BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG FMD

41 13 0
  • Loading ...
1/41 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 04/04/2019, 21:04

Nguồn: http://www.oie.int/ Người dịch: Đặng Nguyên Bình BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG (FOOT AND MOUTH DISEASE) TÓM TẮT Bệnh lở mồm long móng (FMD) bệnh truyền lây mạnh thú có vú có khả gây tổn thất kinh tế nặng nề chăn nuôi gia súc móng guốc mẫn cảm Có bảy chủng huyết virus FMD, đặt tên O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT Asia Bệnh nhiễm từ chủng không cho miễn dịch chủng khác Bệnh FMD không phân biệt lâm sàng với bệnh mụn nước khác, bệnh mụn nước heo (swine vesicular disease), bệnh viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis) bệnh chàm mụn nước (vesicular exanthema) Do chẩn đốn phòng thí nghiệm trường hợp nghi ngờ FMD khẩn cấp Các trường hợp điển hình FMD có đặc điểm tình trạng mụn nước chân, màng nhày miệng thú mụn nước tuyến vú Các dấu hiệu lâm sàng biến đổi từ nhẹ đến nặng nề xảy tử vong, đặc biệt thú non Trong số lồi, bệnh nhiễm khơng thể triệu chứng (subclinical), trâu rừng Châu Phi (Syncerus caffer) Mơ thích hợp cho chẩn đốn biểu bì có mụn nước chưa vỡ hay vỡ, dịch mụn nước Khi thu thập loại mẫu này, máu và/hoặc dịch hầu họng-thanh quản lấy làm mẫu, sinh thiết dùng ống thông thú nhai lại hay quét tăm hầu họng heo, để lấy nguồn virus Mô tim hay máu gởi trường hợp tử vong, mụn nước thích hợp có Quan trọng mẫu từ trường hợp nghi ngờ phải vận chuyển điều kiện an toàn tuân theo quy định quốc tế Các mẫu gởi đến phòng thí nghiệm cấp phép Các chẩn đốn FMD phân lập virus hay chứng minh kháng nguyên hay acid nucleic virus FMD mẫu mô hay dịch tiết Việc phát kháng thể đặc hiệu với virus áp dụng cho chẩn đốn kháng thể kháng proteins khơng cấu trúc (nonstructural proteins – NSPs) áp dụng làm thị cho bệnh nhiễm tự nhiên, tình hình sử dụng vaccin Nhận diện tác nhân gây bệnh: Việc chứng minh kháng nguyên hay acid nucleic virus FMD đủ xác nhận cho chẩn đốn dương tính Do chất lây lan mạnh tầm quan trọng kinh tế bệnh FMD, việc chẩn đốn phòng thí nghiệm nhận diện chủng huyết virus phải thực phòng thí nghiệm mà hội đủ yêu cầu OIE mẩm bệnh Khu trú Nhóm Xét nghiệm cố định bổ thể (complement fixation – CF) thay rộng rãi hầu hết phòng thí nghiệm xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (ELISA), xét nghiệm có độ nhạy đặc hiệu hơn, không bị ảnh hưởng yếu tố tiền hay kháng bổ thể (pro- or anti-complement factors) Nếu mẫu khơng đủ hay chẩn đốn chưa chắn, chất liệu mẫu phải cấy vào môi trường tế bào nuôi cấy hay cấy vào chuột 2- ngày chưa cai sữa, để khuyếch đại virus sống diện mẫu Ni cấy virus thích hợp tế bào tuyến ức bò (bê), tế bào thận heo, cừu non hay bê, hay lớp tế bào có mẫn cảm tương đương sử dụng Một tác động gây bệnh tích tế bào (cytophathic effect – CPE) hồn tất môi trường tế bào nuôi cấy, chất dịch sử dụng cho xét nghiệm CF, ELISA hay cho phản ứng chuỗi phân tử sử dụng enzym giả mã đảo ngược (reverse transcription polymerase chain reaction – RT-PCR) Các xét nghiệm tương tự thực huyễn dịch (xay nhuyễn) mô xương chuột bị chết Các xét nghiệm phát acid nucleic, RT-PCR sử dụng rộng rãi phương pháp chẩn đốn nhanh chóng có độ nhạy Kiểm tra kính hiển vi điện tử chất liệu bệnh tích đơi áp dụng để phân biệt bệnh FMD với bệnh virus khác Các chẩn đoán huyết học: Việc chứng minh kháng thể đặc hiệu proteins cấu trúc thú vật không sử dụng vaccin, thể tình trạng mụn nước, đủ cho xác nhận chẩn đốn dương tính Điều đặc biệt có ích trường hợp nhẹ hay thu thập mơ biểu bì Các xét nghiệm cho kháng thể số proteins không cấu trúc (NSPs) virus FMD có ích cho chứng minh tình trạng sinh sơi virus ký chủ trước hay tại, tình hình sử dụng vaccin Các protein không cấu trúc, không giống proteins cấu trúc, có tính đặc trưng cao không đặc hiệu với chủng huyết kết việc phát kháng thể kháng proteins khơng cấu trúc khơng hạn chế theo chủng huyết Các xét nghiệm trung hòa virus (virus neutralisation – VN) xét nghiệm ELISA kháng thể kháng protein cấu trúc áp dụng làm xét nghiệm huyết học đặc hiệu theo chủng huyết Các xét nghiệm VN tùy thuộc vào mơ ni cấy có khuynh hướng biến thể nhiều so với xét nghiệm ELISA; xét nghiệm chậm thường bị vấy nhiễm Các ELISA cho kháng thể có lợi nhanh hơn, không phụ thuộc vào tế bào ni cấy Xét nghiệm ELISA thực với kháng nguyên bất hoạt, cần đến sở trang thiết bị có khả hạn chế sinh học Các yêu cầu cho vaccin chẩn đoán sinh học: Các vaccin virus bất hoạt với nhiều thành phần sẵn có thị trường Một cách điển hình, virus sử dụng để gây nhiễm cho giá thể (suspension) hay tế bào nuôi cấy đơn lớp (monolayer cell culture) chế phẩm thu được gạn lọc, làm bất hoạt ethyleneimine trộn với chất phụ gia (adjuvant) Nhiều loại vaccin FMD đa giá bảo hộ nhiều chủng huyết khác mà gặp phải thực địa Vaccin thành phẩm phải thể virus sống tồn dư vaccin Việc thực hiệu áp dụng xét nghiệm ngoại môi trường (in vitro) cho khối virus làm bất hoạt trước chế tạo thành vaccin việc kiểm tra khỏi virus sống sau xác nhận xét nghiệm q trình nội mơi trường (in vivo) và/hoặc ngoại môi trường (invitro) cho thành phẩm Các thử nghiệm thực bò tiêm vaccin để thiết lập giá trị PD50 (50% liều bảo hộ - protective dose) hay bảo hộ bệnh chân móng nói chung (generalised foot infection – PGP), nhiên xét nghiệm huyết học coi an toàn thiết lập mối liên quan hàm lượng kháng nguyên diện vaccin, bảo hộ quan sát được, đáp ứng kháng thể đặc hiệu Các sở sản xuất vaccin FMD phải hội đủ yêu cầu OIE mầm bệnh Khu trú Nhóm Chẩn đốn tác nhân thử tham chiếu sẵn có Phòng thí nghiệm Tham chiếu OIE bệnh FMD hay Phòng thí nghiệm Tham chiếu Thế giới (World Reference Laboratory) bệnh FMD FAO Phòng thí nghiệm Viện Sức khỏe Động vật Pribright (Institute for Animal Health Pirbright Laboratory) có hai địa Phòng thí nghiệm Tham chiếu Thế giới FAO lẫn Phòng thí nghiệm Tham chiếu OIE cho bệnh FMD A MỞ ĐẦU Bệnh lở mồm long móng (FMD) virus thuộc giống Aphthovirus, họ Picornaviridae Có bảy chủng huyết virus FMD, đặt tên O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT Asia 1, gây nhiễm cho thú móng guốc Bệnh nhiễm chủng huyết không cho miễn dịch chủng huyết khác Bên chủng huyết thanh, nhiều dòng nhận diện xét nghiệm sinh hóa miễn dịch học Ở Châu Phi, virus FMD trì bò trâu rừng Châu Phi (Syncerus caffer) chúng ký chủ thường xuyên Có chứng cho thấy loài thú dưỡng hoang dã khác bị nhiễm, chúng khơng thể trì bệnh nhiễm q vài tháng khơng có mặt trâu rừng Châu Phi Ở nơi giới, bò thường nguồn tàng trữ virus FMD, nhiên số hoàn cảnh, virus thể thích nghi đặc trưng heo nhà, cừu dê Điều virus thích nghi có khả biến đổi khả thích nghi gây nhiễm đến lồi khác có hội Tuy nhiên, dòng virus FMD Cathay thích nghi với heo trở nên không gây nhiễm cho thú nhai lại lớn thực địa hay thực nghiệm, cần đến tế bào có nguồn gốc từ heo để phân lập ban đầu Loài hoang dã bên Châu Phi, trước kia, khơng có khả trì virus FMD Bằng chứng cho thấy bệnh nhiễm hươu trước xảy tiếp xúc, trực tiếp hay gián tiếp, với thú vật dưỡng bị nhiễm Với lồi thú dưỡng, bò, heo, cừu, dê trâu mẫn cảm với FMD (30) Ngoài ra, nhiều lồi móng guốc hoang dã, hươu, linh dương heo rừng trở nên bị nhiễm, ngoại trừ trâu rừng Châu Phi, chúng khơng thể vai trò quan trọng dịch tễ học FMD Các dòng virus FMD mà gây nhiễm cho bò phân lập từ heo hoang dã hươu Để chẩn đốn FMD lồi hoang dã, người ta áp dụng phương pháp tương tự mô tả thú vật nuôi trang trại Bệnh nhiễm thú vật mẫn cảm với virus FMD dẫn đến thể mụn nước chân, quanh xoang miệng, tuyến vú thú Các bệnh tích vành móng làm thành vành không phát triển mà mọc xuống phía móng mà sử dụng để ước tính thời gian từ bệnh nhiễm xảy Trong bệnh nhiễm nặng nề móng, móng sút Viêm vú (mastitis) hậu thường có FMD bò sữa Các mụn nước diện vị trí khác, bên lỗ mũi điểm chịu sức ép bàn chân – heo Mức độ nặng nề dấu hiệu lâm sàng khác theo dòng virus, liều lượng phơi nhiễm, lứa tuổi giống thú vật, loài ký chủ mức độ miễn dịch chúng (44) Các dấu hiệu từ nhẹ hay khơng thể bệnh nhiễm, đến nặng nề Một số trường hợp gây tử vong Tỷ lệ tử vong viêm tim đa điểm (multifocal myocarditis) thường xảy thú non: viêm (myositis) xuất vị trí khác Ở sở mà có lịch sử chết đột ngột gia súc móng guốc non, kiểm tra chặt chẽ thú vật trưởng thành thường phát diện bệnh tích mụn nước có tham gia FMD Sự diện mụn nước trường hợp tử vong có khác Ở thú vật có lịch sử bệnh mụn nước, việc phát virus FMD mẫu dịch mụn nước, mô