Chương ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, tình hình dịch bệnh heo trở nên phức tạp nguy hiểm nhiều so với năm trước Các chương trình tiêm phòng bệnh biện pháp hỗ trợ, trộn kháng sinh vào thức ăn… áp dụng bệnh xảy liên tục gây thiệt hại to lớn cho người chăn nuôi heo Trong đó, bệnh tiêu chảy heo theo mẹ gây tổn thất lớn Tỷ lệ heo tiêu chảy hộ chăn nuôi khoảng 30-60% (Trần Thị Dân, 2008) Bệnh tiêu chảy heo theo mẹ sau cai sữa nhiều nguyên nhân, hầu hết nghiên cứu thường tập trung E coli Salmonella Gần số quốc gia công bố bệnh tiêu chảy cấp virus Porcine Epidemic Diarrhea (PED) gây phổ biến Bệnh tiêu chảy cấp heo (PED) bệnh truyền nhiễm, lây lan nhanh, thiệt hại lớn với đặc điểm gây ói mửa tiêu chảy heo lứa tuổi (Pospischil et al., 2002) Ở heo tuần tuổi thể triệu chứng tiêu chảy nặng, heo chết nhanh khó hồi phục với tỷ lệ bệnh tỷ lệ chết lên đến 100% (Pensaert and Yeo, 2006) Ngày 17/5/2013, virus PED xác nhận lần Mỹ, dịch bệnh lây lan nhanh chóng 200 trại ni heo khắp nước Mỹ, 17 bang có dịch bệnh vòng tháng, với tỷ lệ chết heo từ 50 – 100% (Huang et al., 2013; Stevenson et al., 2013) Ở Châu Á từ năm 1990, bệnh virus PED bắt đầu lên tác nhân dịch bệnh quan trọng, đặc biệt Hàn Quốc Nhật Bản, với tỷ lệ chết lên đến 50-95% heo nhỏ 2-3 tuần tuổi (Chae et al., 2000; Sueyoshi et al., 1995; Pensaert and Yeo, 2006) Tại Việt Nam, bệnh PED xảy từ năm 2008-2010 số tỉnh phía Nam (Nguyễn Tất Toàn et al., 2012) gây nhiều thiệt hại Bệnh gây thiệt hại nặng nề đàn heo tỉnh miền Đông Nam với tỷ lệ bệnh lứa tuổi đến 100%, tỷ lệ chết khác lứa tuổi, đặc biệt cao heo theo mẹ từ 50 – 100% Các dấu hiệu tương tự bệnh PED có xuất heo số tỉnh Đồng sông Cửu Long chưa có thơng tin xác công bố Để xác định diện bệnh thành phố Cần Thơ, tiến hành thực đề tài: “Khảo sát tình hình nhiễm bệnh tiêu chảy cấp (Porcine Epidemic Diarrhea, PED) heo theo mẹ thành phố Cần Thơ” Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm bệnh PED đàn heo theo mẹ địa bàn thành phố Cần Thơ - Xác định triệu chứng, bệnh tích đại thể vi thể thường gặp heo theo mẹ mắc bệnh PED - Đề xuất biện pháp phòng bệnh PED Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu nước bệnh PED heo 2.1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Nghiên cứu sinh bệnh học PED, Ducatelle et al., (1982) gây nhiễm heo 2-3 ngày tuổi không bú sữa đầu, virus PED chủng CV777 qua đường uống Sau 22-36 gây nhiễm heo có biểu tiêu chảy chết vòng 12 – 120 Các tế bào biểu mô hấp thu lông nhung ruột nhiễm virus bị phá hủy quan sát rõ sau 24-36 gây nhiễm, nhiên không quan sát thấy có phá hủy tế bào biểu mơ kết tràng Vị trí nhân lên virus xác định thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang kính hiển vi điện tử Virus PED nhân lên bào tương tế bào lông nhung ruột, phá hủy tế bào biểu mô làm ngắn lông nhung Tác giả cho rằng, đặc điểm sinh bệnh PEDV ruột non heo giống với TGEV Nhưng so với TGEV, nhân lên lây lan ruột non PEDV diễn chậm thời gian nung bệnh lâu Hofmann et al., (1988) Kusanagi et al., (1992) tiến hành nuôi cấy virus PED môi trường tế bào Vero, nhận thấy virus phát triển môi trường có chứa trypsin Carvajal et al., (1995) sử dụng phản ứng ELISA ức chế kháng thể đơn dòng phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFT) để phát kháng thể kháng PEDV huyết heo gây nhiễm thực nghiệm với chủng CV777 heo phát bệnh PED tự nhiên Kết cho thấy, hai phương pháp phát có mặt kháng thể kháng PEDV ngày thứ từ ngày 10 đến ngày 13 sau gây nhiễm Phương pháp ELISA ức chế phát đáp ứng kháng thể sớm phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Khảo sát ổ dịch tiêu chảy cấp-PED xảy đàn heo Nhật Bản, Sueyoshie et al (1995) nhận thấy biểu đặc trưng bệnh tiêu chảy lỏng, nước tử vong cao heo sơ sinh Sử dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để quan sát bệnh tích vi thể cho thấy, lông nhung ruột non bị teo lại, hình thành khơng bào tế bào lơng nhung ruột non Tỷ lệ chiều cao lông nhung với tuyến ruột giảm rõ, biến động từ 1:1 tới 3:1 Với kỹ thuật Streptavidin-biotin (SAB), phát số lượng lớn Coronavirus có tế bào chất tế bào ruột vi lông nhung ruột non Những tế bào nhiễm chủ yếu tế bào biểu mô nhung mao không tràng hồi tràng, virus diện ruột già biểu mô tuyến ruột Tác giả cho rằng, kỹ thuật SAB hữu ích việc chẩn đốn bệnh PED Sức đề kháng tự nhiên heo virus PED Shibata et al (2000) khảo sát heo độ tuổi: tuần, tuần, tuần, tuần 12 tuần tuổi, tất gây nhiễm với virus PED qua đường uống Virus PED phân lập từ ruột non heo bị nhiễm bệnh nuôi cấy môi trường tế bào Vero, tế bào bàng quang tế bào thận heo Kết cho thấy sức đề kháng tăng dần theo tuổi heo bị chết giai đoạn 2-7 ngày tuổi Năm 2001, Shibata nghiên cứu khả miễn dịch sữa đầu Sử dụng sữa đầu bò tiêm chủng khơng tiêm chủng heo 2-3 ngày tuổi, gây nhiễm với virus PED chủng Z94P5 Cho thấy heo uống sữa đầu có miễn dịch có tỷ lệ sống sót cao chí 100% hiệu giá kháng thể 1:512, ngược lại 0% heo uống sữa đầu khơng có miễn dịch Mổ khám bệnh tích cho thấy kết bệnh trầm trọng heo uống sữa đầu khơng có miễn dịch: teo lông nhung ruột, virus PED diện không tràng hồi tràng sau 24 gây nhiễm Kết cho thấy sữa đầu có miễn dịch bảo vệ heo chống lại virus PED lúc sinh Kim et al., (2002) so sánh ba kỹ thuật (phản ứng RT-PCR, hóa mơ miễn dịch lai chỗ) để xác định virus PED Tác giả kết luận RT-PCR xác định có mặt virus PED xác phương pháp khác Jung et al., (2006) nghiên cứu tác động virus PED lên enyme tiêu hóa ruột non heo Các heo gây nhiễm virus PED mổ khám thời điểm 24, 36, 48, 60 72 sau gây nhiễm Kết cho thấy nhân lên virus PED làm hủy hoại nặng tế bào lông nhung ruột non dẫn đến làm giảm đáng kể bề mặt biểu mô ruột khả hoạt động enzyme tiêu hóa Lơng nhung ruột bị teo nhỏ hoạt động enzyme tiêu hóa yếu nguyên nhân tiêu chảy rối loạn tiêu hóa rối loạn hấp thu dinh dưỡng sữa Martelli et al., (2008) nghiên cứu khảo sát dịch tiêu chảy xảy tất hạng heo từ tháng 5/2015 đến 6/2006 Ý Bằng kỹ thuật kính hiển vi điện tử, kính hiển vi miễn dịch huỳnh quang, PCR huyết học, xác định nguyên nhân gây dịch tiêu chảy PEDV Ở chuồng nuôi heo nái sinh sản, heo nái heo theo mẹ có biểu tiêu chảy, với tỷ lệ chết heo sơ sinh từ 34% trở lên Ở heo sau cai sữa heo choai, tỷ lệ mắc bệnh trung bình từ 20-80%, tỷ lệ chết khơng có có tỷ lệ thấp Tác giả cho rằng, tùy vào quy mơ đàn mơ hình chăn ni mà bệnh kéo dài vài tuần vài tháng Puranaveja et al., (2009) nghiên cứu khảo sát ổ dịch PED xảy heo tỉnh (24 