T> T 'T t O Pr r v Ằ A T A o ŨỤ uo iTnÁ u lỹỤv^ Oc £/A w ir \v j P Ô J-J VX Ti lPj TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ược HÀ NỘI • • • • PHẠM THỊ• HẠNH • • NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 119.112 LUẬN VĂN THẠC sĩ • • CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ Dược HỌC • • Dược PHẨM VÀ BÀO CHẾ MÃ SỐ : 60.73.01 Ngườỉ hướng dẫn khoa học : PGS.TS Cao Văn Thu Ị TRƯỜNG ĐM DƯỢC HÀ NỘI Ị T H Ư V I ỆIM ^ í N g ày Ih ố n g n ă iT i SỐĐKCB: _ _ ,^ HÀ NỘI 2010 Ị ị LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo PGS TS Cao Văn Thu, người trực tiếp hướng dẫn ân cần bảo giúp đỡ em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo, cán kĩ thuật viên môn Vi sinh Sinh học, môn Công nghiệp dược trường Đại Học Dược Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ em trình thực luận văn Em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè quan tâm động viên em suốt thời gian qua Do thời gian có hạn, nên luận văn không tránh khỏi thiếu sót Rất mong bảo thầy góp ỷ bạn Em xin chân thành cảm om / Hà Nội ngày 29 tháng 10 năm 2010 Học viên Phạm Thị Hạnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ề CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 1.1 Đại cương xạ khuẩn 1.1.1 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.2 Phân loại Streptomyces 1.1.3 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 1.2 Cải tạo giống vi sinh v ậ t 1.3 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4 Chiết tách tinh chế 1.4.1 Chiết xuất 1.4.2 Tinh c h ế 10 1.5 Phổ hồng ngoại, phổ khối lượng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 12 1.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 12 1.5.2 Phổ khối lượng (M S) 12 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NM R) 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 15 2.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.1 Giống xạ khuẩn 15 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định 15 2.1.3 Môi trường nuôi cấ y 16 2.1.4 Dụng cụ hoá chất 19 2.2 Phương pháp nghiên u 21 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy giữ giống ống thạch nghiêng 21 2.2.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh phương pháp khuếch tán .21 2.2.3 Phương pháp cải tạo chọn giống .22 2.2.4 Phương pháp lên men chìm đánh giá hoạt tính kháng sinh dịch lọc dịch lên m en 24 2.2.5 Các phương pháp chiết tách kháng sinh 25 2.2.6 Phương pháp phân loại xạ khuẩn theo ISP 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM 29 3.1 Nâng cao khả sinh tổng họp kháng sinh Streptomyces 119.112.7 I 29 3.1.1 Kết sinh tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 119.112 môi trường khác nhau: 29 3.1.2 Kết cải tạo giống 30 3.1.3 Kết lên men chìm: 38 3.1.4 Bước đầu khảo sát thành phần môi trường lên men 40 3.2 Kết chiết tách tinh chế kháng sinh 42 3.2.1 Kết chiết kháng sinh dung môi hữu pH khác nhau: 42 3.2.2 Kết tách kháng sinh dịch chiết sắc ký lóp mỏng: 44 3.2.3 Kết chạy sắc ký cột: 45 3.3 Kết phổ hồng ngoại, phổ khối lượng phổ cộng hưởng từ hạt nhân 51 3.3.1 Kết đo phổ hồng