dại Paecilomyces formosus (12,63 ± 0.07 mm), Coprinus ephemeroides (11,76 ± 0,08 mm) gây hại nuôi trồng nấm rơm từ dịch chiết cỏ mực mức trung bình Trong mức độ kháng nấm Paecilomyces formus mức cao Dịch chiết cỏ mực khả kháng nấm Lentinus squarrosulus (6,57 ± 0,05 mm) 42 5.2 Kiến nghị Vì thời hạn thực đề tài khóa luận có giới hạn nên em xin kiến nghị nghiên cứu thêm số đề tài khác như: - Khảo sát khả kháng khuẩn sâu Streptococcus mutans cao chiết chiết dung môi hữu từ dịch chiết cỏ mực - Tìm loại có khả kháng nấm dại Lentinus squarrosulus khảo sát nồng độ khác cao chiết từ cỏ mực có khả kháng loại nấm - Xác định nồng độ tối thiểu để dịch chiết từ cỏ mực kháng lại lồi nấm gây bệnh, nấm gây hại nói chung nuôi trồng nấm rơm - Xác định chế kháng nấm dại từ dịch chiết cỏ mực 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thanh Bảo, 2013, Vi khuẩn học, Nhà xuất Y dược Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh – Khoa Y - Bộ môn Vi sinh Huỳnh Kim Diệu, Lê Thị Loan Em (2011), “Đánh giá đặc tính chủng hoạt tính kháng khuẩn cỏ mực (Eclipta prostrata) diệp hạ châu thân xanh (Phyllanthus niruru) Đồng Sông Cửu Long”, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 19a, tr 149-155 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến, 2010, Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam Lê Huy Chính, 2007, Vi sinh vật học, NXB Y học Hà Nội Trần Hoàng Hải (2015), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn cao methanol cao phân đoạn ly trích từ thân cỏ mực (Eclipta alba)”, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng, 2002, Vi sinh vật học công nghiệp Tập 2, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Đái Thị Xuân Trang, Võ Thị Tú Anh (2015), “Khảo sốt hoạt tính kháng oxy hóa kháng vi khuẩn Enterobacter cloacae cao chiết từ Cỏ mực (Eclipta alba Hassk.)”, Tạp chí khoa học phát triển công nghệ, tr 76-83 Đái Thị Xuân Trang, Võ Thị Tú Anh (2015), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết cỏ mực (Eclipta alba) vi khuẩn phân lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon)”, Tạp chí sinh học, tr 261-266 44 TÀI LIỆU TIẾNG ANH F.E.O.Ikediugwu, J.Webster (1970), “Antagonism between Coprinus heptemerus and other coprophilous fungi”, Transactions of the British Mycological Society, Volume 54, pp 181-204 10 Harris, C.A., M.J Renfrew, and M.W Woolridge (2001), “Assessing the risk of pesticide residues to consumers: recent and future developments”, Food Additives and Contamination, pp 1124-1129 11 Hawksworth, D.L (1991), “The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance, and conservation”, Mycol Res., 95, pp 641-655 12 James B Gloer (1995), “The chemistry of fungal antagonism and defense”, Can J Bot., Vol 73 (Suppl I), pp 1265-1274 13 Jehan Bakht, Amjad Islam, Mohammad Shafi (2011),”Antimicrobial potential of Eclipta alba by well diffusion method”, Medicinal Plants: Conservation & Sustainable use, pp 169–174 14 Karunambigai, A., Gayathri Devi (2014), “Antibacterial activity of leaves and root of Eclipta alba”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Vol 6, pp 454-456 15 Liliana Scorzoni, Ana C A de Paula e Silva (2017), “Antifungal Therapy: New Advances in the Understanding and Treatment of Mycosis”, Frontiers in Microbiology, 8, pp 36 16 Odey MO, Iwara IA, Udiba UU, Johnson JT, Inekwe UV, Asenye ME, Victor O (2012), “Preparation of Plant Extracts from Indigenous Medicinal Plants”, 1(12), pp 688-692 17 Paola Díaz Dellavalle1, Andrea Cabrera1, Diego Alem1, Patricia Larraga1, Fernando Ferreira2, and Marco Dalla Rizza (2011), Antifungal activity of medicinal 45 plant extracts against phytopathogenic fungus Alternaria SPP, Chilean journal of agricultural research, pp 231-239 18 Russell E Lewis, PharmD (2011), “Current concepts in antifungal pharmacology”, Mayo Clinic Proceedings, pp 805-817 19 Saqib Bilal, Liaqat Ali, Abdul Latif Khan, Raheem Shahzad, Sajjad Asaf, Muhammad Imran (2018), “Endophytic fungus Paecilomyces formosus LHL10 produces sester-terpenoid YW3548 and cyclic peptide that inhibit urease and αglucosidase enzyme activities”, Archives of Microbiology, pp 1493–1502 20 Turner, W.B., and Aldridge, D.C (1983), Fungal metabolites 11, Academic Press, New York, 48 21 Wicklow, D T (1981), “Interference competition and the organization of fungal communities”, The fungal community, pp 351-375 TÀI LIỆU INTERNET 22 Eclipta prostrata, 16/11/2018 https://www.cabi.org/isc/datasheet/20395 23 Grosch R, Scherwinski K, Lottmann J, Berg G, Fungal antagonists of the plant pathogen Rhizoctonia solani: selection, control efficacy and influence on the indigenous microbial community, 27/11/2018 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17127047 24 Cỏ mực – Eclipta alba, 2018 http://www.imexpharm.com/dong-duoc/co-muc-eclipta-alba-hassk/ 25 Sanjoy Kumar Bhunia, Biswajit Dey, Structural characterization of an immunoenhancing heteroglycan isolated from an aqueous extract of an edible mushroom, Lentinus squarrosulus (Mont.) Singer, 2018 46 https://www.semanticscholar.org/paper/Lentinus-squarrosulus 26 Coprinus ephemeroides, 2018 https://grzyby.pl/coprinus-site-Kees-Uljee/species/ephemero.htm 27 Sakag., May Inoue & Tada ex Houbraken & Samson, Paecilomyces formosus, 2009 https://elurikkus.ee/biehub/species/Paecilomyces formosus 28 (DC.) G.Moreno, Coprinopsis ephemeroides, 2018 https://en.wikipedia.org/wiki/Coprinopsis_ephemeroides 29 Mont., Lentinus squarrosulus, 2018 https://en.wikipedia.org/wiki/Lentinus ... khảo sát khả kháng khuẩn, kháng nấm dại gây hại từ hợp chất sinh học tách từ cỏ mực nuôi trồng nấm rơm 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Trong đề tài mục tiêu khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm hợp chất. .. hóa học có dịch chiết cỏ mực - Phân lập, định danh loài nấm dại gây hại tới ni trồng nấm rơm - Thí nghiệm chế đối kháng nấm rơm với loài nấm thể nấm sợi - Đánh giá khả kháng khuẩn Salmonella, kháng. .. khuẩn nấm bệnh Đây sở để chọn loại thực đề tài kháng nấm kháng khuẩn nuôi trồng nấm rơm 26 4.3 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố tới dịch chiết cỏ mực Thí nghiệm 1: Khảo sát dung mơi thích hợp dành cho cỏ