Đang tải... (xem toàn văn)
Xã hội ngày càng phát triển, bên cạnh đó bệnh tật càng gia tăng. Rối loạn lipid huyết là bệnh phổ biến hiện nay với tỷ lệ ngày càng cao, trước đây phần lớn bệnh xuất hiện ở những người trên 50 tuổi nhưng ngày nay tỷ lệ bệnh gia tăng ở những người trẻ tuổi. Rối loạn lipid huyết gây ra các biến chứng nguy hiểm như nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não, tiểu đường… Hiện nay đã có nhiều loại thuốc tây y để điều trị nhưng những thuốc đó đem lại những tác dụng phụ không mong muốn như: nhức đầu, đau bụng, độc gan...Chính vì vậy việc sử dụng nguyên liệu từ thiên nhiên để làm thuốc là điều được mọi người quan tâm. Hà thủ ô trắng là một vị thuốc nam, ít được nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Trước đây người ta chỉ biết đến Hà thủ ô trắng với những công dụng như một vị thuốc bổ khí huyết, chữa đau lưng mỏi gối, kinh nguyệt không đều, suy nhược thần kinh, tăng khả năng sinh con cho nam giới…1, 2, 3, 4, 5. Ngoài ra, Hà thủ ô trắng còn nâng cao tỷ lệ sống hoặc kéo dài thời gian cầm cự đối với động vật đã tiêm liều độc rắn hổ mang và tác dụng ức chế sự co thắt cơ trơn ruột cô lập gây bởi histamine và acetylcholine, kích thích hô hấp, nhưng không làm thay đổi huyết áp, kích thích nhẹ nhu động ruột và lợi tiểu, kích thích tiêu hóa ăn được nhiều và tăng cân, tăng sức lực, hạ thân nhiệt, tiêu viêm và an thần nhẹ 6. Những nghiên cứu gần đây cho thấy cao cồn 96% của rễ củ Hà thủ ô trắng có tác dụng hạ cholesterol nội sinh và ngoại sinh trên chuột nhắt trắng 7, 8, 9. Để góp phần hiểu rõ thêm thành phần hóa học Hà thủ ô trắng, chúng tôi đặt vấn đề ”Khảo sát thành phần hóa học trong rễ củ cây Hà thủ ô trắng”. Trong khuôn khổ một khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, đề tài được thực hiện với các mục tiêu cụ thể như sau: • Thu thập tài liệu về thực vật, hóa học, tác dụng dược lý, công dụng của rễ củ cây Hà thủ ô trắng. • Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật có trong rễ củ của cây Hà thủ ô trắng. • Khảo sát phương pháp chiết xuất để thu được hàm lượng alkaloid cao và ít tạp. • Phân lập thành phần alkaloid có trong rễ củ của cây Hà thủ ô trắng.
Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU iii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .iv iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH v MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ Chương II: TỔNG QUAN .2 Chương III : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 Chương IV: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 i Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT EtOAc Etyl acetat MeOH Methanol DCM Diclorometan CF Chloroform PĐ Phân đoạn SKLM Sắc ký lớp mỏng QT Qui trình MS Mass Spectrometry S.juventas Streptocaulon juventas S.griffithii Streptocaulon griffithii ii Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Công thức 18 hoạt chất kháng tăng sinh dòng tế bào HT-1080 10 Bảng 4.2: So sánh kết QT1 QT2 20 Bảng 4.3 : Kết kiểm tra alkaloid từ cao chiết 23 Bảng 4.4: Khảo sát pH acid 24 Bảng 4.5: Khảo sát pH kiềm 24 Bảng 4.6: Các phân đoạn từ I đến VIII 27 Bảng 4.7: Các phân đoạn I, II, VI 27 Bảng 4.8: Các phân đoạn IX, X, XI, XII, XIII, XIV .28 Bảng 4.9: Các phân đoạn I, II, III (cột 2) .30 iii Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1:Vị trí phân loại Streptocaulon juventas .3 Sơ đồ 4.2: Qui trình chiết alkaloid nước acid (QT1) .18 Sơ đồ 4.3: Qui trình chiết alkaloid từ cao cồn 96% (QT2) .19 Sơ đồ 4.4: Qui trình chiết alkaloid từ cao chiết độ cồn khác 21 Sơ đồ 4.5: Qui trình chiết alkaloid từ rễ củ Hà thủ trắng .25 iv Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Lá thân Hà thủ ô trắng Hình 2.2: Hoa Hà thủ trắng Hình 2.3: Quả Hà thủ trắng Hình 2.4: Cây Hà thủ trắng Hình 2.5: Chế phẩm Hà Sinh 13 Hình 2.6: Chế phẩm Hà Sâm Hoàn 13 Hình 4.7: Sắc ký đồ QT1 QT2 20 Hình 4.8: Sắc ký đồ QT1, QT2 QT3 22 Hình 4.9: Sắc ký đồ PĐ I,II,VI 28 Hình 4.10: Sắc ký đồ phân đoạn IX, X, XI, XII .29 Hình 4.11: Sắc ký đồ phân đoạn I, II, III (cột 2) 31 v Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn MỞ ĐẦU VÀ ĐẶT VẤN ĐÊ Xã hội ngày phát triển, bên cạnh bệnh tật gia tăng Rối loạn lipid huyết bệnh phổ biến với tỷ lệ ngày cao, trước phần lớn bệnh xuất người 50 tuổi ngày tỷ lệ bệnh gia tăng người trẻ tuổi Rối loạn lipid huyết gây biến chứng nguy hiểm nhồi máu tim, tai biến mạch máu não, tiểu đường… Hiện có nhiều loại thuốc tây y để điều trị thuốc đem lại tác dụng phụ không mong muốn như: nhức đầu, đau bụng, độc gan Chính việc sử dụng ngun liệu từ thiên nhiên để làm thuốc điều người quan tâm Hà thủ ô trắng vị thuốc nam, nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng sinh học Trước người ta biết đến Hà thủ ô trắng với cơng dụng vị thuốc bổ khí huyết, chữa đau lưng mỏi gối, kinh nguyệt không đều, suy nhược thần kinh, tăng khả sinh cho nam giới…[1], [2], [3], [4], [5] Ngồi ra, Hà thủ trắng nâng cao tỷ lệ sống kéo dài thời gian cầm cự động vật tiêm liều độc rắn hổ mang tác dụng ức chế co thắt trơn ruột cô lập gây histamine acetylcholine, kích thích hơ hấp, khơng làm thay đổi huyết áp, kích thích nhẹ nhu động ruột lợi tiểu, kích thích tiêu hóa ăn nhiều tăng cân, tăng sức lực, hạ thân nhiệt, tiêu viêm an thần nhẹ [6] Những nghiên cứu gần cho thấy cao cồn 96% rễ củ Hà thủ ô trắng có tác dụng hạ cholesterol nội sinh ngoại sinh chuột nhắt trắng [6], [8], [9] Để góp phần hiểu rõ thêm thành phần hóa học Hà thủ ô trắng, đặt vấn đề ”Khảo sát thành phần hóa học rễ củ Hà thủ ô trắng” Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, đề tài thực với mục tiêu cụ thể sau: • Thu thập tài liệu thực vật, hóa học, tác dụng dược lý, công dụng rễ củ Hà thủ ô trắng • Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật có rễ củ Hà thủ trắng • Khảo sát phương pháp chiết xuất để thu hàm lượng alkaloid cao tạp • Phân lập thành phần alkaloid có rễ củ Hà thủ trắng Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Chương II: TỔNG QUAN 2.1 TỔNG QUAN VÊ THỰC VẬT HỌC 2.1.1 Họ Thiên ly Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại A.L Takhtajan năm 1987, họ Thiên lý (Asclepiadaceae), chi Streptocaulon, lồi Streptocaulon juventas có vị trí sau [11], [12]: Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp hoa môi (Lamiidae) Liên Long đởm (Gentiananae) Bộ Long đởm (Gentianale) Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) Streptocaulon … … S.juventas … S.griffithii Sơ đồ 1.1:Vị trí phân loại Streptocaulon juventas Họ Thiên lý (Asclepiadaceae) có 209 chi với khoảng 2000 lồi khắp giới Ở Việt Nam có 39 chi với 103 lồi [12] Theo Trần Đình Lý cộng Việt Nam có 40 chi với 100 lồi [13] Các chi thường thấy Việt Nam [1], [2], [3], [14], [15]: Calotropis (cây Bồng bồng-Calotropis gigantean Br.), Asclepias (cây Bông taiAsclepiascurassavica L.), Hoya (cây Hoa sao- hoyacanosa R.Br.), Dischidia (cây Tai