ngoại (IR ) 51 3.3.2 Phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân 52 3.4 Phân loại Streptomyces 119.112 theo IS P 57 CHƯƠNG 4: BÀN LU Ậ N .59 4.1 Nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 119.112 .7 59 4.2 Nghiên cứu số tính chất thành phần kháng sinh Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp 59 4.3 Phân loại Streptomyces 119.112 theo IS P 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH Ị 61 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIÉT TẮT ADN Axit deoxyribonucleic Z) Đường kính trung bình vòng vơ khuẩn ISP International Streptomyces Project MT Môi trường MTdd Môi trường dung dịch s Sai số chuẩn hiệu chỉnh HTKS Hoạt tính kháng sinh RF Rectiflexibiles : thẳng cong vsv Vi sinh vật VK Vi khuẩn c 1, C2 Giống cấp 1, cấp NST Nhiễm sắc thể uv Utra Violet (tử ngoại) V Thể tích Dm Dung mơi IR Infrared (hồng ngoại) DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 1.1: Một số kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces Bảng :Các vi sinh vật kiểm định 17 Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn (g/100ml) 18 Bảng 2.3 Môi trường nuôi cấy vsv kiểm định 19 Bảng 2.4 Các dung môi sử dụng 21 Bảng 3.1: Kết thử hoạt tính kháng sinh với 10 v s V kiểm định 31 Bảng 3.2:Kết chọn lọc tự nhiên chủng Streptomyces 119.112 33 Bảng 3.3: Kết thử hoạt tính kháng sinh sau đột biến lần 35 Bảng 3.4: Kết đột biến lần 38 Bảng 3.5: Kết đánh giá hoạt tính kháng sinh mơi trường lên men 40 Bảng 3.6: Kết lên men biến chủng tốt môi trường MTldd 41 Bảng 3.7: Các thành phần môi trường (g/100ml) 42 Bảng 3.8: Kết lên men 16 môi trường 43 Bảng 3.9 Kết chiết kháng sinh dung môi hữu pH khác 44 Bảng 3.10: Kết tách kháng sinh dịch chiết sắc ký lớpmỏng 47 Bảng 3.11: Kết thử phân đoạn sắc ký cột 48 Bảng 3.12: Kết sắc kí lóp mỏng với phân đoạn có hoạt tính 50 Bảng 3.13: Kết chạy SKLM với hệ 51 Bảng 3.14: Kết sắc ký cột lần 52 Bảng 3.15: Kết sắc ký lóp mỏng 53 Bảng 3.16: Kết phổ NMR H-l actinomycin D 57 Bảng 3.17: Các đặc điểm Streptomyces 119.112 Streptomyces citreus 58 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 :Sơ đồ biện giải phổ NMR Hình 3.1: cấu trúc hóa học Actinomycin D Hình 3.2: Một số tương tác HMBC H -l ĐẶT VẤN ĐÈ • Từ kháng sinh tìm ứng dụng rộng rãi có nhiều bệnh nhiễm trùng bị coi nan y chữa trị thành công Nhưng nghiên cứu cho thấy ngày có nhiều chủng gây bệnh kháng lại kháng sinh có sẵn, nhiều kháng sinh khơng tác dụng số chủng gây bệnh nữa.Vì việc tìm kháng sinh vấn đề cần thiết toàn giới quan tâm Ngày với phát triển công nghệ, khoa học kĩ thuật, kháng sinh thường nghiên cứu phát tổng hợp theo hướng : tổng họp hoá học, bán tổng hợp sinh tổng họp Vi sinh vật có khả tổng hợp kháng sinh đa dạng phong phú vi khuẩn, xạ khuẩn hay nấm Trong chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều xạ khuẩn có khả tổng hợp kháng sinh đa dạng cấu trúc đặc điểm kháng khuẩn hon Ngoài số lồi xạ khuẩn chi tổng hợp chất chữa ung thư Streptomyces antibỉotỉcus sinh tổng họp Actinomycin D phát năm 1952 Do đó, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu sinh