biểu bì, mẫu hầu họng-thanh quản (oesophageal-pharyngeal – OP), sữa hay máu đủ để thiết lập chẩn đoán Các chẩn đốn thiết lập phân lập virus FMD từ máu, tim hay phủ tạng kháng trường hợp tử vong Cơ tim viêm thấy từ đại thể (gọi “tim vằn cọp – tiger heart”) số trường hợp tử vong Virus FMD sinh sơi tiết xuất từ đường hô hấp thú vật Việc tiết xuất theo đường khơng khí virus xảy giai đoạn cấp tính bệnh nhiễm Virus FMD diện tất tiết dịch xuất dịch thú vật bị nhiễm cấp tính bao gồm tiết xuất qua đường hơ hấp Quá trình truyền lây thường ảnh hưởng trực tiếp tiếp xúc thú bị nhiễm với thú mẫn cảm, hơn, phơi nhiễm thú mẫn cảm với xuất dịch tiết dịch thú vật bị nhiễm cấp tính Sau hồi phục từ giai đoạn cấp tính bệnh nhiễm, virus gây nhiễm biến khỏi xuất dịch tiết dịch, ngoại trừ dịch OP số thú nhai lại tiếp tục tìm thấy virus sống Các thú vật mà virus tồn dai dẳng OP đến 28 ngày sau bệnh nhiễm, gọi thú vật mang trùng Heo không thú vật mang trùng Bằng chứng mà cho thấy rằng, đặc biệt trâu rừng Châu Phi, thú vật mang trùng có khả năng, dù có, truyền lây bệnh đến thú vật mẫn cảm qua tiếp xúc trực tiếp: chế tham gia chưa rõ Giai đoạn mang trùng thường không kéo dài tháng, nhiên số mang trùng đến năm Ở trâu rừng Châu Phi, cá thể thú cho thấy tàng trữ virus năm, khơng khả sống lâu virus Bên đàn trâu rừng, virus trì đến 24 năm hay dài Ở khơng có thơng tin độ dài giai đoạn mang trùng loài trâu nhà khác, trâu nước Đông Nam Á Trâu nhà, cừu dê không thường mang trùng virus FMD vài tháng Do chất lây lan mạnh tầm quan trọng kinh tế FMD, chẩn đốn phòng thí nghiệm nhận diện chủng huyết virus phải thực sở mà hội đủ yêu cầu cho mầm bệnh Khu trú Nhóm nêu Chương 1.1.2 An toàn sinh học bảo vệ sinh học thí nghiệm vi sinh thú y sở chăn nuôi thú vật Các quốc gia thiếu điều kiện tiếp cận đến phòng thí nghiệm chun môn quốc gia hay vùng phải gởi mẫu đến Phòng thí nghiệm Tham chiếu OIE Các sở sản xuất vaccin phải hội đủ yêu cầu mầm bệnh Khu trú Nhóm Chẩn đốn tác nhân thử sẵn có dạng kit hay thành phần riêng biệt từ Phòng thí nghiệm Tham chiếu OIE FMD Việc sử dụng kháng nguyên bất hoạt xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA), làm đối chứng xét nghiệm phát kháng nguyên hay để phản ứng với huyết xét nghiệm ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) khối thể lỏng (liquid-phase blocking) hay khối thể rắn (solid-phase), làm giảm nguy bệnh, so với việc sử dụng virus sống Các tác nhân thử cung cấp dạng đơng khơ hay glycerol hay khơng glycerine hóa (non-glycerinated) mà đơng lạnh trì ổn định nhiệt độ, lần lượt, từ +1oC đến +8oC, - 30oC đến -5oC -90oC đến -50oC, nhiều năm Cơ quan Năng lượng Nguyên tử Quốc tế (International Atomic Energy Agency) xuất hướng dẫn mà bao gồm khuyến cáo xét nghiệm giao thức kiểm tra chất lượng B CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐỐN Với chẩn đốn phòng thí nghiệm, mơ tốt biểu bì hay dịch mụn nước Một cách lý tưởng, g mơ biểu bì phải thu thập từ vùng có mụn nước chưa vỡ hay vỡ, thường từ lưỡi, màng nhày miệng hay mụn nước chân Để tránh thương tích cho người thu thập mẫu, lý nhân đạo với thú vật, khuyên thú vật phải gây mê trước thực lấy mẫu Các mẫu biểu bì phải đặt vào mơi trường vận chuyển gồm lượng glycerol đệm phosphate 0,04 M, pH 7,2-7,6, thích hợp pha thêm chất kháng sinh (penicillin [1000 đơn vị quốc tế (IU)], neomycin sulphate [100 IU], polymyxin B sulphate [50 IU], mycostatin [100 IU]) Nếu khơng sẵn có đệm phosphate 0,04 M, môi trường nuôi cấy mô hay đệm muối phosphate (phosphate buffered saline – PBS) thay thế, quan trọng pH cuối hỗn hợp glycerol/đệm khoảng pH 7,2-7,6 Virus FMD mỏng manh pH thấp đệm cho môi trường vận chuyển tiêu chí cho lấy mẫu thành cơng Các mẫu phải giữ tủ lạnh hay nước đá đến phòng thí nghiệm Khi mơ biểu bì khơng sẵn có từ thú nhai lại, thí dụ trường hợp bệnh tiến triển tốt hay hồi phục bệnh, hay trường hợp nghi ngờ bệnh nhiễm mà dấu hiệu lâm sàng, mẫu dịch OP thu thập phương pháp dùng ống thông sinh thiết (hút đờm) (hay heo dùng tăm bơng ngốy hầu họng) để gởi đến phòng thí nghiệm cho phân lập virus hay xét nghiệm phản ứng chuỗi phân tử với enzyme giải mã đảo ngược (reverse-transcription polymerase chain reaction – RT-PCR) Tình trạng virus huyết (viraemia) phát kiểm tra mẫu huyết với xét nghiệm RT-PCR hay phân lập virus Để thu thập tăm bơng ngốy hầu họng heo, thú phải cho vào lồng gỗ thò cổ ngồi Đặt tăm bơng dụng cụ thích hợp, kìm kẹp mạch máu, sau đưa tăm vào sâu miệng, đến tận họng Trước thu thập mẫu OP từ bò hay thú nhai lại cỡ lớn (như trâu), ml dịch vận chuyển (cấu thành từ đệm phosphate 0,08 M chứa 0,01% albumin huyết bò, 0,002% đỏ phenol, kháng sinh [1000 đơn vị quốc tế/ml penicillin, 100 đơn vị quốc tế /ml mycostatin, 100 đơn vị quốc tế /ml neomycin, 50 đơn vị quốc tế /ml polymyxin], điều chỉnh pH đến 7,2) phải cho vào vật chứa ml có khả chịu đơng lạnh băng CO (đá khô) hay nitrogen lỏng (39) Một mẫu OP thu thập cách cho ống thông theo lưỡi vào đến vùng hầu họng sau thụt mạnh ống phía sau phía trước 5-10 lần phần đầu thực quản phần sau hầu họng Mục đích để thu thập dịch hầu họng đặc biệt tế bào biểu bì vùng này, bao gồm tế bào phần gần thực quản, vách hầu họng, tế bào hạch hạnh nhân bề mặt mềm Nếu mẫu khơng chứa đủ lượng bợn tế bào phải lặp lại thao tác Sau thu thập dịch OP ống thông sinh thiết, chất chứa phải đổ vào chai cổ rộng suốt, có dung tích khoảng 20 ml Chất dịch đem kiểm tra phải chứa chất liệu tế bào nhìn thấy Sau ml mẫu thêm vào ml dịch vận chuyển, đảm bảo có chất liệu tế bào; hỗn hợp lắc nhẹ nhàng phải có pH cuối khoảng 7,6 Các mẫu mà bị vấy nhiễm chất chứa cỏ khơng thích hợp cho ni cấy Các mẫu mà thấy có chứa máu khơng hồn hảo Có thể thực lấy mẫu lại sau miệng họng thú súc xả nước hay PBS Khi lấy mẫu từ nhiều thú, phải rửa sát trùng ống thông lần lấy mẫu Việc rửa sát trùng thực cách rửa ống thơng nước uống được, sau ngâm vào chất sát trùng thích hợp (như 0,5% acid citric nước uống [w/v]) sau xả chất sát trùng nước uống trước lấy mẫu thú Mẫu OP lấy từ thú nhai lại nhỏ thu thập cách cho ml dịch vận chuyển vào chai cổ rộng dung tích khoảng 20 ml, sau lấy mẫu, rửa xả ống thông sinh thiết dịch vận chuyển để xả mẫu OP Sau dịch chứa mẫu chuyển sang vật chứa dung tích khoảng ml để vận chuyển Vật chứa nhỏ phải có khả chịu đựng đông lạnh băng CO2 hay nitrogen lỏng (39) Các mẫu dịch OP phải làm lạnh hay đông lạnh sau thu thập Nếu mẫu phải vận chuyển lâu vài giờ, thích hợp đông lạnh mẫu đặt vào băng CO hay nitrogen lỏng Trước đông lạnh, vật chứa phải cẩn thận niêm kín nắp vặn kín khí hay silicone Điều đặc biệt quan trọng sử dụng băng CO 2, CO2 chui vào mẫu OP làm giảm pH mẫu, làm bất hoạt virus có mẫu Các vật chứa thủy tinh khơng thể sử dụng nguy nổ vỡ giải đông nitrogen lỏng rò rỉ vào bên Các mẫu phải đến phòng thí nghiệm thích hợp tình trạng đơng lạnh bền, khơng thể thực được, phải ướp lạnh Các cảnh báo chuyên môn cần thiết gởi chất liệu mẫu dễ hư hỏng có nghi ngờ FMD, đến nước hay quốc gia Hiệp hội Vận tải Hàng không Quốc tế (International Air Transport Association – IATA), Quy định Hàng hóa Nguy hiểm (Dangerous Goods Regulations – DGR) đặt yêu cầu đóng gói gởi mẫu chẩn đoán theo kỳ phương cách thương mại Những yêu cầu nêu vắn tắt Chương 1.1.1 Thu thập gởi mẫu chẩn đoán Nhận diện tác nhân gây bệnh Một loạt dạng mẫu bao gồm biểu bì, mẫu OP huyết kiểm tra phân lập virus hay RT-PCR Ngược lại, ELISA thích hợp để kiểm tra huyễn dịch biểu bì (epithelial suspensions), dịch mụn nước hay phù tế bào nuôi cấy (cell culture supernatants), đủ nhạy để kiểm tra trực tiếp mẫu OP hay huyết a) Phân lập virus (Virus isolation) Mẫu biểu bì phải lấy từ PBS/glycerol, thấm khơ giấy thấm để giảm lượng glycerol, vốn độc với tế bào ni cấy, sau cân lượng Chuẩn bị huyễn dịch xay nhuyễn mẫu cát vô trùng chày cối vô trùng, với lượng nhỏ môi trường nuôi cấy mô chất kháng sinh Môi trường thêm vào tích cuối gấp chín lần thể tích mẫu biểu bì ban đầu, cho huyễn dịch 10% Dịch gạn ly tâm nghiêng 2000 g 10 phút Sau gạn ra, chất lắng giá thể mẫu thực địa có nghi ngờ chứa virus FMD đem cấy vào tế bào nuôi cấy hay truyền vào chuột chưa cai sữa Các hệ thống tế bào nuôi cấy mẫn cảm bao gồm tế bào sơ cấp (primary cells) tuyến ức bò (bê) tế bào sơ cấp thận heo, bê hay cừu non Các lớp tế bào thiết lập, tế bào BHK-21 (thận chuột hamster non – baby hamster kidney) IBRS-2, sử dụng, thường mẫn cảm so với tế bào sơ cấp phát hàm lượng có khả gây nhiễm thấp (19) Tính mẫn cảm tế bào sử