chuột – Dischidia acuminate Cost.), Cryptolepis (cây Càng cua-cryptolepis buchamani Roem.Et Schult.), Telosma (cây thiên lý-Telosma cordata Merr.), Streptocaulon: dây leo, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn hoa nhỏ 1cm, nụ hoa hình trứng, hình tim gốc (cây Hà thủ ô trắng – Streptocaulon juventas Merr.) Đặc điểm thưc vật Họ Thiên lý phân bố vùng nhiệt đới, nhiệt đới, mọc xứ lạnh Cây thân cỏ sống dai hay dây leo, thân bụi hay thân mộc Cây có nhựa mủ, điểm thường thấy họ Lá đơn nguyên, mọc đối, mọc vòng hay mọc cách, phiến dày hay mỏng, có lơng, gân hình lơng chim Họa tự thường xim nách hay ngọn, đơi tụ thành tán Hoa lưỡng tính, mẫu Lá đài rời hay dính đáy, tràng hình bánh xe, hình ống hay hình đinh, bên ống tràng hay có phận tạo thành tràng phụ Nhị đính gốc hay gần gốc Bộ nhụy gồm hai nỗn, nỗn có nhiều noãn Quả gồm hai đại rời, Hạt có chùm lơng tơ (lơng mào) nội nhũ Rễ phình to thành củ [2], [6], [14] Họ Thiên lý gần với họ Trúc đào (Apocynaceae), điểm khác bao phấn dính liền đầu nhụy hạt phấn khơng rời mà dính thành tứ tử hay phấn khối 2.1.2 Chi Streptocaulon Từ chữ Hy Lạp streptos: quay lại, vặn đi, vặn lại kaulos: thân (dây leo có thân quấn) [] Chi Streptocaulon thuộc tông Periploceae họ Asclepiadaceae [12,14] Riêng J.Hutchison tách tông Periploceae có chi Streptocaulon thành họ riêng cấu tạo hoa gần họ Apocynaceae họ Asclepiadaceae [15] Đặc điểm chi [2]: Cây dạng dây leo quấn, đơn nguyên, hình kim đáy, đầu nhọn Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Hoa: cụm hoa xim, hoa nhỏ có nụ hình trứng, cuống hoa thường có lơng nhung, mọc nách ngọn, tràng hình bánh xe, có tràng phụ gồm năm sợi đính lưng nhị Nhị đính đáy ống tràng, bao phấn đính đầu vòi nhụy Bộ nhụy gồm hai nỗn rời, vòi nhụy ngắn, đầu nhụy có năm góc Quả gồm hai đại, có lơng mềm Hạt dẹp, mang mào lông mềm, vỏ mỏng, phôi nhũ hẹp Chi Streptocaulon có lồi Ấn Độ Malaisia, Đơng Dương có lồi sau [1], [2], [3], [14], [15]: Streptocaulon juventas Merr (Hà thủ ô trắng), Streptocaulon griffithii (Hà thủ ô griffithi), Streptocaulon horsfiedfii Miq (Bạc Horsfield), Streptocaulon kleinii Wight&Arn (Bạc Klein), Streptocaulon wallichii (Bạc Wallich) Ở Việt Nam thông dụng lồi Streptocaulon juventas Merr (Hà thủ trắng) Streptocaulon griffithii (Hà thủ ô griffithii hay Mã liên an): dây leo có rễ to, cành màu nâu có lỗ bì, lúc non có lơng phún dày, phiến hình bầu dục, đầu tù, gốc hình tim, có lơng, hoa dạng xim lưỡng phân, tràng hoa màu lục, mặt màu hồng, không lông, đại thẳng hàng, hạt có mào lơng Cây mọc đồi núi trảng nắng Cây làm thuốc bổ Hà thủ ô trắng 2.1.3 Cây Hà thủ ô trắng Tên khoa học: Streptocaulon juventas Merr Thuộc họ Asclepiadaceae Tùy địa phương, Hà thủ trắng gọi với tên khác nhau: Hà thủ ô nam, dây Vú bò, dây Sữa bò (vì tồn có nhiều nhựa trắng), dây Mốc (vì có nhiều lơng trơng mốc), Sừng bò, Đa lơng (do tồn có nhiều lơng), Mã liên an hay Mã lìn ón, Khâu cần cày (Tày), Chừa mà sìn, Khâu nước (Thái), Dây nước, Xạ ú pẹ (Dao), Pân rạ, Rờ nạ (K’ho), Khua mak tang ting (Lào), Streptocaulon (Pháp) [2], [3], [4], [13], [15], [17], [18], [19] Hà thủ ô trắng Hà thủ ô đỏ tên sử dụng tương tự chúng khác xa mặt hóa học mặt thực vật Cây Hà thủ ô trắng dễ nhầm lẫn với khác tên gọi hay hình dạng Về tên gọi: Vú bò (Ficus heterophyllus L.Moraceae), Sữa (Alstonia scholaris L.R.Br.Apocynaceae) Về hình dạng: Sừng trâu (Strophanthu scandans Roem.et Schult.Apocynaceae), Mác chim (Anialocalyx microlobus Pierre Apocynaceae), có hoa to màu hồng, hai đại dính vào nhau, dây Càng cua (Cryptolepis buchanani Roem.et schult Asclepiadaceae): tồn khơng có lơng, màu lục sẫm, bóng, hoa to màu vàng Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn 100g dược liệu Làm ẩm chiết nóng với cồn 96% Cao cồn 96% Chiết nóng với H2SO4 2% Dịch acid Kiềm hóa với NaOH 10% Dịch kiềm Lắc phân bố Lắc phân bố EtOAc Loại dịch kiềm sau lắc với MeOH DCM Dịch EtOAc MeOH Dịch DCM Dịch MeOH Loại dung môi Loại dung môi Loại dung môi Cao DCM Cao EtOAc Cao MeOH Sơ đồ 4.4: Qui trình chiết với dung môi hữu DCM, EtOAc, MeOH Kiểm tra cao alkaloid thu với thuốc thử chung alkaloid Kết bảng 4.3 Bảng 4.3 : Kết kiểm tra alkaloid từ cao chiết Thuốc thử Cao alkaloid tồn Lượng cắn phần dung alkaloid mơi hữu toàn phần (g) Dragendorff Bertrand Valse Mayer DCM 0,81 +++ ++ ++ EtOAc 0,74 ++ ++ ++ MeOH 0.65 + + + Nhận xét và kết luận 23 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Dịch kiềm lắc với dung môi DCM cho lượng cao alkaloid toàn phần nhiều Cao toàn phần DCM phản ứng dương tính với thuốc thử đặc hiệu alkaloid rõ so với cao EtOAc, cao MeOH Do DCM chọn làm dung mơi chiết alkaloid tồn phần 4.2.2.2 Khảo sat pH acid Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH acid lên trình chiết xuất alkaloid cách chiết cao cồn nước acid pH acid khác Kết bảng 4.4 Bảng 4.4: Khảo sát pH acid pH Thuốc thử Dragendorff Bertrand Valse Mayer 4–5 + + + ++ ++ + +++ +++ ++ Nhận xét và kết luận Ở pH=2 cho kết dương tính với thuốc thử chung alkaloid rõ pH lại, pH acid ảnh hưởng đến q trình chiết xuất Do chọn pH = để acid hóa cao cồn tiến hành chiết xuất alkaloid Hà thủ ô trắng 4.2.2.3 Khảo sat pH kiềm Tiến hành khảo sát ảnh hưởng pH kiềm lên trình chiết xuất alkaloid cách kiềm hóa dịch chiết acid pH kiềm khác Kết xem bảng 4.5 Bảng 4.5: Khảo sát pH kiềm pH Thuốc thử Dragendorff Bertrand Valse Mayer + + + 10-11 ++ + + 12 ++ +++ +++ Nhận xét và kết luận Ở pH=12 cho kết dương tính với thuốc thử chung alkaloid rõ pH lại Do chọn pH = 12 để kiềm hóa dịch chiết acid tiến hành chiết xuất alkaloid Hà thủ trắng 24 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn 4.2.3 Chiết xuất alkaloid toàn phần từ dươc liệu Tiến hành Cân làm ẩm 20kg dược liệu cồn 96% Đun hồi lưu bột dược liệu làm ẩm giờ, lọc thu dịch cồn, bã dược liệu chiết tiếp nhiều lần Tiến hành loại dung môi cồn 96% cách cô quay áp suất giảm nhiệt độ 50 0C thu 1,1kg cao cồn 96% Cao cồn chiết nóng nhiều lần với H 2SO4 2% dịch acid không phản ứng với thuốc thử Bertrand Lọc dịch chiết acid qua giấy lọc Dùng NaOH 10% kiềm hóa dịch lọc đến pH=12 Dịch kiềm lắc nhiều lần với DCM đến dịch DCM khơng phản ứng với thuốc thử Dragendorff Cô thu hồi DCM 6g cao alkaloid tồn phần Chiết cồn 96% nhằm mục đích giảm thiểu lượng tạp tan nước thu nhiều alkaloid dịch chiết Chiết alkaloid cách đun nóng với H 2SO4 2% Lắc với DCM để thu alkaloid phân cực phân cực Sơ đồ 4.5 20 kg bột dược liệu Chiết nóng với cồn 96% (lặp lại nhiều lần) Dich chiết cồn Cô thu hồi dùng mơi Cao cồn Chiết nóng với H2SO4 2% Dịch chiết acid Kiềm hóa với NaOH 10% đến pH=12 Dịch chiết kiềm Lắc với DCM Dịch DCM Cô thu hồi dùng mơi Cao DCM Sơ đồ 4.5: Qui trình chiết alkaloid từ rễ củ Hà thủ ô trắng 25 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Kết Từ 20kg dược liệu thu 6g cao alkaloid toàn phần, hiệu suất chiết 0,03% 4.3 Phân lập và tinh chế alkaloid Phân lập alkaloid toàn phần Theo tài liệu tham khảo [37] Kết thăm dò hệ dung mơi, chọn hệ CHCl3-MeOHNH4OH (9:0.25:1) để khai triển SKLM Dùng dung môi khai triển cột chloroform thay dùng diclorometan diclorometan dễ bay nên khó ổn định cột Q trình phân tách alkaloid thành phân đoạn tiến hành cột sắc ký cổ điển Sắc ky cột cổ điển - Mẫu: 6g cao diclorometan hòa tan dung mơi chloroform - Dụng cụ: cột sắc ký thủy tinh dài 74 mm, đường kính 4,5mm, pipet pasteur, ống nghiệm - Chất hấp phụ: silicagel hạt vừa (kích thước:0,04-0,06mm) hoạt hóa vơi 10% nước 1100C giờ, khối lượng silicagel 300g - Hệ dung môi khai triển: CHCl3 sau thay đổi tỷ lệ pha động có độ phân cực tăng dần - Nhồi cột: silica gel nạp vào cột dạng hỗn dịch Thời gian ổn định cột (chạy không tải) khoảng Sau cột ổn định, mẫu nạp vào cột - Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lượng dung môi dùng để ổn định cột mặt chất hấp phụ khoảng 1-2 mm nạp mẫu Bảo vệ mặt cột lớp silica gel mỏng, sau tiến hành khai triển cột - Khai triển cột: + Tốc độ: 120 giọt/ phút + Dụng cụ hứng: ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm, thể tích phân đoạn 20 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi CHCl3-MeOH-NH4OH (9:0.25:1), khai triển lần, phát UV-254, UV-365 thuốc thử Dragendorff - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn 26 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Kết -Khai triển cột với dung môi CHCl 3, gộp phân đoạn Các phân đoạn kiểm tra sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3-MeOH- NH4OH (9:0.25:1) Bảng 4.6 Bảng 4.6: Các phân đoạn từ I đến VIII Ống số Phân đoạn Màu 3-47 I Nâu 50-70 II Vàng (có kết tinh) 80-118 III Vàng 120-184 IV Vàng 185-205 V Vàng 206-295 VI Nâu 300-320 VII Vàng 321-446 VIII Vàng Trong phân đoạn có phân đoạn (phân đoạn I,II,VI) cho phản ứng xuất màu cam rõ với thuốc thử Dragendorff mỏng Bảng 4.7 Bảng 4.7: Các phân đoạn I, II, VI Ống số Phân đoạn Màu Rf 3-47 I Nâu 5,3 cm 50-70 II Vàng(có kết tinh) 4,5 cm 206-295 VI Nâu 3.2 cm Kết luận: Kết cột 1, phần triển khai CHCl có phân đoạn có alkaloid Trong phân đoạn II có kết tinh Tiến hành tinh chế phân đoạn II để thu kết tinh 27 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Kết kiểm tra phân đoạn SKLM với hệ CHCL 3-MeOH-NH4OH (9:0,25:1) H 4.9 UV 254 UV365 Thuốc thử Dragendorff Hình 4.9: Sắc ky đồ của PĐ I,II,VI -Cột tiếp tục triển khai với pha động có tỷ lệ MeOH tăng dần , thu phân đoạn (IX, X, XI, XII) có chứa alkaloid Tỷ lệ CHCl3-MeOH Bảng 4.8: Các phân đoạn IX, X, XI, XII, XIII, XIV Ống số Phân đoạn Màu 20:0,2 448-504 IX Nâu 20:0,4 507-560 X Nâu 9:1 562-695 XI Nâu 7:3 698-730 XII Nâu 5:5 731-760 XIII Nâu MeOH 761-800 XIV Nâu đậm Triển khai phân đoạn mỏng với hệ dung mơi CHCL3-MeOH-NH4OH (9:0,25:1) khơng tách vết Tiến hành kiểm tra phân đoạn hệ CHCl3-MeOH (9:1) 28 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Kết kiểm tra phân đoạn SKLM với hệ CHCL 3-MeOH (9:1) phân đoạn (PĐIX, PĐX, PĐXI, PĐXII) cho vết alkaloid có Rf (H 4.10) UV 254 UV365 Thuốc thử Dragendorff Hình 4.10: Sắc ky đồ của phân đoạn IX, X, XI, XII Nhận xét: Các phân đoạn chưa tinh khiết, không kết tinh alkaloid phân đoạn Kết luận: Các phân đoạn chưa tinh khiết từ cột triển khai với hệ CHCl 3-MeOH (tỉ lệ MeOH tăng dần) gộp lại để tinh khiết để tách tiếp cách triển khai cột sắc ký Tiến hành sắc ky -Mẫu: 3,5g cao hòa tan Cloroform -Dụng cụ: Cột sắc ký thủy tinh dài 63 mm, đường kính 3mm, pipet pasteur, ống nghiệm -Chất hấp phụ: Silicagel hạt vừa (kích thước 0,04-0,06mm) hoạt hóa với 10% nước 1100C giờ, khối lượng silicagel 100g -Hệ dung môi khai triển: CHCl3 sau tăng dần EtOAc đến 100% EtOAc, tiếp tục tăng dần tỉ lệ với MeOH -Nhồi cột: Silica gel nạp vào cột dạng hỗn dịch Thời gian ổn định cột (chạy không tải) khoảng Sau cột ổn định, mẫu nạp vào cột - Nạp mẫu: mẫu nạp dạng dung dịch Khi lượng dung môi dùng để ổn định cột mặt chất hấp phụ khoảng 1-2 mm nạp mẫu Bảo vệ mặt cột lớp silica gel mỏng, sau tiến hành khai triển cột 29 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn + Tốc độ: 120 giọt/ phút + Dụng cụ hứng: ống nghiệm 1,6 cm x 16 cm, thể tích phân đoạn 20 ml - Kiểm tra: phân đoạn kiểm tra phản ứng định tính với thuốc thử Bertrand, Valse Mayer SKLM với hệ dung môi EtOAc-MeOH (9:1), phát UV-254, UV-365 thuốc thử Dragendorff cho vết màu cam - Các ống có thành phần giống gộp lại thành phân đoạn Kết Sau khai triển cột với mẫu phân đoạn có chứa alkaloid chưa tách vết cột 1, thu phân đoạn có alkaloid Bảng 4.9 Bảng 4.9: Các phân đoạn I, II, III (cột 2) Dung môi khai triển cột Ống số Phân đoạn Màu CHCl3 7-73 I Vàng CHCl3 74-78 II Vàng EtOAc-MeOH (9:1) 79-105 III Vàng Kiểm tra phân đoạn sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi EtOAc:MeOH (9:1), phân đoạn cho phản ứng xuất màu cam rõ với thuốc thử Dragendorff mỏng, vết tách rõ Vết alkaloid phân đoạn I khơng thấy có vết tương ứng cao toàn phần (nguyên nhân cao tồn phần nhiều tạp nên che lấp vết alkaloid đó) Kiểm tra với thuốc thử VS, phân đoạn lên vết tạp, chưa nên khơng kết tinh Bảng 4.9; H 4.11 30 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn Hình 4.11: Sắc ky đồ của phân đoạn I, II, III (cột 2) UV 254 UV 365 Thuốc thử Dragendoff Tinh chế alkaloid Tiến hành tinh chế phân đoạn II (cột 1) phân đoạn có kết tinh màu vàng Kết tinh rửa MeOH nhiều lần thu phần dịch phần tinh thể -Phần tinh thể hòa tan kết tinh lại chloroform thu tinh thể màu trắng, dạng vảy gọi tên SJ1, khối lượng 30mg -Phần dịch MeOH dương tính với thuốc thử Dragendorff để kết tinh phân đoạn với dung mơi có độ phân cực khác Tinh chế nhiều lần dung môi, thu tinh thể SJ2, SJ3, SJ4 4.2.5 Kiểm tra alkaloid phân lập Các kết tinh (SJ1), (SJ2), (SJ3), (SJ4) kiểm tra với thuốc thử chung alkaloid Kết -SJ1: Khối lượng 30mg, kết tinh dạng vảy xốp, âm tính với thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) -SJ2: Khối lượng 10mg, kết tinh hình kim, âm tính với thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) -SJ3: Khối lượng 10mg, kết tinh hình khối, khơng màu, tan CHCl3, khơng tan MeOH, dương tính thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) 31 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn -SJ4: 30mg, kết tinh hình khối, khơng màu, tan CHCl3, tan MeOH, lên màu hồng với thuốc thử Dragendorff 32 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ 5.1 TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Qua trình thực đề tài “Khảo sát thành phần hóa học rễ củ Hà thủ ô trắng” thu số kết sau: Thu thập tài liệu thực vật học họ Thiên lý (Asclepiadaceae), chi Streptocaulon, loài Streptocaulon juventas, thành phần hóa học, tác dụng dược lý, cơng dụng Hà thủ trắng • Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật rễ củ Hà thủ trắng • Khảo sát qui trình chiết để thu nhiều hàm lượng alkaloid, giảm lượng tạp.Từ 20kg dược liệu chiết cồn 96% thu 1,1 kg cao cồn 96%, cao cồn chiết lại