tằng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112” với mục tiêu sau: Nghiên cứu chất kháng sinh chỉnh Streptomyces 119.112 sinh tổng hợp Bước đầu xác định cấu trúc thành phần kháng sinh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương xạ khuẩn 1.1.1 Đặc • điểm sinh học • xạ • khuẩn 1.1.1.1 Đặc điểm chung Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn thực, có sổ đặc tính đặc biệt Chúng có khuẩn lạc khơ có dạng tia phóng xạ phát triển dạng sợi phân nhánh nấm Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân nguyên thuỷ chúng thường sinh trưởng dạng sợi thường tạo thành nhiều bào tử.Thậm chí số loại xạ khuẩn hình thành nang bào tử chi Streptosporangium bào tử di động Actinoplanes Tuy có đặc điểm phát triển dạng sợi phân nhánh xạ khuẩn chứng minh vi khuấn với chứng: khơng có nhân thật, có vùng nhân, thường khơng có vách ngăn, nhạy cảm với kháng sinh tác dụng lên vi khuẩn Đa số xạ khuẩn thuộc nhóm Gram (+), tỷ lệ G + c > 55%, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty) Xạ khuẩn có khả sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như: kháng sinh, enzym, số vitamin acid hữu Tuy nhiên số xạ khuẩn gây bệnh cho người, động vật trồng.[3], [10], [12] 1.1.1.2 Đặc điếm phân loại chi Streptomyces * Đăc điểm hình thải - Khuẩn lạc: Khuẩn lạc xạ khuẩn Streptomyces đặc biệt, tạo thành cụm, bề mặt khơ, xù xì, có nếp, toả theo hình phóng xạ Khuẩn lạc có chân vững chắc, khó tách khỏi môi trường nuôi cấy - Hệ sợi xạ khuẩn' Đường kính khuẩn ty khoảng từ 0,2 - l,0(im đến 2,0fim Thành tế bào xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng từ 10- 20nm, khơng có cellulose, kitin, có tác dụng trì hình dáng khuẩn ty bảo vệ tế bào Màu sắc khuẩn ty phong phú: trắng, vàng, đỏ, lục, tím, nâu, đen Khuẩn ty chất: mọc sâu vào môi trường nuôi cấy, bề mặt nhẵn sần sùi, tiết mơi trường số loại sắc tố, có sắc tố tan nước, có sắc tố tan dung môi hữu Khuẩn ty chất phát triển thời gian dài khơng khí thành khuẩn ty khí sinh, có đường kính từ 1,0- l,4|im Sau thời gian phát triển đỉnh khuẩn ty khí sinh xuất chuồi bào tử Chuỗi bào tử có nhiều hình dạng khác nhau: thẳng, uốn cong, lượn sóng, móc đơn, móc vòng, xoắn lò xo Các chuỗi bào tử phân cắt thành bào tử trần Bào tử trần quan sinh sản chủ yếu xạ khuấn.Bào tử trần có hình cầu, hình bầu dục, hình trụ.Các bào tử tập hợp với thành chuỗi 3050 bào tử nhiều Be mặt bào tử có dạng trơn nhẵn (sm), xù xì da cóc (wa), có gai (sp) có tóc (ha).[5], [10], [12] * Đặc điểm sinh lý: Streptomyces vi sinh vật dị dưỡng, có tính oxi hố cao Đe phát triển, chúng phân giải hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất lượng, đồng thời thuỷ phân hợp chất gelatin, casein, tinh bột.Chúng khử nitrat thành nìtút.Streptomyces loại xạ khuẩn hơ hấp hiếu khí Nhiệt độ tối ưu chúng thường 25- 30°c, vài lồi phát triển tốt nhiệt độ cao hơn, pH tối ưu thường từ ,8 - 7,5 Khả tạo sắc tố: khả tạo sắc tố từ Streptomyces chia thành loại: sắc tố hoà tan, sắc tố khuẩn ty chất, sắc tố khuẩn ty khí sinh (màu sắc bề mặt khuẩn lạc), sắc tố melanin.