dụng phải thử nghiệm chế phẩm chuẩn virus FMD Việc sử dụng tế bào IB-RS-2 giúp phân biệt bệnh mụn nước heo (swine vesicular disease – SVD) với FMD (do virus SVD phát triển dạng tế bào này) thường chủ yếu dùng cho phân lập dòng sinh sơi heo (procinophilic strains), dòng O Cathay Tế bào nuôi cấy phải kiểm tra tác động gây bệnh tích tế bào (cytopathic effect – CPE) 48 Nếu không phát thấy tác động gây bệnh tích tế bào, tế bào phải đem đông lạnh giải đông, để đem cấy vào môi trường nuôi cấy tươi kiểm tra tác động gây bệnh tích tế bào 48 Chuột non chưa cai sữa thay cho tế bào nuôi cấy chuột phải lứa tuổi từ 2-7 ngày chọn lọc từ dòng giống Một số virus thực địa cần đến vài lượt cấy truyền trước chúng trở nên thích nghi với chuột (58) Trong trường hợp dịch OP, xử lý trước với thể tích tương đương chloro-fluoro-carbons cải thiện tỷ lệ phát virus phóng thích virus khỏi phức hợp miễn dịch b) Các phương pháp miễn dịch học (Immunological methods) o Xét nghiệm hấp phụ miễn dịch kết hợp enzyme (Enzyme-linked immunosorbent assay – ELISA) Phương pháp thích hợp cho phát kháng nguyên virus FMD nhận diện chủng huyết virus ELISA (28, 53) Đây xét nghiệm chồng lớp gián tiếp (indirect sandwich test) với hàng khác phiến nhiều giếng tráng kháng huyết thỏ chủng huyết bảy chủng huyết virus FMD Những huyết gọi “huyết bắt giữ - capture sera” Huyễn dịch mẫu xét nghiệm cho vào hàng, gồm các đối chứng thích hợp Tiếp theo cho vào kháng huyết chuột lang (guinea-pig) chủng virus FMD, sau huyết thỏ kháng với huyết chuột lang kết hợp với enzyme Việc rửa thực giai đoạn để loại bỏ tác nhân thử không kết bám Một phản ứng màu lúc cho chất enzyme chất màu cho thấy phản ứng dương tính Với phản ứng dương tính mạnh nhận thấy mắt thường, kết đọc quang phổ kế (spectrophotometrical) độ dài sóng thích hợp Trong trường hợp này, hấp phụ quang phổ lớn 0,1 quan phổ cho thấy phản ứng dương tính; chủng huyết virus FMD nhận diện Các giá trị gần với 0,1 xác nhận xét nghiệm lại hay khuyếch đại kháng nguyên qua cấy truyền mô nuôi cấy xét nghiệm dịch phù tác động gây bệnh tích tế bào phát triển Một giao thức thích hợp nêu Các giao thức khác hành thường có định dạng tiêu chí diễn giải kết khác biệt (3, 6) Tùy theo loài bị nhiễm nguồn gốc địa lý mẫu, thực song song xét nghiệm virus SVD hay virus viêm miệng mụn nước (vesicular stomatitis – VS) Lý tưởng chẩn đoán phân biệt đầy đủ thực tất tình trạng mụn nước Kháng huyết thỏ kháng nguyên 146S chủng bảy chủng huyết virus FMD (cộng với virus SVD hay VS cần) sử dụng bẫy kháng thể hàm lượng tối ưu định đệm carbonate/bicarbonate, pH 9,6 Các kháng nguyên đối chứng sửa soạn từ dòng chọn chủng huyết bảy chủng huyết virus FMD (cộng với virus SVD hay virus VS thích hợp), ni cấy tế bào đơn lớp BHK-21 (đối với virus SVD hay VS dùng tế bào IB-RS-2) Các dịch phù chưa tinh lọc sử dụng chuẩn độ phiến ELISA Độ pha loãng tốt độ pha loãng mà cho hấp phụ vùng dải cao đường biểu diễn hiệu giá (mật độ quang học khoảng 2,0), cho độ pha loãng gấp năm lần kháng nguyên đối chứng sử dụng xét nghiệm cho thêm hai mật độ quang học thấp với đường biểu diễn hiệu giá có PBS chứa 0,05% Tween 20 thị màu đỏ phenol sử dụng làm tác nhân pha loãng (PBST) Kháng huyết chuột lang (guinea-pig) chuẩn bị cấy truyền vào chuột lang kháng nguyên 146S bảy chủng huyết virus FMD (cộng với virus SVD cần) đóng khối sẵn huyết bò bình thường (norman bovine serum – NBS), sử dụng để phát kháng thể Hàm lượng tối ưu xác định trước chuẩn bị PBS có chứa 0,05% Tween 20 5% sữa tách béo (nonfat skimmed milk) (PBSTM) Globulin miễn dịch kháng huyết thỏ (hay cừu) kháng với huyết chuột lang, kết hợp với enzyme peroxidase cải ngựa (horseradish peroxidase) đóng khối sẵn với NBS, sử dụng hàm lượng tối ưu định PBSTM Một thay cho kháng huyết chuột lang hay thỏ, dùng kháng thể đơn giá (monoclonal antibodies – MAbs) thích hợp để tráng lên phiến ELISA để bắt giữ kháng thể hay dùng kết hợp peroxidase (peroxidase-conjugated) để phát kháng thể o Phương pháp xét nghiệm i ii iii iv v Các phiến ELISA tráng giếng 50 µl khuyết thỏ kháng virus đệm 0,05 M carbonate/bicarbonate, pH 9,6 Các hàng A đến H cho vào kháng huyết với chủng O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Asia SVD virus hay VS virus (tùy chọn) Để qua đêm 4oC nơi thuận lợi hay đặt vào máy lắc quay vòng (orbital shaker) tốc độ 100-200 vòng/phút buồng ủ 37oC Huyễn dịch mẫu xét nghiệm (với 10% huyễn dịch mẫu hay dịch phù khơng pha lỗng tế bào ni cấy qua lọc) Các phiến ELISA rửa năm lần PBS Trên phiến, cho vào giếng cột 4, 12 giếng 50 µl PBST, thêm 50 µl PBST vào giếng 1, hàng từ A đến H phiến Ở giếng hàng A phiến 1, thêm 12,5 µl kháng nguyên đối chứng type O, giếng hàng B thêm 12,5 µl kháng nguyên đối chứng type A; tiếp tục kháng nguyên đối chứng types C, SAT 1, SAT 2, SAT SVDV hay VS (nếu thích hợp) theo thứ tự từ giếng hàng từ C đến H Trộn hỗn hợp giếng hàng A đến H chuyển 12,5 µl từ giếng sang giếng (từ hàng A đến hàng H), trộn chuyển 12,5 µl từ giếng sang giếng 3, trộn bỏ 12,5 µl từ giếng (từ hàng A đến hàng H) (điều tạo nên chuỗi độ pha loãng gấp lần kháng nguyên đối chứng) Ở cần thay đầu hút máy hút tự động (micropipette) lần hút kháng nguyên khác Phần lại phiến đổ vào mẫu xét nghiệm Thêm 50 µl mẫu vào giếng 5, hàng từ A đến H, mẫu thứ nhì thêm vào lượng tương đương vào cột 9, 10 11, từ hàng A đến H Nếu có nhiều hai mẫu đem xét nghiệm lúc, phiến ELISA khác sử dụng sau: Chia 50 µl PBST vào giếng (các hàng từ A đến H) cốt 1, 12 (các cột đệm đối chứng) Lưu ý kháng nguyên đối chứng không cần thiết phiến Những mẫu xét nghiệm thêm vào với thể tích 50 µl hàng từ A đến H vào cột 1, 2, 3; 5, 6, 7; 9, 10, 11 vi vii viii ix x xi xii Đậy nắp đặt phiến vào máy lắc quay vòng 37oC Rửa phiến ngâm nhập vào PBS – rửa ba lần nêu trút kiệt dịch rửa dư Thấm khơ phiến Chuyển 50 µl độ pha loãng huyết chuột lang vào giếng phiến theo thứ tự, thí dụ lấy từ hàng A đến H kháng huyết chủng huyết O, A, C, SAT 1, SAT 2, SAT 3, Asia SVD virus hay VS virus (tùy chọn) Đậy nắp phiến đặt trở vào máy lắc quay vòng Ủ 37oC Các phiến rửa tiếp ba lần nữa, 50 µl globulin miễn dịch kháng chuột lang kết hợp với enzyme peroxidase cải ngựa (horseradish peroxidase) cho vào giếng Các phiến ủ 37oC trong máy lắc quay vòng Các phiến lại rửa ba lần cho vào giếng 50 µl dung dịch chất nền, chứa 0,05% H2O2 cộng với orthophenylene diamine hay chất màu thích hợp khác Phản ứng làm ngưng sau 15 phút thêm vào 50 µl acid sulphuric 1,25 M Các phiến đọc 492 nm quan phổ kế kết nối với máy vi tính o Xét nghiệm cố định bổ thể (Complement fixation test) Thơng thường, ELISA thích hợp xét nghiệm cố định bổ thể (CF) có độ nhạy khơng bị ảnh hưởng yếu tố tiền hay kháng bổ thể Nếu tác nhân thử ELISA khơng sẵn có, xét nghiệm CF thực sau: Kháng huyết chủng bảy chủng virus FMD pha dịch đệm veronal (veronal buffer diluent – VBD) bước pha loãng 1,5 lần từ độ pha lỗng ban đầu 1/16 để lấy 25 µl độ pha lỗng kháng huyết giếng có đáy hình chữ U phiến vi hiệu giá Thêm vào giếng 50 µl bổ thể đơn vị quốc tế, thêm 25 µl (các) huyễn dịch mẫu xét nghiệm Hệ thống xét nghiệm ủ 37 oC torng trước thêm 25 µl hồng cầu cừu chuẩn độ 1,4% (standardised sheep red blood cells (SRBC) VBD làm tăng nhạy đơn vị quốc tế huyết thỏ kháng SRBC Các tác nhân thử ủ 37oC thêm 30 phút phiến sau ly tâm đọc Các đối chứng thích hợp để xét nghiệm (các) huyễn dịch mẫu xét nghiệm, kháng huyết thanh, tế bào bổ thể kết hợp Các hiệu giá CF biểu diễn mẫu số độ pha loãng huyết tạo nên dung huyết 50% Một hiệu giá CF ≥36 coi phản ứng dương tính Các giá trị hiệu giá từ 24 phải xác nhận xét nghiệm lại kháng nguyên mà khuyếch đại qua cấy truyền mô nuôi cấy c) Các phương pháp nhận acid nucleic RT-PCR sử dụng để khuyếch đại đoạn gen di truyền virus FMD chất liệu chẩn đoán, bao gồm biểu bì, sữa, huyết mẫu OP (7, 13) RT kết hợp với PCR thời gian thực (real-time PCR) có độ nhạy tương đương với phân lập virus (2, 51) phương pháp tự động hóa làm gia tăng công suất xử lý mẫu (52) Các đoạn mồi đặc hiệu thiết kế để phân biệt chủng bảy chủng virus FMD Kỹ thuật lai ghép phòng thí nghiệm (in situ) phát triển để điều tra diện RNA virus FMD mẫu mô (63) Những kỹ thuật áp dụng phòng thí nghiệm chun mơn, nhiên hệ thống đơn giản hóa cho khả áp dụng thực địa phát triển (18) Điện di keo agarose dựa vào xét nghiệm RT-PCR (Agarose gel-based RTPCR assay) Phương pháp áp dụng Phòng thí nghiệm Tham chiếu OIE Pirbright mô tả (50) Xét nghiệm RT-PCR gồm ba phương pháp thành công i) chiết xuất khuôn mẫu RNA từ xét nghiệm hay mẫu đối chứng với ii) RT RNA chiết xuất, iii) trình khuyếch đại PCR sản phẩm RT iv) trình phát sản phẩm PCR điện di chất keo agarose (agarose gel electrophoresis) Phương pháp xét nghiệm i ii iii iv v Pha 200 µl mẫu xét nghiệm vào ml TRIzol® Reagent ống vô trùng Bảo quản -70oC cần cho chiết xuất RNA Chuyển ml dung dịch từ bước i vào ống sạch, vô trùng chứa 200 µl chloroform Trộn khoảng 10-15 giây để nhiệt độ phòng phút Ly tâm 15 phút 20.000 g Chuyển 500 µl dạng lỏng vào ống sạch, vơ trùng có chứa µl glycogen (20 mg/ml) thêm 500 µl iso-propyl-alcohol (propan-2-ol) Trộn vài giây Để nhiệt độ phòng 10 phút, sau ly tâm 10 phút 20,000 g vi vii viii ix x xi xii xiii xiv xv xvi Đổ bỏ dịch phù ống thêm ml ethanol 70% Trộn hỗn hợp vài giây Ly tâm 10 phút 20.000 g Cẩn thận loại bỏ dịch phù khỏi ống, cẩn thận để khơng làm tróc hay phần phần lắng đáy ống Để khơ ống nhiệt độ phòng 2-3 phút Tái hợp nước cho trầm lắng thêm vào ống 20 µl nước có nuclease tự (nuclease- free water) Để mẫu chiết xuất RNA nước đá bước RT tiến hành Nếu khơng bảo quản -70oC Với mẫu kiểm tra, thêm µl random hexamer (20µg/ml) µl nước có nuclease tự vào ống tiểu ly tâm dung tích 0,5 ml Khuyên chuẩn bị đủ số lượng dịch pha chung lần cho tổng số lượng mẫu kiểm tra, cộng dư thêm lượng mẫu Thêm µl RNA từ công đoạn chiết xuất nêu tích 12 µl ống Trộn cách nhẹ nhàng đưa ống hút di chuyển lên xuống Ủ 70oC phút Để nguội nhiệt độ phòng 10 phút Trong thời gian ủ 10 phút, chuẩn bị hỗn hợp cho phản ứng RT nêu cho mẫu Chuẩn bị tổng số lượng hỗn hợp phản ứng ống tiểu ly tâm dung tích 1,5 ml cho tồn số lượng mẫu đem kiểm tra với cộng dư thêm lượng mẫu Đệm cho đoạn đầu, x chuỗi (4µl); albumin huyết bò (đã acetyl hóa – acetylated), 1mg/ml (2 µl); dNTPs, 10mM hỗn hợp dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 µl); DTT, M (0.2 µl); Moloney Murine Reverse Transcriptase, 200 U/ µl (1 µl) xvii xviii xix xx Thêm µl hỗn hợp phản ứng vào 12 µl đoạn mồi ngẫu nhiên/hỗn hợp RNA Trộn khuấy nhẹ nhàng ống hút Ủ 37oC 45 phút Giữ sản phẩm RT nước đá bước khuếch đại tiến hành, không bảo quản -20oC Chuẩn bị hỗn hợp PCR nêu cho mẫu Khuyên chuẩn bị tổng số lượng hỗn hợp lần đủ cho mẫu kiểm tra với cộng dư thêm cho mẫu Nước có nuclease tự (nuclease-free water) (35 àl); m cho phn ng PCR, 10ì chui (5 µl); MgCl2, 50 mM (1.5 µl); dNTPs, 10 mM hỗn hợp dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1 µl); đoạn mồi 1, 10 pmol/µl (1 µl); đoạn mồi 2, 10 pmol/µl (1 µl); Taq Polymerase, đơn vị quốc tế/µl (0.5 µl) xxi xxii xxiii Thêm 45 µl hỗn hợp phản ứng PCR vào giếng phiến PCR hay vào ống tiểu ly tâm cho mẫu kiểm tra, sau cho µl sản phẩm RT tích phản ứng cuối 50 µl Đảo xoay phiến hay ống phút để trộn chất chứa giếng Đặt phiến vào máy gia nhiệt chu kỳ để khuếch đại PCR đặt chương trình sau: 94°C phút: chu kỳ; 94°C phút, 55°C phút, 72°C phút: 30 chu kỳ; 72°C phút: chu kỳ nhân lên hay vài lần cấy truyền từ virus giống gốc sử dụng để gây nhiễm mội trường tế bào nuôi cấy thành phẩm tỷ lệ khoảng CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc – plate forming unit) 100 tế bào Khi có thể, nguồn gốc xác dòng phân lập phải ghi chép phải bao gồm chi tiết vị trí, lồi chủng loại chất liệu mà từ lấy virus Lịch sử cấy truyền ngoại môi trường virus phải ghi chép Cũng phải cân nhắc đến giảm thiểu nguy truyền lây tác nhân gây bệnh tích nhũn não truyền nhiễm (transmissible spongiform encephalopathy agents – TSEs) cách đảm bảo chất liệu có nguy TSE không sử dụng làm nguồn virus hay môi trường dùng cho sinh sôi virus Phương pháp sản xuất Phương pháp khuyến cáo cho cấy truyền giống virus để sản xuất kháng nguyên, nuôi cấy virus FMD môi trường giá thể quy mô lớn hay đơn lớp sử dụng lớp tế bào điều kiện vô trùng Môi trường tế bào ni cấy sơ cấp (primary cell culture) chấp nhận cho sản xuất vaccin số quốc gia, phương pháp sản xuất hoàn toàn tuân thủ với Thực hành Sản xuất Tốt, áp dụng phương pháp sản xuất chấp nhận để đảm bảo làm bất hoạt tất tác nhân ngoại lai có thực xét nghiệm đầy đủ trình sản xuất thành phẩm, để đảm bảo tính ổn định tính an tồn thành phẩm Điều cốt yếu tất dụng cụ hút pha bình chứa phải hồn tồn vơ trùng, đảm bảo khơng có khu vực hệ thống sản xuất nơi chứa chấp visinh vật Ngoài quan tâm chung tính vơ trùng, quan trọng virus bị tổn thương enzyme phân hủy protein, giống vi khuẩn (22) Việc kiểm soát pH nhiệt độ tiêu chuẩn độ acid nhiệt độ làm virus không bền bỉ (21) Nhiệt độ tối ưu cho tế bào, virus phát triển khoảng 37oC 26oC cho làm bất hoạt, điều kiện phải kiểm sốt cách xác Trong giai đoạn khác sản xuất, nhiệt độ phải giảm xuống từ 4-6 oC Virus phải trì khoảng pH 7,6 không 7,0 Một dòng virus thích hợp sử dụng để gây nhiễm giá thể hay đơn lớp lớp tế bào thiết lập, BHK Những tế bào nuôi cấy phải chứng minh vi sih vật vấy nhiễm Trong trình phục hồi virus, chúng nhân giống môi trường dinh dưỡng với thể tích mật độ tế bào phù hợp cho cấy giống Theo ước tính, mơi trường nuôi cấy cấy với mật độ tế bào ban đầu từ 0,2-0,5 x 10 tế bào/ml, mà cho phép sinh sôi thành 2-5 x 106 tế bào/ml trước gây nhiễm virus Khi virus đạt đến hiệu giá tối đa, xác định theo khả gây nhiễm xét nghiệm CF hay xét nghiệm khác, mơi trường ni cấy gạn lọc, thường xử lý chloroform sau ly tâm lọc Sau virus làm bất hoạt thêm vào ethyleneimine, thường dạng binary ethyleneimine (BEI) Ethyleneimine thường chuẩn bị pha loãng, đến nồng độ 0.1 M, 2-bromoethylamine hydrobromide dung dịch 0.2 N sodium hydroxide, ủ 37oC (9, 10) BEI sau pha vào giá thể virus đặt 26oC, nồng độ cuối mM Quá trình làm bất hoạt thường liên tục 24 giờ, sau thêm liều lượng BEI thứ nhì với 24 Thời gian cho xử lý BEI nhiệt độ áp dụng làm bất hoạt phải đánh giá điều kiện thực tế thiết bị sử dụng Sau làm bất hoạt, tồn dư BEI thu hoạch trung hòa thêm vào dung dịch sodium thiosulphate nồng độ cuối 2% Để làm giảm khả virus tiếp xúc với BEI mà sống lần làm bất hoạt thứ nhì, điều cốt yếu chuyển chất chứa đến bình chứa vơ trùng thứ nhì để phản ứng hồn tất 48 Virus làm bất hoạt cô đậm siêu lọc, chất ngưng kết polyethylene glycol hay chât hấp phụ polyethylene oxide (1, 62), virus bất hoạt đậm tinh lọc thêm biện pháp sắc ký (chromatography) Những kháng ngun đậm bảo quản -72oC hay nhiệt độ thấp nhiều năm, cần, dùng chế tạo vaccin cần đến chất đệm thích hợp thêm vào phụ gia (24) Các vaccin FMD thông thường tổng hợp tan nước (aqueous) hay phụ gia dầu (oil adjuvant) Vaccin tan nước, thường sử dụng cho bò, chế tạo hấp phụ virus vào chất keo aluminium hydroxide, phụ gia thường dùng phối trộn vaccin thành phẩm Các thành phần khác phối trộn thành phẩm bao gồm chất chống bọt (antifoam), màu đỏ phenol (nếu phép quốc gia đặt hàng), albumin sữa thủy phân (lactalbumin hydrolysate), canh tryptose phosphate, amino acids, vitamins muối đệm (buffer salts) Một phụ gia thứ nhì thêm vào saponin, lấy từ loài Nam Mỹ Quillaja saponaria mollina, chất bảo quản khác merthiolate hay chloroform Các vaccin phụ gia dầu (oil-adjuvanted vaccines) thường tổng hợp sử dụng dầu khoáng, Marcol Drakeol, làm phụ gia Những chế phẩm có số lợi so với vaccin bình thường aluminium hydroxide/saponin, khơng thể lợi hiệu heo Các vaccin sử dụng rộng rãi để cấp cho bò Nam Mỹ tạo nên miễn dịch lâu dài Dầu khống thường trộn trước với tác nhân nhũ hóa, mannide monooleate, trước tổng hợp thành vaccin theo tỷ lệ, thành dạng lỏng vaccin, nhũ hóa sử dụng sữa kết dính hay nhũ hóa học máy sóng siêu âm Các dạng nhũ hóa phức tạp (nước/dầu/nước) tạo q trình nhũ hóa dạng lỏng có chứa lượng nhỏ chất tẩy Tween 80 (37) Một chọn lựa khác sử dụng dạng nhũ dầu “sử dụng ngay” Chất dầu chứa esters acid octadecenoic 2,5 anhydro-d-mannitol, thí dụ, dạng chế sẵn nhũ dầu kép hay hỗn hợp (nước/dầu/nước) mà có đặc tính bền bỉ lẫn đặc tính độ nhớt thấp, mà khơng cần đến thiết bị tạo huyền phù phức tạo (11, 26) Khi sử dụng thành phần mới, bao gồm nhũ dầu, vaccin, điều quan trọng phải tính đến tồn dư sản phẩm thực phẩm lấy từ loài thú vật cấp vaccin, để đảm bảo vaccin cấp phép liên quan đến an toàn người tiêu thụ thực phẩm Những yếu cầu làm giới hạn đáng kể việc chọn lựa chất phụ gia để sử dụng cho lồi thú vật dùng làm thực phẩm Kiểm sốt q trình sản xuất Thơng thường, hiệu giá virus đạt mức tối ưu vòng 24 sau nuôi cấy tế bào Thời điểm chọn lựa để thu hoạch mẻ cấy dựa vào số đánh giá; thí dụ đánh giá tế bào chết Hàm lượng virus đánh giá xét nghiệm khả gây nhiễm, kỹ thuật thể mật độ sucrose (sucrose density gradient) (23) hay huyết học Thích hợp sử dụng phương pháp để đo lường khối kháng nguyên, phân tích mật độ sucrose, đo lường khả gây nhiễm, hai đặc tính khơng cần phải trùng khớp phương pháp khác bổ sung cho phương pháp Trong trình làm bất hoạt virus, phải lấy mẫu theo thời điểm khoảng cách đặn với mục dích theo dõi tốc độ tuyến tính q trình làm bất hoạt Các hiệu giá virus mẫu xác định cấy vào tế bào nuôi cấy mà chứng minh có mẫn cảm cao với virus FMD, BHK hay tế bào tuyến ức bò (bovine thyroid cell) Những tế bào nuôi cấy cho phép xét nghiệm đầy đủ theo thống kê điều kiện có khả lặp lại Cơ số 10 (log10) khả gây nhiễm mẫu thời điểm biểu diễn theo thời gian, trình làm bất hoạt khơng coi hồn tồn phần cuối đường biểu diễn phép ngoại suy khơng cho thấy có hạt gây nhiễm 10 lít dung dịch chế phẩm cuối giai đoạn làm bất hoạt Xét nghiệm thành phẩm a) Tính an tồn (Safety) Các xét nghiệm tính vơ hại (innocuity) (khả khơng gây nhiễm) thực hiệu khối virus làm bất hoạt cô đậm (xem Đoạn D.3 D.5 đây) Tuy nhiên xác nhận tính vơ hại xét nghiệm virus lấy từ vaccin, khả áp dụng không đồng thuận công thức không tin cậy cho xét nghiệm kháng ngun đậm Thí dụ, saponin ảnh hưởng mạnh đến trình tách xuất virus FMD khỏi vaccin aluminium hydroxide/saponin (25) Nếu phương pháp tách xuất thích hợp cho cơng thức đặc trưng, xét nghiệm đánh giá cấy song song mẫu vaccin tìm dấu vết virus sống (12) Với mục đích có chấp thuận cấp phép, thử nghiệm vaccin phải xét nghiệm độc tính cục tồn thân theo đường cấp vaccin khuyến cáo, thử nghiệm nội môi trường với số lượng bò thích hợp (27) Các xét nghiệm phải thực với liều gấp đôi liều nhắc lại sử dụng vaccin tổng hợp chứa tối đa hàm lượng phép số lượng kháng nguyên, với giao thức tương tự nêu để xét nghiệm tính an tồn vaccin b) Tính hiệu lực (potency) Bò tháng tuổi, từ vùng bệnh FMD mà trước chưa cấp vaccin FMD kháng thể kháng chủng khác virus FMD xét nghiệm Chia thành ba nhóm khơng năm bò nhóm, cấp vaccin theo đường cấp khuyến cáo nhà sản xuất Vaccin phải cấp liều lượng khác theo nhóm bò, cách tiêm thể tích vaccin khác Thí dụ, nhãn vaccin nêu tiêm 2ml tương ứng liều vaccin, ¼ liều vaccin có tiêm 0,5 ml, 1/10 liều có tiêm 0,2 ml Những thú nhóm đối chứng gồm hai thú không tiêm vaccin thử thách lúc, tuần (với vaccin tan nước) hay đến tuần (với vaccin nhũ dầu) sau cấp vaccin, giá thể chứa virus bò mà có độc lực đầy đủ tương đồng với chủng virus vaccin đem xét nghiệm, cách truyền vào hai vị trí phần biểu bì lưỡi bò với lượng tương đương 10.000 ID 50 (50% liều gây nhiễm cho bò – bovine infectious dose) (0,1 ml vị trí) Các thú quan sát ngày Các thú khơng bảo hộ thể bệnh tích nơi khác lưỡi Các thú đối chứng phải phát triển bệnh tích ba chân Từ số lượng thú bảo hộ nhóm, tính PD 50 (50% liều bảo hộ cho bò – bovine protective dose) chứa vaccin Ở có nhiều phương pháp khác để tính PD 50, phương pháp dựa vào phương pháp Kärber (38) thường thích hợp Vaccin phải chứa PD 50 liều bò, áp dụng cho thủ tục phòng ngừa, nhiên PD 50 liều thường thích hợp Trong số trường hợp, vaccin có hiệu lực cao cản trở phát triển bệnh tích cục lưỡi vị trí tiêm thử Với xét nghiệm PGP (tỷ lệ phần trăm bảo hộ bệnh nhiễm chung chân móng – percentage of protection against generalised foot infection), nhóm 16 bò huyết âm tính với FMD có lứa tuổi tháng, với đặc điểm nêu xét nghiệm PD 50, cấp vaccin với liều lượng đủ, theo đường cấp khuyến cáo nhà sản xuất Những thú nhóm đối chứng gồm hai thú không cấp vaccin, thử thách vào lúc tuần hay lâu sau cấp vaccin, dòng virus thử thách, giá thể chứa virus bò mà có độc lực đầy đủ tương đồng với chủng virus vaccin xét nghiệm, cách cấy vào tổng cộng 10.000 BID 50 (50% liều gây nhiễm cho bò), vào biểu bì hai vị trí mặt lưỡi Các thú khơng có bảo hộ thể bệnh tích nơi khác ngồi lưỡi, vòng ngày sau cấy truyền Các thú đối chứng phải phát triển bệnh tích vị trí ba chân; với áp dụng cho phòng ngừa, vaccin phải bảo hộ 12 thú 16 cấp vaccin Các thú quan sát vào 7-8 ngày sau tiêm virus thử thách (61) Các xét nghiệm tính hiệu lực loài mục tiêu khác, cừu, dê hay trâu khác biệt khơng chuẩn Thơng thường, xét nghiệm thành cơng bò coi đủ chứng cho chất lượng vaccin việc sử dụng vaccin loài khác Trong hoàn cảnh mà vaccin sản xuất để sử dụng chủ yếu cho loài khác ngồi bò, xét nghiệm tính hiệu lực thích hợp thực loài mục tiêu Đối với trâu Châu Phi hay Châu Á (Bubalus bubalis) cừu, tự nhiên thường không xuất bệnh lồi này, xét nghiệm tính hiệu lực dựa vào số chất lượng vaccin cố gắng thực xét nghiệm cho tính hiệu lực nhằm vào phát dấu hiệu lâm sàng loài Một giao thức thử nghiệm bò điều chỉnh thử nghiệm vaccin FMD heo, sử dụng ba nhóm có năm heo (15 heo), khơng tháng tuổi khỏi kháng thể trung hòa chủng huyết khác virus FMD Một nhóm cấp vaccin với liều lượng đủ cho heo theo khuyến cáo nhà sản xuất, nhóm nhận liều lượng giảm, thí dụ ¼ liều, nhóm thứ ba nhận liều hơn, 1/16 liều Thơng thường, đáp ứng với vaccin nhũ dầu cho phép phát triển lâu hơn, 28 ngày sau cấp vaccin, ba nhóm heo, cộng với hai heo đối chứng không cấp vaccin, đem thử thách Tuy nhiên, tùy theo công thức vaccin, khoảng thời gian phải giảm xét nghiệm bò Điều quan trọng nhóm cấp vaccin với liều lượng khác tách riêng trình thử nghiệm loại trừ sớm tốt chúng thể phát triển FMD đặc trưng, để tránh phơi nhiễm mức đến thú lại Thử thách tiêm biểu bì (intradermal) nơi mấu lồi gót chân (heel bulb) chân với 10.000 TCID50 (0,2 ml), liều lượng tính tốn ni cấy virus thử thách tương đồng với dòng virus sử dụng chế tạo vaccin, cấy vào tế bào ni cấy thích hợp lấy từ heo, virus thử thách cho bệnh đặc trưng heo Cách khác, virus thử thách cấp vào vị trí phần cổ phía sau tai, sử dụng liều lượng virus mà gây bệnh đặc trưng theo đường Các thú quan sát hàng ngày 10 ngày sau thử thách, để phát dấu hiệu lâm sàng FMD Cả hai heo đối chứng phải phát triển dấu hiệu lâm sàng chân Từ số lượng thú bảo hộ nhóm, hàm lượng PD50 vaccin tính Ở có phương pháp khác để tính tốn PD50 (31), bao gồm phương pháp dựa vào Kärber Vaccin phải chứa PD50 liều cho heo Tương tự, giao thức thử nghiệm PGP bò điều chỉnh áp dụng heo, sử dụng nhóm 16 thú cấp vaccin hai không cấp vaccin làm đối chứng Thử thách tiêm biểu bì nơi mấu lồi gót chân chân với 10.000 TCID 50 (0,2 ml) virus thử thách có độc lực mà tương đồng với dòng virus sử dụng chế tạo vaccin, mà virus thử thách biết tạo dấu hiệu lâm sàng heo Các thử nghiệm gián tiếp, bao gồm đo lường sau cấp vaccin, trung hòa kháng thể tế bào ni cấy, hay xét nghiệm kháng thể ELISA, hay tiêm huyết có kháng thể bảo hộ vào chuột non, áp dung để đánh giá tính hiệu lực vaccin, với điều kiện đánh giá thống kê thiết lập có đủ khả liên hệ kết thu thử nghiệm chủng huyết virus vaccin có liên quan với thử nghiệm tính hiệu lực bò (60) Thí dụ, tỷ lệ bảo hộ mong muốn áp dụng để phân tích huyết nhóm 16 bò cấp vaccin để biểu diễn xác suất thú bảo hộ đo lường kháng thể trung hòa, ELISA hay kháng thể bảo hộ Trong nhóm thú vật mà cấp vaccin với liều lượng đầy đủ, tỷ lệ bảo hộ mong muốn phải tương đương hay lớn 75% thử nghiệm 16 thú, 70% thử nghiệm 30 thú thực nghiệm Sự diện nhiều chủng huyết vaccin không hạn chế sản sinh khác thể chủng huyết khác hay có liên quan hiệu giá kháng thể bảo hộ c) Tính tinh khiết (Purity): xét nghiệm kháng thể kháng protein không cấu trúc Quy tắc Sức khỏe Động vật Trên cạn (Terrestrial Animal Health Code) OIE quy định rằng, vaccin sử dụng để thử nghiệm thú cấp vaccin kháng thể kháng protein không cấu trúc (non-structured protein) Cũng vậy, quốc gia mong muốn ghi nhận bệnh FMD sử dụng vaccin phải chứng minh vắng mặt virus lưu hành, cách thể thú cấp vaccin kháng thể kháng NSPs sinh kết nhiễm bệnh tự nhiên Kết là, kháng nguyên virus FMD sử dụng để tổng hợp vaccin mà sử dụng hồn cảnh phải làm tinh khiết để giảm thiểu hàm lượng NSP Với kỹ thuật sản xuất nay, có khả loại trừ phần lớn NSPs, cho vaccin khiến tạo ít, có khơng có, kháng thể đặc hiệu với protein không cấu trúc (NSP) Dưới hoàn cảnh này, việc phát kháng thể kháng NSP cho chứng thú cấp vaccin bị phơi nhiễm với virus FMD Các nhà sản xuát vaccin mong muốn phát triển khả bao gồm tuyên bố vaccin họ không tạo nên kháng thể hay nhiều protein khơng cấu trúc, sử dụng kết hợp với xét nghiệm chẩn đốn thích hợp Ngồi ra, liệu bổ sung chứng minh trình sản xuất bao gồm làm tinh khiết, nhà sản xuất phải chứng minh khơng có khả cho miễn dịch protein không cấu trúc, phần thủ tục cấp phép tuyên bố tài liệu sản phẩm họ Một phương pháp thử nghiệm áp dụng cấp vaccin cho số lượng bê thích hợp, tốt cấp gấp đôi liều lượng vaccin đem thử nghiệm, có chứa số lượng tối đa kháng nguyên theo chấp thuận cấp phép (những bê bê sử dụng cho thử nghiệm tính an tồn nêu Đoạn D.4.a chương này) Các bê phải cấp vaccin ba lần qua giai đoạn từ đến tháng sau xét nghiệm vào 30-60 ngày sau lần cấp vaccin cuối để phát kháng thể kháng NSPs, cách áp dụng xét nghiệm nêu Đoạn B.2.d chương Các kết âm tính xét nghiệm NSP chứng minh cho tuyên bố vaccin không tạo nên kháng thể kháng protein không cấu trúc Ở mức độ lơ, việc xác nhận tính tinh khiết vaccin thể chứng minh khơng có gia tăng phản ứng protein khơng cấu trúc huyết từ thú sử dụng thử nghiệm tính hiệu lực, huyết thu từ 30 ngày sau cấp vaccin lần đầu trước thử thách, đem so sánh với huyết thú trước cấp vaccin d) Độ dài miễn dịch Để thiết lập mức độ đầy đủ miễn dịch, người ta thường đưa liệu trình ban đầu gồm hai lần cấp vaccin, từ 2-4 tuần trở đi, sau tái chủng theo 4-12 tháng Tần suất tái chủng tùy theo tình hình dịch tễ dạng với chất lượng vaccin sử dụng Khi việc tiếp cận thú vật khó khăn, thích hợp sử dụng vaccin phụ gia nhũ dầu vào tháng tuổi thứ năm tuổi, sau tái chủng ngừa hàng năm Khi có thể, nhà sản xuất vaccin phải chứng minh độ dài miễn dịch công thức chuyên biệt họ loài mà họ định Với bê sinh từ bò cấp vaccin, lần chủng ngừa thứ trì hỗn đến mức phép cạn kiệt kháng thể mẹ truyền Thời gian trì hỗn phải khơng q tháng, lứa tuổi này, tỷ lệ cao mong muốn để đáp ứng cách hiệu vaccin Với bê sinh từ bò mẹ khơng cấp vaccin, chủng ngừa lần đầu cấp sớm từ tuần tuổi, số loại vaccin (8) e) Tính ổn định (Stability) Thời gian tồn vaccin FMD bình thường từ 1-2 năm oC (giới hạn tối đa 28oC), vaccin không bền với nhiệt không bảo quản đông đá lẫn nhiệt độ chuẩn 4oC Tính ổn định tất loại vaccin, loại vaccin nhũ dầu, phải chứng minh phần nghiên cứu xác định thời gian tồn tại, để cấp phép f) Chất bảo quản (Preservatives) Chất bảo quản thường sử dụng chloroform merthiolate Merthiolate sử dụng hàm lượng thành phẩm 1/30.000 (w/v) g) Các cảnh báo (các nguy cơ) Các loại vaccin FMD vọ hại nguy độc hại cho người sử dụng Cần phải cẩn thận để tránh tự tiêm chích với loại vaccin nhũ dầu Kiểm sốt vaccin a) Tính vơ trùng (Sterility) Khối kháng nguyên vaccin, chất phụ gia, chất đệm pha thành phẩm tổng hợp phải trải qua xét nghiệm tính vơ trùng Điều thực cách trực tiếp với thành phần vaccin thành phẩm, phương pháp thích hợp thu thập vi sinh vật vấy nhiễm lọc qua màng lọc cho chất liệu kiểm tra để phát vi sinh vật diện nuôi cấy màng lọc môi trường nuôi cấy Phương pháp cấy màng lọc cho phép loại trừ chất bảo quản… mà cản trở việc phát vi sinh vật Các hướng dẫn kỹ thuật môi trường nuôi cấy, mà cho phép phát phổ rộng vi sinh vật, nêu Dược điển Châu Âu 2008 (European Pharmacopoeia 2008) (27; tham khảo Chương 1.1.9 Các xét nghiệm tính vô trùng khỏi vấy nhiễm chất liệu sinh học) b) Tính vơ hại (Innocuity) Xét nghiệm tính vơ hại xét nghiệm q trình sản xuất, mà thực cho kháng ngun Sau q trình làm bất hoạt, mẫu kháng nguyên làm bất hoạt đại diện cho 200 liều đem xét nghiệm khỏi virus gây nhiễm, cấy vào mơi trường tế bào ni cấy đơn lớp, thích hợp có nguồn gốc loại tế bào sử dụng cho sản xuất kháng ngun Có thể thích hợp đậm kháng ngun để xét nghiệm tính vô hại, trường hợp phải cho thấy chất liệu cô đậm không ảnh hưởng độ nhạy hay khả đọc xét nghiệm Các phiến tế bào kiểm tra hàng ngày suốt ngày, sau mơi trường cạn dinh dưỡng từ lớp tế bào cấy truyền sang đơn lớp tế bào nguồn bổ sung thêm môi trường nuôi dưỡng Áp dụng phương pháp này, dấu vết virus khuếch đại cấy truyền phát dựa vào tác động gây bệnh tích tế bào Thường áp dụng hai đến ba lần cấy truyền từ chế phẩm virus gốc Một cải tiến phương pháp đông lạnh-giải đơng đơn lớp cũ để phóng thích virus từ nội bào, mà phát cấy truyền thêm c) Tính an tồn (Safety) Xét nghiệm tính an tồn thành phẩm thực phát phản ứng cục hay toàn thân Xét nghiệm xác nhận tính vơ hại, khơng nhạy xét nghiệm ngoại mơi trường nêu Với mục đích cho phát hành vaccin, hai bò khỏe mạnh có huyết âm tính cấy truyền theo đường khuyến cáo cho cấp vaccin, với liều lượng gấp hai lần khuyến cáo nhà sản xuất Các thú quan sát phản ứng cục toàn thân vaccin, thời gian không 14 ngày Nếu thú có phát triển dấu hiệu FMD, vaccin khơng đạt với xét nghiệm tính an tồn Tương tự, độc tính mức ảnh hưởng đến vaccin phải đánh giá cản trở việc chấp thuận vaccin Một cách lý tưởng, vaccin chế tạo cho lồi khác ngồi bò phải xét nghiệm tính an tồn lồi mà vaccin hướng đến, cấp liều vaccin gấp đôi liều lượng mà nhà sản xuất khuyến cáo theo đường cấp khuyến cáo theo thể tích liều vaccin Các thú kiểm tra hàng ngày đối thiểu 14 ngày chứng độc tính hay dấu hiệu FMD d) Tính hiệu lực (Potency) Tính hiệu lực kiểm tra sản phẩm thành phẩm (xem Đoạn D.5.b) Số lượng kháng nguyên sử dụng số gián tiếp tính hiệu lực, với điều kiện có liên hệ trước thiết lập số lượng kháng nguyên, đáp ứng huyết học bảo hộ thử thách, với điều kiện xét nghiệm khác thích hợp cho đo lường đáp ứng huyết học trình miễn dịch thực mà có kết đảm bảo Bảo quản theo dõi hàm lượng kháng nguyên Các phương pháp bảo quản kháng nguyên cô đậm nhiệt độ siêu thấp để tổng hợp sau thành vaccin FMD, ngày trở thành chọn lựa phổ biến cho chế tạo vaccin Điều không trở thành sở cho bảo quản kháng nguyên chiến lược dự trữ dùng cho mục đích khẩn cấp (xem Chương 1.1.10 Các hướng dẫn Tiêu chuẩn Quốc tế Ngân hàng Vaccin), mà cho phép nhà sản xuất tiếp cận đến dòng kháng ngun khác mà tổng hợp thành vaccin cách nhanh chóng phân phối đến nơi tiêu thụ Dự trữ làm giảm việc trì hỗn đơn hàng, đặc biệt có u cấu vaccin đa giá Một lợi khác phương pháp xét nghiệm chất lượng đảm bảo cho việc xuất a) Tiêu chí trước dự trữ Cần phải nhớ kháng nguyên kiểm soát áp dụng tiêu chuẩn nêu Đoạn D.1-4 Phải ý đặc biệt đến: - khỏi tác nhân ngoại lai; Các kháng nguyên phải chứng minh khỏi tác nhân ngoại lai liệt kê cấp thẩm quyền cấp phép - độ nhạy lớp tế bào sử dụng để phát virus tồn dư; Các tế bào sử dụng để xét nghiêm virus sống tồn dư khơng thích hợp sử dụng lượng virus tương ứng µg kháng nguyên 146S mà cho hiệu giá 106 TCID50 (27) - biện pháp khẩn cấp điều khoản chấp nhận Giống Virus Gốc (Master Seed Virus – MSV), hậu phát hành vaccin tổng hợp Trong trường hợp xâm nhập dòng virus mà có tính kháng ngun khác với dòng virus vaccin hành, cần phải phát triển dòng vaccin từ đại diện phân lập từ thực địa Trước giống virus gốc chấp thuận, phải chứng minh tuân thủ đầy đủ hướng dẫn để chứng minh khỏi tác nhân ngoại lai liệt kê cấp phép, sử dụng xét nghiệm thông thường lẫn xét nghiệm đặc biệt, để thiết lập tính tương đồng dòng phân lập ứng viên Thời gian cần thiết bị kéo dài, để tạo kháng huyết đặc hiệu, sử dụng cho xét nghiệm thông thường trung hòa dòng virus mới, để phát tác nhân ngoại lai, để thực xét nghiệm đặc trưng khác mà yêu cầu kỹ thuật đặc biệt Do đó, tình hình khẩn cấp, mà khơng đủ thời gian để hồn tất xét nghiệm đầy đủ với virus giống gốc, điều khoản chấp nhận dòng virus phải dựa vào phân tích nguy khả vấy nhiễm tác nhân ngoại lai kháng nguyên chế tạo từ virus giống gốc Đánh giá nguy phải dự tính phương pháp đánh giá nhằm làm bất hoạt virus phải áp dụng thiết lập virus giống gốc virus bất hoạt hóa chất cách dễ dàng Các đảm bảo thêm dự tính u cầu q trình làm bất hoạt phải theo dõi ghi nhận sản xuất Để thúc đẩy nhanh việc phát hành vaccin tổng hợp có chứa dòng virus vaccin mới, chấp nhận xét nghiệm tính hiệu lực theo lô, thực sử dụng vaccin tổng hợp từ kháng nguyên đại diện cho kháng nguyên dùng cho sản xuất tất kháng nguyên mà có hướng làm thành phẩm Điều cho phép có tính hiệu lực kháng nguyên lấy từ giống virus gốc xác định, nhà sản xuất tiếp tục nhân giống cho kháng nguyên b) Tiêu chuẩn bảo quản Cơ sở vật chất (Facilities) Quan trọng tất phương diện bảo quản kháng nguyên cô đậm tuân thủ đầy đủ tiêu chuẩn quốc tế chấp nhận Thực hành Sản xuất Tốt (Good Manufacturing Practice) Tích trữ (containment) kháng nguyên bảo quản Các số lượng liều lượng hay thể tích bảo quản điều quan tâm quan trọng, đặc biệt có bảo quản chia sẻ Quốc gia Thành viên có biến thiên số lượng liều lượng cần đến thành viên tình hình khẩn cấp Có thể thuận tiện bảo quản số lượng kháng nguyên cô đậm đơn vị thuận tiện sử dụng (user-friendly units) phép sử dụng tốt không gian dự trữ cho khả sản xuất vaccin nhỏ Các vật chứa dung tích từ đến lít đáp ứng cho 30.000 liều vaccin bò Khi có yêu cầu dự trữ lớn dòng virus vaccin đặc biệt mà chi sản xuất thành vài đợt thành phẩm, quản lý ngân hàng vaccin phải cân nhắc cần thiết tổng hợp thành phối trộn thành phẩm đại diện cho mục đích xét nghiệm hay trộn thành riêng biệt, số thời điểm thích hợp, để dễ dàng cho tổng hợp cơng thức và/hoặc xét nghiệm Dạng vật chứa sử dụng để giữ kháng nguyên cô đậm điều quan trọng Dưới điều kiện nhiệt độ siêu thấp, việc sử dụng vật chứa làm vật liệu mà không bị giòn gãy, thí dụ tốt fluoropolymer dập khn dạng chai Chất polyfluoro-alkoxy (PFA) dập khn thành chai, có khả chịu nhiệt độ từ - 270oC đến +250oC Tạo nhãn cho kháng nguyên bảo quản Mặc dù có hướng dẫn quốc gia quốc tế yêu cầu nhãn hiệu chế phẩm dược thú y, hướng dẫn cho chất liệu bảo quản thành phần kháng nguyên vaccin, cốt yếu hướng đến vấn đề chất liệu “trong sản xuất” Dưới điểu kiện nhiệt độ cực thấp, phương pháp tạo nhãn phải có tính bền bỉ Theo kinh nghiệm, chai đeo thẻ chọn lựa thích hợp nhất, sử dụng thẻ kim loại kích thước đủ cho chi tiết cần thiết Những chi tiết phải bao gồm dòng kháng nguyên/virus vaccin, số lô, ngày tiếp nhận phải bao gồm số hiệu vật chứa hay số hiệu chất liệu chứa Thông tin thể phải rõ ràng để đọc lập thẻ dùng mực không phai Các thẻ nhôm sử dụng cho mục đích sơn phủ màu khác cho phép phân biệt, đặc biệt dòng kháng nguyên khác chứa kho Thẻ kim loại cho phép thông tin khắc vào vĩnh viễn Theo dõi Quan trọng thực tế kháng ngun đậm trì cách tối ưu theo dõi với thủ tục để có số đảm bảo chúng có hiệu sử dụng đến Do đó, việc bố trí phải thiết lập để theo dõi kháng nguyên cô đậm thủ tục để cần, vào khoảng thời gian thích hợp, có chế độ xét nghiệm để đảm bảo tính ngun vẹn thành phần kháng nguyên hay tính hiệu lực chấp nhận thành phẩm Thí dụ, việc theo dõi nhiệt độ bảo quản bình thường thực ghi chép ngân hàng vaccin FMD, kiểm tra định kỳ chai chứa kháng nguyên nứt hay rò rỉ Tùy theo dạng, thể tích cách thức bảo quản, đánh giá cân lượng kháng nguyên bảo quản để đảm bảo không bị trở nên tiềm sinh (lyophilise) Một số ngân hàng vaccin FMD có kết hợp với xét nghiệm sinh hóa phân tích mật độ sucrose, để theo dõi tính nguyên vẹn virus tính ổn định, nhân thực xét nghiệm nội mơi trường Tuy nhiên, nhận thấy thời gian tồn kháng ngun FMD đậm kéo dài 15 năm bảo quản nhiệt độ cực thấp, tiếp cận sinh hóa coi đủ đảm bảo Sau xét nghiệm đề xuất thích hợp cho đánh giá tái đánh giá kháng nguyên dự trữ Thời gian Vào lúc tiếp nhận (năm thứ 0) Xét nghiệm Định lượng 146S * năm sau Xét nghiệm tính hiệu lực bò dựa vào kỹ thuật huyết học, tính hiệu lực liên hệ đầy đủ với khả sinh miễn dịch kháng nguyên quan tâm, theo suy xét ngân hàng, xét nghiệm “rút gọn”**, để chứng minh tính hiệu lực tối thiểu vaccin giữ lớn tối thiểu yêu cầu; nhiên, xét nghiệm rút gọn ngồi ước tính tính hiệu lực vaccin Năm thứ 4, trước tổng hợp vaccin có yêu cầu Mỗi năm Định lượng 146S Đánh giá tất liệu thu từ năm để đánh giá cần thiết thay kháng nguyên * Các xét nghiệm sinh hóa khác SDS-PAGE áp dùng để đánh giá tính ngun vẹn VP1, khơng đủ để đánh giá theo thủ tục áp dụng ** Trong xét nghiệm rút gọn, tất thú vật nhóm thể tích chia nhỏ giả thiết khơng có bảo hộ Do xét nghiệm cho giá trị PD 50 thấp cách chủ quan, giảm số lượng thú vật cần thiết Để đáp ứng yêu cầu xét nghiệm kháng nguyên dự trữ, đậm độ phải bao gồm số mẫu nhỏ mà đại diện cho khối dự trữ lớn Các lượng nhỏ kháng nguyên FMD đại diện thường gồm thể tích chứa khoảng milligram kháng nguyên THAM KHẢO ADAMOWICZ PH., LEGRAND B., GUERCHE J & PRUNET P (1974) Un nouveau procedé de concentration et de purification du virus Application du virus de la fièvre aphteuse produit sur cellules BHK21 pour l’obtention des vaccins hautement purifiés Bull OIE, 81, 1125–1150 ALEXANDERSEN S., ZHANG Z., REID S.M., HUTCHINGS G.H., DONALDSON A.I (2002) Quantities of infectious virus and viral RNA recovered from sheep and cattle experimentally infected with foot-and-mouth disease virus O UK 2001 J Gen Virol., 83 (8), 1915–1923 ALONSO F.A (1986) Manual de Diagnostico de Laboratorio de las Enfermadedas Vesiculares, Panaftosa ALONSO F.A., CASAS OLASCOAGA R.C., ASTUDILLO V.M., SONDAHL M.S., GOMES I & VIANNA FILHO Y.L (1987) Updating of foot-and-mouth disease virus strains of epidemiological importance in South America Bol Centr Panam Fiebre Aftosa, 53, 11–18 ALONSO A., GOMES M.D., RAMALHO A.K., ALLENDE R., BARAHONA H., SONDHAL M & OSÓRIO F (1993) Characterization of foot-and-mouth disease vírus by monoclonal antibodies Viral Immunol., (3), 219–228 ALONSO A., MARTINS M.A., GOMES D.M.P., ALLENDE R & SONDAHL M.S (1992) Foot-andmouth disease virus typing by complement fixation and enzyme-linked immunosorbent assay using monovalent and polyvalent antisera J Vet Diagn Invest., 4, 249–253 AMAREL-DOEL C.M.F., OWEN N.E., FERRIS N.P., KITCHING R.P & DOEL T.R (1993) Detection of foot-andmouth disease viral sequences in clinical specimens and ethyleneimine-inactivated preparations by the polymerase chain reaction Vaccine, 11, 415–421 AUGE DE MELLO P., GOMES I & BAHNEMANN H.G (1989) The vaccination of young cattle with an oil adjuvant foot-and-mouth disease vaccine Bol Centr Panam Fiebre Aftosa, 55, 3–14 BAHNEMANN H.G (1975) Binary ethyleneimine as an inactivant for foot-and-mouth disease virus and its application for vaccine production Arch Virol., 47, 47–56 10 BAHNEMANN H.G (1990) Inactivation of viral antigens for vaccine preparation with particular reference to the application of binary ethylenimine Vaccine, 8, 299–303 11 BARNETT P.V., PULLEN L., WILLIAMS L & DOEL T.R (1996) International bank for foot-andmouth disease vaccine: assessment of Montanide ISA 25 and ISA 206, two commercially available oil adjuvants Vaccine, 14, 1187–1198 12 BARTELING S.Z & VREESWIJK Z (1991) Developments in foot-and-mouth disease vaccines Vaccine, 9, 75– 88 13 BASTOS A.D.S (1998) Detection and characterization of foot-and-mouth disease virus in sub-Saharan Africa Onderstepoort J Vet Res., 65, 37–47 14 BERGMANN I.E., MALIRAT V., NEITZERT E., PANIZUTTI N., SANCHEZ C & FALCZUK A (2000) Improvement of serodiagnostic strategy for foot and mouth disease virus surveillance in cattle under systematic vaccination: a combined system of an indirect ELISA-3ABC with an enzymelinked immunoelectrotransfer blot Arch Virol., 145, 473–489 15 BERGMANN I.E., NEITZERT E., MALIRAT V., ORTIZ S., COLLING A., SANCHEZ C & CORREA MELO E (2003) Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent assay and its use as an epidemiological indicator of foot-and-mouth disease viral activity Arch Virol., 148, 891–901 16 BERGMANN I.E., TIRABOSCHI B., MAZZUCA G., FERNANDEZ E., MICHAILHOFF C.A., SCODELER E & LA TORRE J.L (1988) Serological and biochemical analysis of foot-and-mouth disease virus (serotypeC3) isolated in Argentina between 1981 and 1986 Vaccine, 6, 245 17 BROCCHI E., BERGMANN I.E., DEKKER A., PATON D.J., SAMMIN D.J., GREINER M., GRAZIOLI S., DE SIMONE F., YADIN H., HAAS B., BULUT N., MALIRAT V., NEITZERT E., GORIS N., PARIDA S., SORENSEN K & DE CLERCQ K (2006) Comparative evaluation of six ELISAs for the detection of antibodies to the non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus Vaccine (submitted) 18 CALLAHAN J.D., BROWN F., CSORIO F.A., SUR J.H., KRAMER E., LONG G.W., LUBROTH J., ELLIS S.J., SHOULARS K.S., GAFFNEY K.L., ROCK D.L & NELSON W.M (2002) Use of a portable realtime reverse transcriptasepolymerase chain reaction assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus J Am Vet Med Assoc., 220 (11), 1636–1642 19 CLARKE J.B & SPIER R.E (1980) Variation in the susceptibility of BHK populations and cloned cell lines to three strains of foot-and-mouth disease virus Arch Virol., 63, 1–9 20 DE DIEGO M., BROCCHI E., MACKAY D & DE SIMONE F (1997) The use of the non-structural polyprotein 3ABC of FMD virus as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle Arch Virol., 142, 2021–2033 21 DOEL T.R & BACCARINI P.J (1981) Thermal stability of FMDV Arch Virol., 70, 21–32 22 DOEL T.R & COLLEN T (1982) Qualitative assessment of 146S particles of FMDV in preparations destined for vaccines J Biol Stand., 10, 69–81 23 DOEL T.R., FLETTON B & STAPLE R.F (1982) Further developments in the quantification of small RNA viruses by UV photometry of sucrose density gradients Dev Biol Stand., 50, 209– 219 24 DOEL T.R & PULLEN L (1990) International bank for foot-and-mouth disease vaccines: stability studies with virus concentrates and vaccines prepared from them Vaccine, 8, 473–478 25 DOEL T.R & STAPLE R.F (1982) The elution of FMDV from vaccines adjuvanted with aluminium hydroxide and with saponin J Biol Stand., 10, 185–195 26 DOEL T.R., WILLIAMS L & BARNETT P.V (1994) Emergency vaccination against foot-andmouth disease The rate of development of immunity and its implications for the carrier state Vaccine, 12, 592–600 27 EUROPEAN PHARMACOPOEIA (2008) Version 6.1 Monograph No 63 Editions of the Council of Europe, Strasbourg, France 28 FERRIS N.P & DAWSON M (1988) Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot-and-mouth and swine vesicular disease Vet Microbiol., 16, 201–209 29 FERRIS N.P & DONALDSON A.I (1992) The World Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease: a review of thirty-three years of activity (1958–1991) Rev sci tech Off int epiz., 11 (3), 657–684 30 FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) (1984) Emerging Diseases of Livestock Vol The Diseases and their Diagnosis, Geering W.A., ed FAO, Rome, Italy, 43–51 31 FOOD AND AGRICULTURAL ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO) (1997) Potency assessment of inactivated viral vaccines In: FAO Animal Production and Health Series No 35 Vaccine Manual The Production and Quality Control of Veterinary Vaccines for use in Developing Countries, Mowat N & Rweyemamu M., eds FAO, Rome, Italy, 395–409 32 GOLDING S.M., HEDGER R.S., TALBOT P & WATSON J (1976) Radial immunodiffusions and serum neutralisation techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease Res Vet Sci., 20, 142–147 33 GORIS N & DE CLERCQ K (2005) Quality assurance/quality control of foot and mouth disease solid phase competition enzyme-linked immunosorbent assay – Part I Quality assurance: development of secondary and working standards Rev sci tech Off int Epiz., 24 (3), 995–1004 34 GORIS N & DE CLERCQ K (2005) Quality assurance/quality control of foot and mouth disease solid phase competition enzyme-linked immunosorbent assay – Part II Quality control: comparison of two charting methods to monitor assay performance Rev sci tech Off int Epiz., 24 (3), 1005–1016 35 HAMBLIN C., BARNETT I.T.R & HEDGER R.S (1986) A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus I Development and method of ELISA J Immunol Methods, 93, 115–121 36 HAMBLIN C., KITCHING R.P., DONALDSON A.I., CROWTHER J.R & BARNETT I.T.R (1987) Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-andmouth disease virus Evaluation of antibodies after infection and vaccination Epidemiol Infect., 99, 733–744 37 HERBERT W.J (1965) Multiple emulsions A new form of mineral-oil antigen adjuvant Lancet, II, 771 38 KÄRBER G (1931) Beitrag zur kollektiven behandlung pharmakologischer reihenversuche Archive für Experimentelle Pathologie Pharmakologie, 162, 480–483 39 KITCHING R.P & DONALDSON A.I (1987) Collection and transportation of specimens for vesicular virus investigation Rev sci tech Off int Epiz., 6, 263–272 40 KITCHING R.P., RENDLE R & FERRIS N.P (1988) Rapid correlation between field isolates and vaccine strains of foot-and-mouth disease virus Vaccine, 6, 403–408 41 MACKAY D.K., BULUT A.N., RENDLE T., DAVIDSON F & FERRIS N.P (2001) A solid-phase competition ELISA for measuring antibody to foot-and-mouth disease virus J Virol Methods, 97 (1–2), 33–48 42 MACKAY D.K.J, FORSYTH M.A., DAVIES P.R., BERLINZANI, A., BELSHAM G.J., FLINT M & RYAN M.D (1997) Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease using a panel of recombinant, nonstructural proteins in ELISA Vaccine, 16, 446–459 43 MCCULLOUGH K.C., DE SIMONE F., BROCCHI E., CAPUCCI L., CROWTHER J.R & KIHM U (1992) Protective immune response against foot-and-mouth disease J Virol., 66 (4), 1835– 1840 44 MINISTRY OF AGRICULTURE, FISHERIES AND FOOD (1986) Foot-and-mouth disease Ageing of lesions Her Majesty’s Stationery Office, London, UK 45 NEIZERT E., BECK E., AUGE DE MELLO P., GOMES I & BERGMANN I.E (1991) Expression of the aphthovirus RNA polymerase gene in Escherichia coli and its use together with other bioengineered non-structural antigens in detection of lager persistent infections Virology, 184, 799–804 46 PAIBA G.A., ANDERSON J., PATON D.J., SOLDAN A.W., ALEXANDERSEN S., CORTEYN M., WILSDEN G., HAMBLIN P., MACKAY D.K & DONALDSON A.I (2004) Validation of a foot-and-mouth disease antibody screening solidphase competition ELISA (SPCE) J Virol Methods, 115, 145– 158 47 PANAFTOSA (PAN-AMERICAN FOOT-AND-MOUTH DISEASE CENTER) (2001) Final recommendations of the Seminario internacional de Control de Vacuna Antiaftosa, Panaftosa, Rio de Janeiro, Brazil, 10– 14 September 48 PATON D.J., VALARCHER J.-F., BERGMANN I., MATLHO O.G., ZAKHAROV V.M., PALMA E.L & THOMSON G.R (2005) Selection of foot-and-mouth disease vaccine strains – a review Rev sci tech Off int epiz., 24, 981–993 49 PEREIRA H.G (1977) Subtyping of foot and mouth disease virus Dev Biol Stand., 35, 167– 174 50 REID S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G.H., SAMUEL A.R & KNOWLES N.J (2000) Primary diagnosis of foot-andmouth disease by reverse transcription polymerase chain reaction J Virol Methods, 89, 167–176 51 REID S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G.H., ZHANG Z., BELSHAM G.J., ALEXANDERSEN S (2001) Diagnosis of footand- Mouth disease by real-time fluorogenic PCR assay Vet Rec., 149, 621– 623 52 REID S M., GRIERSON S.S., FERRIS N.P., HUTCHINGS G H & ALEXANDERSEN S (2003) Evaluation of automated RT-PCR to accelerate the laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease virus J Virol Methods, 107 (2), 129–139 53 ROEDER P.L & LE BLANC SMITH P.M (1987) The detection and typing of foot-and-mouth disease virus by enzyme-linked immunosorbent assay: a sensitive, rapid and reliable technique for primary diagnosis Res Vet Sci., 43, 225–232 54 RWEYEMAMU M.M (1984) Antigenic variation in foot-and-mouth disease: studies based on the virus neutralization reaction J Biol Standards, 12 (3), 323–337 55 RWEYEMAMU M.M., BOOTH J.C., HEAD M.M & PAY T.W.F (1978) Microneutralisation tests for serological typing of foot and mouth disease virus strains J Hyg., 8, 107–102 56 RWEYEMAMU M.M & HINGLEY P.J (1984) Foot and mouth disease virus strain differentiation: analysis of the serological data J Biol Stand., 12, 225–229 57 SAMUEL A.R., OULDRIDGE E.J., ARROWSMITH A.E.M., KITCHING R.P & KNOWLES N.J (1990) Serological analysis of type O isolates of FMD from the Middle East 1981–88 Vaccine, 8, 390– 395 58 SKINNER H.H (1960) Some techniques for producing and studying attenuated strains of the virus of foot and mouth disease Bull OIE, 53, 634–650 59 SORENSEN K.J., MADSEN K.G., MADSEN E.S., SALT J.S., NQUINDI J & MACKAY D.K.J (1998) Differentiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by the detection of antibodies to the non-structural proteins 3D, 3AB and 3ABC in ELISA using antigens expressed in baculovirus Arch Virol., 143, 1461–1476 60 STREBEL K., BECK E., STROHMAIER D & SCHALLER H (1986) Characterisation of foot-andmouth disease virus gene products with antisera against bacterially synthesised fusion proteins J Virol., 57, 983–991 61 VIANNA FILHO Y.L., ASTUDILLO V., GOMES I., FERNANDEZ G., ROZAS C.E.E., RAVISON J.A & ALONSO A (1993) Potency control of foot-and-mouth disease vaccine in cattle Comparison of the 50% protective dose and protection against generalisation Vaccine, 11–14, 1424–1428 62 WAGNER G.G., CARD J.L & COWAN K.M (1970) Immunochemical studies of foot-and-mouth disease virus VII Characterization of foot-and-mouth disease virus concentrated by polyethylene glycol precipitation Arch Ges Virusforsch., 30, 343–352 63 WOODBURY E.L., ILOTT M.C., BROWN C.C & SALT J.S (1995) Optimization of an in situ hybridization technique for the detection of foot-and-mouth disease virus in bovine tissues using the digoxigenin system J Virol Methods, 51, 89–94 NB: There are OIE Reference Laboratories for Foot and mouth disease (see Table in Part of this Terrestrial Manual or consult the OIE Web site for the most up-to-date list: www.oie.int)
- Xem thêm -

Xem thêm: BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG FMD, BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG FMD

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn

Nhận lời giải ngay chưa đến 10 phút Đăng bài tập ngay