H2SO4 2%, dịch acid kiềm hóa NaOH 10%, dịch kiềm lắc phân bố với DCM, cô thu hồi dung mơi thu 6g cao alkaloid tồn phần • 6g cao alkaloid toàn phần phân tách thành phân đoạn sắc ký cột cổ điển Kết phân đoạn kết tinh có phân đoạn kết tinh có alkaloid • Phân đoạn kết tinh tinh chế kết tinh phân đoạn rửa với dung mơi có độ phân cực khác • Kết thu kết tinh SJ1, SJ2 âm tính với thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand), kết tinh (SJ3, SJ4) cho phản ứng dương tính với thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) • SJ1, SJ2 đo phổ MS 5.2 KẾT LUẬN Qua gần tháng thực đề tài “Khảo sát thành phần hóa học rễ củ Hà thủ trắng”, thu thập tài liệu tổng quan chi, họ, lồi Hà thủ trắng Chiết xuất phân lập phân đoạn có alkaloid Trong có phân đoạn kết tinh có alkaloid (phân đoạn II cột 1) Phân đoạn tinh chế cách kết tinh phân đoạn dung môi khác thu kết tinh (SJ1), (SJ2) âm tính với thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) kết tinh (SJ3),(SJ4) dương tính thuốc thử chung alkaloid (Dragendorff Bertrand) Do thời gian hạn hẹp nên việc xác định cấu trúc alkaloid phân lập tiếp tục sau Kết khóa luận tiền đề cho việc tinh khiết alkaloid kết tinh, 33 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn từ xác định cấu trúc, thử hoạt tính sinh học, tác dụng dược lý alkaloid Hà thủ ô trắng 5.3 ĐÊ NGHỊ Tinh chế alkaloid phân lập Xác định cấu trúc alkaloid 34 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn TÀI LIỆU THAM KHẢO Võ Văn Chi (1997) Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học,trang 538-539 Võ Văn Chi (2004) Từ điển thực vật thông dụng, tập 2,NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, trang 2355-2356 Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam, II, in lần 2, NXB Trẻ, trang 729730 Đỗ Tất Lợi (2000) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, in lần thứ NXB Y học, trang 836-837 Tuệ Tĩnh (1972) Nam dược thần hiệu, NXB Y học Hà Nội, trang 22 Viện Dược Liệu (2003) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tập 1, trang 890 Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (1997) Nghiên cứu thành phần hóa học Hà Thủ ô Trắng, Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (2000) Nghiên cứu tác dụng hạ cholestrerol Hà thủ ô trắng, Chuyên đề nghiên cứu khoa học dược, Y học TP.HCM Tam Pham Thanh, Hung Tran (2001) Study on antihypercholesterolemia activity of Streotocaulon juventas, Proceeding of 2nd Indopharmchina conf, Ha Noi, Viet Nam 10 Bộ Y tế (1983) Dược điển Việt Nam II, NXB Y học Hà Nội, trang 157 11 Bộ môn thực vật-Trường Đại học Y Dược TP.HCM (2002), Giáo trình phân loại thực vật, trang 145-146 12 Võ Văn Chi, Dương Tiến Đức (1987) Phân loại thực vật học, NXB ĐH ThCN Hà Nội, trang 388-390 13 Trần Đình Lý cộng (1993) 1900 lồi có ích Việt Nam, NXB Thế giới 14 Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên cộng (1969) Cây cỏ thường thấy Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học Hà Nội, trang 115-122 15 Phạm Hoàng Hộ (1972) Cây cỏ miền nam, II, NXB Trung tâm học liệu, trang 184 16 Hutchison J (1987), Những họ thực vật có hoa, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật, trang 389 17 Lê Khả Kế (1962), Thực vật học phân loại, NXB Giáo dục 18 Phạm Thị Kim, Đỗ Lệ Nhiễu (1981) Phân biệt chống nhầm lẫn dược liệu, NXB Y học Hà Nội, trang 143 19 Viện dược liệu (2004) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 1, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, trang 888-889 20 www.vncreatures.net/pictures/plant 35 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn 21 Võ Văn Chi –Trần Hợp(1999), Cây cỏ có ích Việt Nam,NXB Giáo dục, TP.HCM, tập 1, tr.468 22 Pham Thanh Tam (2002) Nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng hạ lipid huyết Hà thủ ô trắng, Luận văn Thạc sĩ Dược học, Trường Đại học Y Dược Tp.HCM, TP.Hồ Chí Minh 23 Ngô Vân Thu (1980) Bài giảng dược liệu, tập2, NXB Y học Hà Nội 24 Lecomete M.H (1912) Floge generale de l’Indo-chine, tom 4, Masson et Cie editeurs Paris, p.146 25 National Institutes of Health (1993) National Cholesterol Education Program: second report of the expert panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults 26 Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (1998) Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Hà thủ trắng (Streptocaulon juventas Merr.Asclepiadaceae), Tạp chí Dược học 27 Phạm Thanh Tâm, Trần Hùng (1998) Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Hà thủ ô trắng (Streptocaulon juventas Merr.Asclepiadaceae), Chuyên đề nghiên cứu khoa học Dược,Y học Tp.HCM 28 Tam Pham Thanh, Tram Thai Ngoc, Hung Tran (1997) Preliminary chemical investigation of Streptocaulon juventas, Proceeding of 1st Indopharmachina conf Bangkok, Thailand 29 Jun-ya Ueda, Yasuhiro Tezuka, Arjun H Banskota, Quan Le Tran, Qui Kim Tran, Ikuo Saiki, and Shigetoshi Kadota (2003) Constituents of the Vietnamese Medicinal Plant Streptocaulon juventas and Their Antiproliferative Activity against the Human HT-1080 Fibrosarcoma Cell Line, Institute of Natural Medicine, Toyama Medicinal and Pharmaceutical University, 2630 Sugitani, Toyama 930-0194, Japan, and National University-HoChiMinh City, HoChiMinh City, VietNam, J.Nat.Prod.2003, 66, 1427-1433 30 Cao Thị Hoài Phương (2005) Khảo sát thành phần hóa học rễ củ Hà thủ ô trắng, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ Đại học-Trường Đại học Y Dược TP.HCM 31 Trần Văn Kỳ (1993), Thuốc bổ đông y, Hội y học cổ truyền TP.HCM 32 Viện Dược Liệu (1993) Tài nguyên thuốc Việt Nam, NXB Y học kỹ thuật, trang 454-455 33 Phạm Thanh Tâm (1996) Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học Hà thủ trắng, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ Đại học, trường Đại học Y Dược TP.HCM 34 Võ Văn Chi (1991) Cây thuốc An Giang, NBX Khoa học Kỹ thuật, An Giang, trang 272-274 35 Bộ môn dược liệu- Trường Đại học Y Dược TP.HCM (2006) Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu, trang 72-95 36 Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn 36 http://opc.com.vn 37 Trần Thị Kiều Loan (2007) Khảo sát thành phần alkaloid rễ củ Hà thủ ô trắng, luận văn tốt nghiệp dược sĩ Đại học, trường Đại học Y Dược TP.HCM 37 ... sinh chuột nhắt trắng [6], [8], [9] Để góp phần hiểu rõ thêm thành phần hóa học Hà thủ trắng, chúng tơi đặt vấn đề Khảo sát thành phần hóa học rễ củ Hà thủ trắng Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp... học, đề tài thực với mục tiêu cụ thể sau: • Thu thập tài liệu thực vật, hóa học, tác dụng dược lý, công dụng rễ củ Hà thủ trắng • Khảo sát sơ thành phần hóa thực vật có rễ củ Hà thủ trắng • Khảo. .. alkaloid từ rễ củ Hà thủ ô trắng .25 iv Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Huỳnh Lê Hạnh Đàn DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1: Lá thân Hà thủ ô trắng Hình 2.2: Hoa Hà thủ ô trắng