[5], [10], [12] 1.1.2 Phân loại Streptomyces 1.1.2.1 Phân loại định tên theo ISP r.HH'y I K0' I*i (11s *l’1 o l*i Q Pi on rH Ọ o s a m ■c l a w *rHma cCli lol aCl sinh - chất H-l HI -D M S O -C O S Y G P Phụ lục 17 : Phổ COSY - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l NH MM z 111 |I I •sir I 11 II Mit -r I ■' ' S ' I'M i ii j H I v r '• •*■ Jw • I IIy s B (liifiii ỊỊ I ifM H !! “ ỉ : "! ĩ : : : ' ! : : s : ĩ ỉ ỉ ĩ ỉ ; : s 1■■ ' ,\ z r ì “ u H SS H u U 11 II Ị i • MM i l l í» :» ỉ i Ị !*.h h : ',r, M “ § » (j:::::::::::::::::: ri à*' ", ỊỊ ĩ 'n « ■ * ỊỈ» *í-fi Iif I'M X ĩ ã b w ■! ■! II P |S Ị| m ''ả 1» " * ậ.f • • u Mỉ ỉ I ỊI Sis :JB aeons ■* *J p I WWK *>• ?• H N M y - 8f l M Cl Mniaiiili Gfji!fiBKiiasnsiiW88HI1 viiiiiiiii«8 I MKuiiii iằi*nuni*niôu U i ó l n ' ' ằ Ị' I ri _ _ Ĩ Í H | 'J a I'í " u B 1*89 v«s»s JJ * MM ■ * * * * * Wm ;i ;i n ■ ■ ■ ■ ■ KUUiiiJillU ! ' !5 'i? inuirt a Mi HI —DMSO—CO SYG P Cl o in m Irfi o *0 feTI r- o 'JO m oi o sn o m o m ôri n M ui Ph lc 18: Ph COSY - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l 190 180 170 260 150 240 130 120 110 100 & D E P T H -D M S -C C P D Phụ lục 19 : Phổ DEPT - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l & D E P T H -D M S -C C P D Phụ lục 20 : Phổ DEPT - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l & D E P T H i —D M S O — C C P D Phụ lục 21: Phổ DEPT - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l HI -DMSO-HMBC i *- -A jK —-A—— 'À— ppm I - - — - «— — - - r * ỉ - 10 ■ 20 * ệ ỗ » t - 30 w **411 t I ■40 J í - bo • 60 \ - 70 - 80 - 90 -100 -110 -120 I -130 'ế -140 -150 -4 t -160 ỉ « a - I -170 - -180 -190 I rrỷ, -200 ppm Phụ lục 22 : Phổ HMBC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l tí±-UMSVH l-D M S O -H M B C J U -A ^ -V JL_ ppni Phụ lục 23 : Phổ HMBC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l H l- D M S O - H M B C ^ _ X ằ Ì _ u _ j Ằ a „ .r z r7~' y~. ' ~ "J t ’ " - — Phụ lục 24 : Phổ HMBC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l H l-D M S O -H S Q C _ A * L _ A _ U J Ì J 1 U — Phụ lục 25 : Phổ HSQC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l H l-D M S O -H S Q C I A I ppm - ,i - 45 © Ọ _ L I 50 55 o! - 60 ■65 to ■70 ■75 80 - 85 90 ■95 -100 -105 -110 -115 '120 -125 -130 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm Phụ lục 26: Phổ HSQC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l H l-D M S O -H S Q C ppm ppm Phụ lục 27 : Phổ HSQC - NMR thành phần kháng sinh - chất H-l ... Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces Các loài xạ khuẩn thuộc Streptomyces có khả tạo nhiều kháng sinh có cấu trúc phức tạp Trong tổng số kháng sinh tìm thấy xạ khuẩn tổng hợp có tới 55% tổng. .. khuẩn chi tổng hợp chất chữa ung thư Streptomyces antibỉotỉcus sinh tổng họp Actinomycin D phát năm 1952 Do đó, chúng tơi chọn đề tài: Nghiên cứu sinh tằng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 119.112 ... điểm sinh học xạ khuẩn 1.1.2 Phân loại Streptomyces 1.1.3 Khả sinh tổng hợp kháng sinh Streptomyces 1.2 Cải tạo giống vi sinh v ậ t 1.3 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh