BÔ GIÁO DUC & ĐAO TAO TRƯ Ờ N G ĐAI HOC BÒ Dược HÀ rẾ NỘI Nguvển Xuân Trường S BỘ NGHIÊN c ír THÀNH PHẦN CHẤT ĐỘC VÀ PHƯƠNG PHÁP GIÁM ĐỊNH ĐỘC CHẤT CỦA Câ Y c ủ NẦN (D ioscorea hispida Dennst., D ioscoreaceae) VIỆT NAM LUẬN VÁN TỐT NGHIỆP THẠC SỶ Dược HỌC Chuvên ngành: Kiếm niĩhíệm dược phììm - Độc chất học Mã sô': 03.02.05 Nsưới hướns dẫn khoa học: / PGS.TS Trần Tử An PGS.TS Hoàng M ạnh Hùng cú Ha nui- 2i)0l JÍỜ3^ ịiờ U L ƠQÍ Luận văn hồn thành với giúp đỡ nhiệt tình của: PGS.TS Trần Tử An, PGS.TS Hoàng Mạnh H ùng ch ỉ bảo tận tình trực tiếp giúp đỡ tòi hồn thành mục tiêu đề tài PGS.TS M Tất Tô' cán bộ, kỹ thuật viên mòn Dược lý trường đại học Dược H nội giúp đỡ xác định LD50 mẫu chất độc D SC K II Lè Đình Bích giúp đỡ ừong việc-iũrn mẫu v« nghiên cứu hình thái PGS.TS H H uy Kế, TS Nguyễn Văn Thuần, đóng góp nhiều ý kiến ùinh chuẩn bị luận án, chiết xuất hoạt chất Cán chiến sĩ phòng Hốy phòng Pháp y sinh vật, phòng ảnh thuộc viện Khoa Học Hình Sự giúp đỡ tơi q trình thử độc tính thỏy sơ chuột chụp ảnh kết Ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học trường đại học Dược Hà nội; ban lãnh đạo Viện, lãnh đạo phòng Hố thuộc viện Khoa Học Hình Sự dã tạo diếu kiện thuận lợi cho tói trinh thực bảo vệ luận văn Nhân dịp này, xin chán thành cám ơn giúp đỡ quựbáu ỉ DS Nguyễn Xuán Trường M Ụ C LỤC Lòi cảm Qfn Trane Ký hiệu chữ viết tắt Đặt vấn đề C hương 1: Tổng quan 1.1 Vài nét củ nần 1.2 Tinh hình nghiên cứu thành phần hố học độc tính Dioscorea hispida Dennst.,Dioscoreaceae 14 1.3 Phưotig pháp chung phân tích độc chất 18 ChưoTig : Điều kiện phương pháp thực nghiệm 22 2.1 Xử lý m ẫu 22 2.2 Dụng cụ hoá chất 22 2.3 Phương pháp sàng lọc chất độc 23 2.4 Các điều kiện xác định chất độc 25 C hương : Kết bàn luận 28 3.1 K ết sàng lọc chất độc 28 3.2 Xây dựng qui trình chiết xuất 29 3.3 Về thành phần chất độc 33 3.4 Về tác dụng sinh học độc tính 43 ChưoTig : Kết luận đề xuất 50 4.1 Kết luận 50 4.2 Đề xuất 52 Tài liêu tham kháo 53 Phụ lục 56 + Phụ lục 1: Hình thái thực vật câv cú nần 56 + Phụ lục 2: sắc ký đồ, phổ UV-VTS ER 58 CÁC KÝ H IỆ U VÀ C H Ữ V IẾ T T Ắ T ^0 ; Alcaloid dịch chiết một, cho vết lớn Rf=8,0/12 sắc ký lớp mỏng chiều A* Alcaloid tách từ A q DBM Diamon Back Motíi (tên m ột loại ấu ừùng) DCAX dịch chiết dung môi môi UTTỜng acid DCl dịch chiết alcaloid toàn phần (thu sau tiến hành theo qui U'inh) DCC dịch chiết cồn (dịch cồn thu ngâm mẫu) DCX dịch chiết bàng dung môi môi tmờng kiềm DDA dung dịch pha từ 2g D Cl với nước acid HCl tíiành lOg DM dung mơi metanol 95® ĐẶT VẤN ĐỂ Nước ta nằm vùng khí hậu nhiệt đới, nên có thảm thực vật đa dạng phong phú Nó đã, trực tiếp gián tiếp góp phần giải nhu cầu đời sống người ăn mặc, ở, thuốc chữa bệnh Từ lâu với việc tìm hiểu sử dụng mặt có lợi cỏ, người ta quan tâm đến mặt trái nó, tác hại độc sức khoẻ người gia súc Lĩnh vực nghiên cứu độc liên quan rộng rãi đến nhiều ngành khoa học, kinh tế, đặc biệt liên quan chặt chẽ với tư pháp y pháp việc giám định vụ ngộ độc đầu độc cỏ Trong hai mươi năm qua viện Kiioa Học Hlnh Sự - Cơng An năm giám định trung bình khoảng mười lăm vụ án liên quan đến cỏ độc ;i4][19] Qua nghiên cứu vụ ngộ độc chưa rõ ngun nhân, chúng tơi thấy có nhiều khả liên quan đến củ nần Việt nam Cây củ nần có độc tính cao, phân bố rộng rãi hầu hết tỉnh miền nam, miền trang số tỉnh phía bắc, với trữ lượng lớn [18] nhàn dân ta dùng làm lương ứiực, làm thuốc chữa bệnh thuốc độc số trường hợp [1],[7],[15],[23],[29], nên khả gây ngộ độc cao Tuy việc xác định nguyên nhân gây ngộ độc khó khăn độc tính cao, lượna gày ngộ độ'c nhỏ nước ta chưa có cơna trình nghiên cứu độc únh củ nần [9] Chính đặt vấn đề xác định sơ bỏ số tứứi chất chất độc có củ nần Việt nam nhằm phục vụ cho công tác giám định tư pháp Để thực mục tiêu iuận văn có nội dung chính: - Tim phưcmg pháp chiết xuất tách chất độc từ cú nần - Xác định số tứih chấi chất độc, - Sơ đánh giá khả năne giám định tư pháp thông qua thực nghiệm thỏ CHƯƠNG : TỔNG QUAN 1.1 VÀ I N É T VỂ CÂY CỦ NẦN 1.1.1 Đặc điểm củ nần Tên khoa học: Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae Tên khác: củ nê, củ nâu trắng, dây nần, Idioai từ nhám, dây tên [I],m Tên đồng nghĩa: [lj,[7] D dacmaora Dox D hirsrita Dennstedt D mollissima Blume D ùiphylla L Hình thái thực vật Cây leo dài tới hàng chục mét thân quấn trái có cạnh nơng, đường kính thân thường mm, đoạn gốc đạt tới 12 mm [1], có nhiều gai nhọn, màu xanh hay màu rơm [231 Ban đầu thân non phủ lớp lông mềm Lá mọc so le, loại kép gồm ba chét, chét hình bầu dục, cân đối dài 16-25 cm rộng 12-17 cm, có năm gân lồi mặt dưới, đầu nhọn lớn hưn chét bên Hai chét bên khơng cân đối thường lệch phía ngồi ỉ/3 ỉá có ba gân pnía ngồi gân nửa trong, kích thước dài 16-21 cm rõrm 11-13 cm Hai mặt đươc phú ỉớp lông tơ màu vàng, mịn, ỉá tuvên cuốn«: dài 10-20 em, có ỉơnu- có gai khơng (Hinh 1-1 ừang ĩ) , Rễ củ phàn nhánh, cú hình cáu Rhiều thuỳ dài, nặng tới 35 kg ĩhậm chí [231 v ỏ củ màu nàu rơm nâu sáng, thịt củ rấl mịn, màu ĩrắn^ hay màu chanh nhạt [1 j \1\ |2 | (Hình ỉ -8 PL 1-9 PL, 1-10 PL phần phu iuc Hoa đực mọc thành bơng lóìi, dài tới 50cm, hoa xếp dàv đặc trục, đầu trục có hoa; bơng ngắn mang khoảng bốn mươi hoa, trục hoa phủ lông vàng mịn Lá bắc nhỏ (0,3 X 0,4 mm); ba cánh hoa hình tròn, m ặt ngồi có lơng mịn kích ứiước Im m , ba đài to hơn, đỉnh nhọn hơn, có lơng lưng m ột đường nhỏ giữa; sáu nhị, nhị ngắn ngắn bao hoa phấn, nhị hướng lên phía trên, bao phấn chỗi ra, hai nứt dọc, hướng [1], [23] Cụm hoa cái: cong, buông thõng xuống, phủ dày lơng vàng mịn Quả nang quạt lại có cánh, cuống dài mm, cánh rộng mm phía 16 mm phía ưên điểm quả, cuối thắt lại th 'n h đỉnh tù nhọn, dài 55 mm, theo giá noãn Hạt to, dài 10 mm, rộng mm cánh lớn, màu nâu vàng, hướng gốc nang (Hình 1-2) Hình 1-1: ảnh cúa cú nần (Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae j ứ Việt nam /Ị nun 11' Hình 1-2; Hình thái thực vật cày cú nần Dioscorea hispida Dennst.,Dioscoreaceae Việt nam l Cành mang quả; Quả hạt; 3-4 Một phần cum hoa đực; 5a Hoa đực nhìn từ xuống; 5b Hoa đực nhìn từ iên Vi phẫu thàn sơ đồ cấu tạo tiình bày hình 1-3 hình í -4 Ị _ i ê ’u b ì ■2 Mô mềm vỏ Nội bì Vỏ trụ hố mơ cứng ^6 Gỗị -7 Mơ mềm ruột Hình 1-3: Sơ đồ cấu tạo thân củ nần (Dioscorea hispida Dennst.,Dioscoreaceae) Việt nam Hình 1- 4: Anh vi phẫu thán cãv cú nần (Dioscorea hispida Dennst., Dioscoreaceae) o '/ịệt nam 10 Vi phẫu sơ đồ cấu tạo cuống lá, gân uinh bày hình 1-5,16 Hình 1-7 ị ể Ệ ầ = u l H Hình 1-5: Phần cãt ngang gân Biểu bì; Mơ mềm; Mơ cứng; Libe; Gỗ Hình 1-6: Cấu tạo cuống Biểu bì; Mơ mềm vỏ; Mô cứng; Gỗ; Libe; ố Mô mềm m ột H ình 1-7: Anh vi phẫu củ nần íDioscorea hispida Dennst Dioscoreaccae 1ớ Việt nam TRUONGO 2.671, No A b s Peak Pick W a v e l e n g t h (nm.) 382.00 280.50 2 5.00 Abs0.0 0.05 2.2 1.303 4^ oo Ị I J 300.0 W a v e l e n g t h (nm.) -0.066 200 I '),eat t-d ; i b : O b ■i c a x i Speed: 0.r;/23/01 t'dSt; clchiet p h u t a n g the (1 , k g u o n g 2ml ale t I 400.0 Dat a : O r i g i n a l S l i t W i d t h : 5.0 Ilin h -12: phổ hấp thụ ƯV-VIS dịch chiểl iCr thỏ thử 49 Tóm lại: Phổ hấp thụ tử ngoại sắc ký lớp mỏng , sắc ký khí dịch chiết phủ tạng thỏ cho kết giống giống với chất so sánh Như áp dụng qui trình chiết đề xuất chúng tơi tìm lại chất độc ưong phủ tạng tíiỏ bị chết ngộ độc củ nần Dựa vào qui trình chiết xuất m ột số tính chất chất độc, phổ UV-VIS, sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí, ta giải vụ án hình liên quan đến ngộ độc củ nần 50 CHƯƠNG ; KẾT LUẬiN VÀ ĐỂ XUẤT 4.L KẾT LUẬN Sau tíiời gian nghiên cứu tiến hành thực nghiệm khảo sát tíiu kết phưcỉng pháp chiết xuất, xác định tính chất chất độc khả giám định ngộ độc củ nần Việt nam, chúng tơi có số kết luận sau: Chất độc củ nần Củ nần nhân dân ta dùng làm lương thực, tíiuốc chữa bệnh Ngồi củ nần chứa chất độc dùng vào mục đích khác Dùng phương pháp sàng lọc theo nhóm chất độc, chúng tơi ứiu kết nghiên cứu củ nần nước ta sau: • Trong củ nần khơng có chất độc sinh hydrocvanid (cyanogens) • Dùng phưcíng pháp phân lập hai mơi trường etíier, Clorotbrm thử độc tính chuột nhắt trắng thu kết quả: + Khơng có chất độc mang tính acid Dịch chiết ether-acid khồng gâv nhiễm độc cho chuột nhắt + iấ t độc củ nần hỗn hợp Alcaloid Thành phần LD50 chất độc Trên sở kết sàng lọc, chúng tơi đề xuất qui trình chiẽt xuất chấL độc xác định sơ thành phần chất độc Dịch chiết Cloroform-kiềm dùng để phân tích • Dùng phương pháp Behrens - Karber thử LD50 dịch chiét tồn phần chuột trắng trọng íượng Irung bình 20g cho LD50 (DCl í = 53.9 (47,5 60,3) mg/kg cân nặng, với p = 0,05 Tương ứng với l i,2sam dược liệu khò xứ Iv cách phơi nắnu sấv cho kg càn nặnH- 51 • Dùng kv thuật sắc kv iớp mỏng, sắc ký khí, Quans phổ hấp thụ ƯVVIS cho thấy dịch chiết CloroíbiTn-kiềm chứa nhiều alcaloid, tối thiểu 13 chất Trong có alcaloid chính, chúng tơi gọi A* Nó có số tính chất: - Phổ UV-VIS có cực đại hấp ứiụ bước sóng 224 nm dung môi Metanol ba môi tiTTỜng Hình dáng vị í cựu đại phổ D Cl A* tưcfng tự - Sắc ký mỏng với hệ dung môi Qoroform - Metanol - Amoniac (90:10:1) CĨ.RRÍ' so với codein 0,93 " A* có phổ hồng ngoại với đỉnh đặc trưng ơ-lacton có nối đơi vị trí a,P ; kết hợp vói phổ UV-VIS cho ứiấy chất A* có chứa nhóm cấu trúc với Nitơ bậc Kết phân tích cấu trúc cho thấy A* có vài nhóm cấu trúc tương ứng với cấu trúc Dioscorin Về khả giám định độc chất Kết sơ thu lchi thử thỏ cho thấy: • Đã đề xuất qui tiình chiết thích hợp để chiết aicaloid từ phủ tạng thỏ bị ngộ độc củ nần • Các tính chất dịch chiết từ phủ tạng thỏ như: sấc ký lớp mỏng, sắc ký khí, quang phổ hấp thụ UV-VIS giống chất lấy từ củ nần Điều cho thấy dùng chất A* làm chuấn cho việc giám định ngộ độc củ nần • Củ nần gây ngộ độc cấp tính với triệu chứng: run khó thở, sợ kích thích (tiếns động, súc giác), co giật chết Đặc điếm giải nhẫu sau bị ngộ độc: phổi nhợt nhạt có ưiột vài đám xuim huvết gan tím bầm Kết nàv gợi ý cho sử dụng việc giám định độc chất 52 4.2 ĐỂ XUẤT Để áp dụng vào thực hành giám định độc chất trons ngộ độc cú nần, xin đề xuất vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu: 1- Nghiên cứu xác định cấu ưức tính chất alcaloid củ nần - Liệu chất A* tl'ong kết tách chiết phải chất tinh khiết hố học hỗn hợp vài hcfp chất liệu có phải Dioscorin khơng ? Trên sở điều chế chất chuẩn dùng giám định ngộ độc củ nần 2- Nghiên cứu súc vật thí nghiêm phân bố chất độc củ nần phủ tạng, chuyển hoá phân h''ỷ Kết nghiên cứu giúp xác định chắn điều kiện giám định độc chất ù-ong ngộ độc củ nần Việc nghiên cứu tiếp ứieo thành phần khác củ nần để so sánh với cơng tiình cơng bố điều lý tíiú nhằm tìm khác giống củ nần mơi trường địa lý khác nhau, để đóng góp, bổ sung ứiêm vào lĩnh vực nghiên cứu này, tìm chất có ích lợi ngành Dược Khoa học hình 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tỉếniĩ viét la Lê Đình Bích, Nguvễn Minh Khỏi, Nauyễn Hoàng (1998), X c loài có thàn rễ thuộc chi củ nàu (Dioscorea L.) Việt N am ”, tóm tắt cơng trình nghiên cíai khoa học cơìVị lỉiịliệ Dược, trường đại học Dược Hà nội 1/1999, trang 208 Ib Lè Đinh Bích, Nguyễn Minh Khởi, Nguyễn Hoàng (1998), ’Đ iều tra phát lồi thuộc chi Dioscorea L Mộc Châu”, róm tắt cơng trình n^hièn cứu khoa học cơng nqhệ Dược, trườn2 đại học Dược Hà nội 1/1999, trang 273 Bộ môn dược liệu trường Đại học dược Hà Nội (1998), hùi gidng dược liệu, tập II trang 5-18 Bộ mơn phàn tích độc chất trườnạ Đại học dược Hà Nội (1984), Bài •^iíiiv^ kiếm nghiệm dộc chất, nhà xuất bán V học, trans; 67-81 157 - 165 Bộ mòn phàn tích - độc chất (1997), Độc chất học\ trườns ĐH Dược HN, trang 60-63 97-101 Bộ mơn phân tích (1997), Cck' phương pháp kiểm n^ìiiệm ỉlìiiỏc dộc chất, tài liệu sau đại học, trườns ĐH Dược HN trans 14-15 Bộ môn thực vật trườniĩ Đại học dược Hà Nội (1997), Thực vật dược, nhà xuất bán y hoc traníi 116 Võ Văn Chi ( 1997) Từ diên cdv ĩhuoc Vịệí Nam, nhà xuál ban y học tranii 329 - 320 Vũ Vãn Chuvên (1991), Bùi ĩlìực vật lìọc nhà xuất ban y học Nmiyẻn Xuàn Cườnii, Nizuven Văn Đàn í ỉ 987) "Niihién cứu thành phân hoá học trons Dioscíìreaceae” Tap chi ílưor lìO( so l núm Ì9H7, traniz 16-17 54 10 Niiuvễn Văn Đàn Nuuyẻn Viết Ttai (1985), pháp Ìigìììên ■:ứit lì học cà\' ỉliiíoc, nhà XLiấí bán V hục traiìii - 18 - 11 Nauvễn H oàns Lẻ Đinh Bích (1986) "Diosgenin số ỉồi Dioscorea L Việt Nam", Cơfìĩ> ninh iv^lĩiên cíni khoa học V dược, truùniỉ ĐH Dược HN, trang 270 - 271 12 Nguvễn Hồng cộns (1978) Diosgeniìi nấn gừng, nâu trắng vù rỳ giải, Kỷ yếu cơng trình nghiên cứu khoa học Đại học dược 13 Phạnn H ồns Hộ (1972), Cây miềìĩ nam Việr Nam, tập hai, trang 612 14 Hồníi Mạnh Hùna (1991), Níiộ dộc ĩhcio mộc ĩrong lĩnìi vực hình Việt Nam, }s e ỉ díị V i e t n a m 35 W.Tanii G.Eiscnbrand (1992) Cỉìnicse Dric^s of' P l a n t -4 ! vol H' 56 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình thái thực vật củ nần Hình 1-