trại) Thái Lan khoảng thời gian từ tháng 12/2007-3/2008 cho thấy tỷ lệ chết heo sơ sinh cao 100% ổ dịch xảy lần Với 33 chủng virus phân lập có gene M gene S tương đồng đến 99,7% 98,6% với chủng Trung Quốc, JS-2004-2 Tháng 10/2010, dịch tiêu chảy cấp-PED xảy miền Nam Trung Quốc, đặc trưng bệnh tỷ lệ chết cao heo sơ sinh Dịch bệnh lây lan 10 tỉnh 1.000.000 heo bị chết Đáng ý ổ dịch tiêu chảy này, tất heo tuần tuổi bị mắc bệnh 100% tỷ lệ chết từ 80 – 100% Mổ khám cho thấy bệnh tích điển hình dày căng phồng, chứa sữa bị vón cục, ruột có xuất huyết nhẹ, thành ruột mỏng niêm mạc ruột bị teo, thấy chất dịch chứa bên ruột màu vàng có bọt (Sun et al., 2012) Ngày 29/4/2013, lần dịch tiêu chảy nôn mửa xảy heo lứa tuổi bùng phát trang trại heo giống bang Iowa, Mỹ Với tỷ lệ chết cao từ 9095% heo sơ sinh Trên heo nái, 10-15% biểu biếng ăn nôn mửa Stevenson et al., (2013) xác định nguyên nhân gây bệnh dịch virus PED phương pháp RT-PCR Heo bị PED phân lỏng, màu vàng dính phủ lên heo Heo chết bệnh thể nước rõ: xác gầy, mắt trũng sâu, da không đàn hồi dính sát vào mơ da Mổ khám bệnh tích cho thấy dày căng phồng, chứa sữa bị vón cục, ruột non ruột già chứa chất lỏng lợn cợn sữa khơng tiêu hóa có màu từ trắng đến vàng, thành ruột mỏng, suốt Quan sát bệnh tích vi thể thấy tế bào biểu mơ hợp bào, chứa nhiều nhân; lông nhung ruột bị hủy hoại nghiêm trọng, đỉnh lông nhung bị bào mòn, tỷ lệ chiều cao lơng nhung tuyến ruột 1:1 rõ Phân tích giải trình tự gen chủng PEDV ổ dịch cho thấy có tương đồng cao (99%) với chủng PEDV phân lập từ ổ dịch Trung Quốc năm 2012 Nghiên cứu chủng virus PED phân lập ổ dịch bệnh bang Minnesota Iowa, Mỹ, Huang et al., (2013) cho thấy có chủng tương đồng với chủng tỉnh An Huy Trung Quốc Tác giả cho virus có nguồn gốc tiến hóa từ Coronavirus dơi Năm 2013, xác định khả khuếch tán virus PED khơng khí, có 11 mẫu dương tính tổng số 64 mẫu khơng khí thu thập từ trại heo trại thực nghiệm bang Oklahoma-Mỹ PEDV phát khoảng cách lên đến 16km (10 dặm) Các mẫu khơng khí nhiễm PED gây nhiễm heo 7-8 tuần, kết cho thấy heo gây nhiễm có biểu lâm sàng bệnh PED virus PED phát có phân mơ Virus PED tìm thấy khơng khí, hạt lơ lửng khơng khí truyền nhiễm virus PED vận chuyển qua khoảng cách dài (Goede et al., 2013) Jung et al., (2014) tiến hành nghiên cứu yếu tố liên quan nhiễm dai dẳng virus PED bùng phát lại dịch bệnh Trung Quốc Các mẫu phân, tinh dịch mẫu khơng khí thu thập từ trại heo trải qua dịch bệnh PED, virus PED phát phương pháp RT-PCR định lượng virus phương pháp real-time RTPCR Kết cho thấy, tất loại mẫu phát diện virus PED Virus thải qua phân với nồng độ 1x10 6,85 copies/ml trở lên thời gian thải virus qua phân kéo dài 56 ngày Những mẫu tinh dịch heo đực giống mẫu khơng khí cho kết dương tính với RNA virus PED Theo Bernasconi et al., (1995) nghiên cứu cho thấy virus dòng CV777 thích ứng mơi trường tế bào có trình tự gen khác biệt rõ rệt so với chủng CV777 phân lập từ thực địa, khác biệt liên quan tới việc suy giảm mạnh độc lực virus việc giảm nhẹ mức độ thay đổi mô bệnh học heo mắc bệnh Tuy nhiên Châu Âu, bệnh gây virus PED không quan trọng mặt kinh tế đủ để người ta tiến hành sản xuất vaccine Chính vậy, thử nghiệm hồn thiện vaccine chủ yếu tiến hành nước Châu Á, nơi PED bùng phát trầm trọng với tỷ lệ tử vong gia tăng heo sơ sinh Một vaccine khác dùng cho heo bú mẹ chế từ virus suy giảm độc lực thu qua việc cấy chuyển nhiều đời (93 đời cấy chuyển) virus PED môi trường nuôi cấy tế bào Vero (Kweon et al., 1999) Ở Nhật Bản, loại vaccine nhược độc thương mại sản xuất từ chủng virus PED (P-5V) thích ứng tế bào ni cấy sử dụng phòng bệnh cho heo nái từ năm 1997 Mặc dù vaccine xem hiệu quả, nhiên tất heo nái sử dụng vaccine tạo miễn dịch qua sữa ổn định (Usami et al., 1998; Pensaert and Yeo, 2006) De Arribe et al., (2002) sử dụng kỹ thuật điểm hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISPORT) để biệt hóa tế bào tiết kháng thể (Antibody Secreting Cell) đặc hiệu niêm mạc mô lympho heo chủng PEDV Sau lây nhiễm PEDV, kết cho thấy khả sản xuất tế bào tiết kháng thể (ASC) ruột tương tự gây nhiễm TGEV Rotavirus; IgG ASC tiết lưu hành nhiều Ở heo nhiễm virus PED, xác định lượng nhỏ IgM ASC tiết sau ngày gây nhiễm tế bào B nhớ xuất lúc 21 ngày sau gây nhiễm hạch lympho, lách máu Cuối cùng, thời gian thử nghiệm heo, tác giả khẳng định tồn mối tương quan khả bảo hộ với kháng thể đặc hiệu huyết đáp ứng ASC mô lympho đường ruột máu 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Theo Nguyễn Tất Toàn et al., (2012) nghiên cứu sử dụng phương pháp nested RTPCR để chẩn đoán phân biệt virus gây viêm dày – ruột truyền nhiễm (TGEV) virus dịch tiêu chảy cấp heo (PEDV) ổ dịch năm 2008-2010 tỉnh miền Đông Nam Với 284 mẫu ruột phân thu từ heo có biểu bệnh đặc trưng dịch tiêu chảy, qua chẩn đoán kỹ thuật nested RT-PCR cho kết 41,90% số mẫu dương tính với PEDV, khơng phát mẫu dương tính với TGEV Kết chẩn đốn cho thấy tỷ lệ mẫu dương tính với PEDV ruột (58,14%) cao mẫu phân (16,96%) Nghiên cứu số yếu tố liên quan đặc điểm bệnh học bệnh PED số tỉnh phía Nam Nguyễn Tất Tồn Đỗ Tiến Duy (2012), qua khảo sát 110 trại xảy bệnh tiêu chảy cấp đặc trưng heo lứa tuổi Kết tỷ lệ bệnh tỷ lệ chết xuất heo theo mẹ cao (tương ứng 93,94% 81,67%) Hai tỷ lệ giảm dần theo lứa tuổi Các yếu tố liên quan đến việc lan truyền dịch bệnh gồm có khoảng cách đến với trại heo bị bệnh, vệ sinh sát trùng, quy mô chăn nuôi nguồn nước sử dụng Triệu chứng lâm sàng bệnh PED: 100% tiêu chảy phân lỏng, 90,33% ói mửa Bệnh tích thường gặp: 94,42% có biểu dày căng phồng, chứa nhiều thức ăn không tiêu 86,33% thành ruột mỏng, phồng to, chứa nhiều nước dịch chất bên Cũng năm này, hai tác giả tiến hành nghiên cứu xác định đặc trưng kiểu gen virus gây bệnh tương đồng với chủng giới để dự đốn nguồn gốc virus định hướng cho cơng tác phòng chống bệnh Nghiên cứu thực 16 chủng virus PED thu thập từ ổ dịch tiêu chảy cấp heo khuyếch đại kỹ thuật nested RT-PCR giải trình tự theo phương pháp điện di mao quản Kết cho thấy, chủng PEDV Việt Nam có tương đồng gen cao với chủng phân lập từ nước láng giềng Trung Quốc (JS-2004-2) Thái Lan (07np01, Ku01cb08) với khác biệt nhỏ, 0,56 – 2,86%, 0,00 – 1,71% Từ thấy rõ nguy lây lan dịch bệnh vận chuyển, mua bán động vật sản phẩm động vật chưa qua kiểm dịch Ngoài ra, di chuyển người góp phần quan trọng lây lan dịch bệnh vùng sang vùng khác, quốc gia qua quốc gia khác Các chủng virus PED Việt Nam bắt đầu hình thành đa dạng (đột biến điểm) địa phương khác nhau: Bình Dương, Đồng Nai thành phố Hồ Chí Minh Nghiên cứu số đặc điểm dịch tễ bệnh lý bệnh tiêu chảy thành dịch heo số tỉnh phía Bắc (như Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Giang, Bắc Ninh Hà Nội), Nguyễn Văn Điệp et al., (2013), khảo sát 31 trại heo có biểu tiêu chảy lứa tuổi, điều trị kháng sinh không hiệu quả, tỷ lệ chết tập trung heo theo mẹ Sử dụng phương pháp RT-PCR để chẩn đoán virus PED, TGE Rota Kết nghiên cứu cho thấy có tới 83,9% dương tính với virus PED Tỷ lệ bệnh PED cao heo theo mẹ (96%), heo sau cai sữa (86,2%) thấp heo đực giống Tỷ lệ chết cao heo theo mẹ (68,6%) Về bệnh lý: phân có màu vàng, vàng xanh, phân màu xám, xám đen Bệnh tích đại thể chủ yếu quan sát thấy dày (19,4%), ruột non (61,3%), ruột già (32,2%), hạch bạch huyết (38,7%) số quan nội tạng khác Kết nghiên cứu bệnh tích vi thể thể thay đổi quan nội tạng Năm 2014, Nguyễn Thị Lan et al., nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán bệnh tiêu chảy virus PED gây cho heo theo mẹ huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên Nghiên cứu tiến hành đàn heo theo mẹ 10 ngày tuổi Những heo bị mắc PED thường có biểu chán ăn, bỏ ăn, tiêu chảy, phân nhiều nước, màu vàng, có sữa không tiêu, ruột non căng phồng, thành ruột bị bào mỏng, chứa dịch màu vàng, hạch màng treo ruột sưng to Kết xét nghiệm kỹ thuật RTPCR cho thấy tất heo có biểu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích mắc PED Mẫu bệnh phẩm lấy từ phân, ruột hạch ruột dùng để chẩn đốn PED kỹ thuật RT-PCR cho kết tốt 2.2 Đặc điểm bệnh PED heo 2.2.1 Lịch sử Theo Oldham (1972), bệnh gây tiêu chảy cấp heo giai đoạn tăng trưởng vỗ béo vào năm 1971, dịch bệnh bùng phát rải rác suốt mùa đông Anh, làm tổn thất đến nhiều trang trại chăn nuôi heo Các biểu lâm sàng heo bệnh giống hệt bị nhiễm virus gây viêm dày-ruột truyền nhiễm (TGEV), ngoại trừ khác biệt quan trọng, heo bú mẹ khơng mắc bệnh TGEV tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa khác xác định khơng phải ngun nhân gây bệnh Bệnh sau lan sang nước Châu Âu gọi bệnh “tiêu chảy thành dịch virus” (Epidemic viral diarrhea-EVD) Năm 1976, bệnh tiêu chảy cấp tính giống với bệnh TGE lại xuất hiện, xảy heo tất lứa tuổi, bao gồm heo giai đoạn bú sữa mẹ (Wood, 1977), nhiên khả TGEV tác nhân gây bệnh đường tiêu hóa biết nguyên nhân gây bệnh loại trừ Lúc này, tên EVD loại đưa để phân biệt bệnh gây tiêu chảy thời điểm với EVD loại bệnh bùng phát năm 1971, khác nằm chỗ heo bú mẹ mắc bệnh EVD loại mà không mắc EVD loại Năm 1978, Coronavirus chứng minh nguyên nhân gây đợt bùng phát EVD loại (Chasey and Cartwright, 1978; Pensaert and DeBouck, 1978) Kết gây bệnh thực nghiệm cho heo chủng virus phân lập (CV777) cho thấy bệnh tích đường tiêu hóa biểu điển hình heo heo vỗ béo (DeBouck and Pensaert, 1980) Loại Coronavirus chứng minh chịu trách nhiệm cho bùng phát EVD loại loại 2, từ tên bệnh đổi thành “tiêu chảy thành dịch heo” viết tắt theo tên tiếng Anh PED (Pensaert et al., 1982) 2.2.2 Tác nhân gây bệnh Phân loại Virus gây bệnh PED (Porcine epidemic diarrhea virus – PEDV) thuộc chi Alphacoronavirus, họ Coronaviridae, Nidovirales (Ủy ban quốc tế phân loại virus – ICTV, 2011), với TGEV, coronavirus mèo, chó coronavirus 229E người Phân loại huyết học, người ta xác định virus PED có serotype Các chủng PEDV phân lập từ Châu Âu, Hàn Quốc Trung Quốc tương đồng mặt huyết với chủng CV777 phân lập từ thực địa Bỉ năm 1978 (Pensaert and Yeo, 2006; Song and Park, 2012) Cấu trúc virus PEDV virus có vỏ bao bọc, đường kính biến đổi từ 90 đến 190 nm Virus có nhân đậm đặc điện tử với quầng sáng phần tỏa từ nhân dạng chùy dài xấp xỉ 20nm Virus nhân lên thông qua việc nẩy chồi từ màng bên bào tương tế bào vật chủ Hình thái PEDV tế bào biểu mơ đường tiêu hóa tương tự coronavirus khác (Kweon et al., 1993; Pospischil et al., 2002) Bộ gen virus PED sợi RNA đơn dương kích thước khoảng 28kb với mũ 5’ đuôi polyA 3’ Bộ gen virus gồm vùng không dịch mã đầu (UTR) 5’, UTR đầu 3’, khung đọc mở (ORF) mã hóa cho protein cấu trúc gồm gai (S), vỏ (E), màng (M), nucleocapsid (N) protein không cấu trúc (enzyme tái replicase 1a, 1b ORF3) Những khung đọc mở xếp theo trình tự: 5’-replicase (1a, 1b)-S-ORF3-E-M-N-3’(Hình 2.1) Protein cấu trúc PEDV tương tự coronavirus khác Virus có protein gai (S) với trọng lượng phân tử khoảng 180-200 kDa, protein màng (M) 27-32 kDa, protein nucleocapsid gắn với RNA nặng 57-58 kDa Sức đề kháng Virus mẫn cảm với ether, chloroform PEDV bền khoảng pH 5,0 – 9,0 4°C pH từ 6,5 – 7,5 37°C Với sóng siêu âm, độ đơng lạnh virus khơng bị phá hủy khả cảm nhiễm Sự nhân lên virus bị ức chế 5-iodo-2’deoxyuridine (Hofmann Wyler, 1989; Pensaert and Yeo, 2006) Virus PED khả cảm nhiễm lên tế bào nuôi cấy nhiệt độ ≥ 60°C 30 phút, chúng bền 50°C (Lee and Yeo, 2003) PEDV bị bất hoạt hầu hết chất sát trùng như: cresol, NaOH 2%, formalin 1%, natri carbonat (4% nước, 10% tinh thể, 0,1% chất tẩy rửa), chất tẩy rửa ion hóa khơng ion hóa, iodophor 1% acid phosphoric (Pospischil et al., 2002) (Gai S) (Màng vỏ E) (Màng M) (Kháng nguyên bề mặt) (Nucleocapsid N) (Vật liệu di truyền RNA) Hình 2.1 Mơ cấu trúc virus PED (Hesse et al., 2014) Đặc tính ni cấy Khả thích ứng virus PED với tế bào ruột non điều kiện phòng thí nghiệm Các thí nghiệm ni cấy chủng virus mơ ruột non khí quản không thành công Với tế bào không xử lý với trypsin dịch tụy khơng thích hợp để virus nhân lên (Callebaut and DeBouck, 1981; Witte et al., 1981) Sự sinh trưởng virus phụ thuộc vào có mặt men trypsin mơi trường nuôi cấy Trong môi trường nuôi cấy, virus tác động lên tế bào hình thành khơng bào thể hợp bào (có thể lên tới 100 nhân) Về khả sinh trưởng, hiệu giá nuôi cấy virus đạt cao 105.5 vết tan (plaque forming unit) sau 15 gây nhiễm tế bào (Hofmann and Wyler, 1988, 1989; Lee and Yeo, 2003) Hiện tại, virus PED nhân lên thành công tế bào thận heo bàng quang heo Nhật Bản (Shibata et al., 2000) Chủng PEDV phân lập Nhật Bản (P-5V) sử dụng làm chủng virus vaccine nuôi cấy dòng tế bào heo KSEK6 IB-RS2 (Kadoi et al., 2002) 2.2.3 Dịch tễ học Heo lứa tuổi mắc bệnh PED Bệnh thể rõ heo theo mẹ heo tăng trưởng virus gây bệnh PED xâm nhập lần đầu, với tỷ lệ bệnh tỷ lệ chết cao Bệnh PED xảy quanh năm chủ yếu vào tháng lạnh hay lúc nhiều bọt cục sữa đơng vón khơng tiêu, ruột viêm nặng, thành ruột mỏng suốt vi nhung teo Bệnh tích vi thể: Vi nhung khơng tràng hồi tràng bị thối hóa nên co ngắn rõ rệt (Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012) Hình 2.8 Heo nhiễm bệnh TGE (Nguồn: http://www.lookfordiagnosis.com) 2.4.2 Bệnh tiêu chảy Rotavirus Bệnh gây Rotavirus họ Rotaviridae heo Hiện người ta chia virus gây bệnh phân lập thành hai nhóm: nhóm A Rotavirus có chủng OSU Gottfried phân lập từ heo bệnh với biểu lâm sàng đặc trưng, gọi tiêu chảy sữa, tiêu chảy trắng tiêu chảy tuần Cơ chế sinh bệnh: Sau xâm nhập vào thể heo, Rotavirus vào tế bào lớp nhung mao ruột gây tổn thương Do tác động Rotavirus, nhung mao co lại, tù đầu, làm cho hấp thu chất dinh dưỡng đi, gây trạng thái rối loạn tiêu hóa Rotavirus thường phối hợp với chủng E coli có độc lực gây bệnh phân trắng, gọi phân sữa heo từ – tuần tuổi gây bệnh tiêu chảy heo sau cai sữa Triệu chứng Heo theo mẹ: tiêu chảy, phân màu trắng vàng; sau vài ngày, phân đặc lại keo heo tự khỏi bệnh, chủng E coli có độc lực phối hợp gây bệnh Heo nơn mữa, thấy so với bệnh dày ruột truyền nhiễm (TGE) Bệnh tiêu chảy Rotavirus trở nên trầm trọng heo bị nhiễm kế phát chủng E coli có độc lực lồi cầu trùng gây bệnh: Eimeria spp Isopora spp Trong trường hợp bị bệnh ghép trên, tỷ lệ heo bị chết cao Heo sau cai sữa: Heo bị bệnh tiêu chảy Rotavirus thời kỳ bú mẹ bị nhiễm virus lần khoảng 3- ngày sau cai sữa Bởi heo cai sữa khơng lượng kháng thể bảo hộ sữa mẹ Mặt khác, heo sau cai sữa bị nhiễm chủng Rotavirus khác với chủng mà chúng bị nhiễm thời kỳ bú mẹ Rotavirus gây nhiều tổn thương lớp nhung mao ruột, tạo điều kiện cho nhiễm chủng vi khuẩn E coli có sẵn đường tiêu hóa heo (Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012) Hinh 2.9 Heo suy nhược tiêu chảy phân màu vàng (Nguồn: http://vet.uga.edu) 2.4.3 Tiêu chảy Salmonella Theo Hồ Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, (2012) bệnh vi khuẩn Salmonella choleraesuis chủng gây bệnh, nhiên nhiều chủng khác như: S typhimurium, S derby, S santpaul, S typhi suis tham gia gây bệnh Dịch tễ học: Heo lứa tuổi mắc bệnh bệnh nặng phổ biến heo từ 2- tháng tuổi với tỷ lệ cao, từ 50 – 80% Bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa, heo khỏe ăn thức ăn nước có mầm bệnh Cơ chế sinh bệnh: Sau xâm nhập vào thể, vi khuẩn vào hạch lâm ba đường tiêu hóa sinh sản vào máu gây bại huyết, làm lách sưng to lúc đầu tụ máu đồng thời vi khuẩn sản sinh độc tố gây viêm, hoại tử gan hạch lâm ba, gây viêm đạ dày – ruột Triệu chứng: Thời kỳ nung bệnh – ngày Thể cấp tính, sốt cao 41 - 42°C, ăn khơng ăn, khơng bú, táo bón, phân có máu đơi bị lòi dom Con vật kêu la đau đớn viêm dày – ruột nặng Tổn thương đường hơ hấp rối loạn tuần hồn thở khó nhanh, ho, tim đập yếu Trên da có đám tụ máu thành vết đỏ ửng chuyển sang tím xanh tai, bụng, mặt đùi, ngực Bệnh tiến triển 2-4 ngày vật gầy còm, tiêu chảy nặng chết Tỷ lệ chết từ 25-95% Thể mãn tính: Con vật gầy yếu dần, ủ rũ, ăn uống giảm sút chậm lớn, thiếu máu, da có mảng đỏ tím bầm Con vật rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy phân lỏng màu vàng, thối Ở giai đoạn cuối có triệu chứng rối loạn hơ hấp ho, thở khó gầy còm Bệnh tiến triển vòng vài tuần, tỷ lệ chết từ 25-75% Bệnh tích: Thể cấp tính, niêm mạc ruột thấm máu tràn lan, cắt ra, khơng giống mỡ có màng giống sợi huyết phủ Thể mãn tính: thối loét niêm mạc ruột Những mụn loét to hay nhỏ, màu vàng xanh xám, chứa đầy thứ bã đậu, xung quanh có bờ đỏ nhẵn Khi có biến chứng phổi thấy bệnh tích viêm phổi mãn tính, có vùng nát lầy nhầy Gan, lách sưng, mắt sưng Toàn ruột có nốt loét bã đậu có bờ lên cao, đặc biệt van hồi manh tràng Hình 2.10 Ruột heo nhiễm Salmonellosis Hình 2.11 Heo tiêu chảy Salmonella (Nguồn: VietDVM) 2.4.4 Tiêu chảy E coli Escherichia coli thuộc họ Entero-bacteriaceae, chi Escherichae, loài Escherichia E coli sinh sống bình thường đường ruột người động vật Vi khuẩn E coli có loại kháng nguyên: O, K H Dịch tễ học: Tuổi mắc bệnh heo thường tháng bú mẹ: Heo 15 ngày tuổi bệnh nặng, tử vong cao, bị còi cọc nhiều sau cai sữa Vệ sinh chăm sóc (chuồng trại, máng ăn, nơi nằm), ẩm, lạnh… dẫn đến stress khiến heo giảm sức đề kháng mắc bệnh Thay đổi thức ăn đột ngột cho heo mẹ: Khi tăng lượng đạm mỡ thức ăn cho heo mẹ nuôi con, làm thay đổi thành phần sữa ảnh hưởng đến tiêu hóa heo bệnh dễ phát sinh (Đào Trọng Đạt et al., 1999) Cơ chế sinh bệnh: Bệnh xảy niêm mạc ruột, chủ yếu ruột già heo theo mẹ với tác động chủng E coli, gây tượng đầy, khơng tiêu hóa sữa, dẫn đến tiêu chảy phân trắng Nhu động ruột heo thời kỳ đầu bệnh giảm yếu, thời kỳ sau lại nặng Nhiệt độ heo 39,5 – 40,5°C, buổi chiều thường cao buổi sáng - 2°C Các niêm mạc mắt, mũi, mồm nhợt nhạt thiếu máu nước nhiều Con vật chết tình trạng co giật nhiễm độc (Đào Trọng Đạt et al., 1999) Triệu chứng: phân lỏng, màu trắng vôi, trắng xám vàng, phân lổn nhổn hạt vơi, cá biệt có lẫn máu Phân có mùi Khi bắt đầu bị bệnh, heo bú dần đi, bụng tóp lại run lẩy bẩy Heo khát nước, thường tìm nước bẩn chuồng để uống khơng đảm bảo có nước uống đầy đủ Đơi khi, heo bệnh bị nôn mữa, nôn sữa chưa tiêu (Đào Trọng Đạt et al., 1999) Bệnh tích: Dạ dày phình lớn thường chứa đầy cục sữa chưa tiêu hóa Ruột non đầy dịch Thành ruột non trương lực Mất nước Ở kết tràng pH kiềm (pH ≥ 8) Nhung mao không bị teo (Đào Trọng Đạt et al., 1999) A B Hình 2.12: A Heo tiêu chảy E coli B Ruột non sung huyết (Nguồn: Một số bệnh heo cách điều trị, Công ty C.P Việt ) 2.4.5 Tiêu chảy Treponema hyodysenteriae (Bệnh hồng lỵ) Bệnh xoắn khuẩn Treponema hyodysenteriae gây ra, lồi vi khuẩn Gram âm, kỵ khí Dịch tễ học: Bệnh xảy loài heo, phổ biến heo khoảng 15-70 kg Thỉnh thoảng gặp heo trưởng thành, heo nái heo theo mẹ Bệnh lây lan qua đường tiêu hóa heo khỏe ăn uống phải mầm bệnh Cơ chế sinh bệnh: Sau vào thể qua đường tiêu hóa, vi khuẩn định vị kết tràng, nhân lên với số lượng lớn biểu mô Vi khuẩn tiết độc tố gây viêm ruột (kết tràng), tổn thương tế bào biểu mô, gây xuất huyết hoại tử nên ảnh hưởng việc hấp thu dưỡng chất dẫn đến tiêu chảy có niêm dịch, có mơ hoại tử máu Triệu chứng: Thời gian ủ bệnh từ – 21 ngày, tùy thuộc vào sức đề kháng heo Heo bị sốt nhẹ vài ngày (40 - 41°C), phân lỗng có màu vàng xám có nhiều niêm dịch vết máu Heo có dấu hiệu đau bụng lưng cong, lấy chân đá vào bụng, tiêu chảy kéo dài làm heo nước, có dấu hiệu khát nước, heo gầy, yếu, đứng loạng choạng, gầy còm, lơng xù Heo mắc bệnh chết sau vài sống nhiều tuần Heo bệnh mạn tính có triệu chứng tiêu chảy kéo dài, phân màu vàng hay xám màu đen (Hồ Thị Việt Thu Nguyễn Đức Hiền, 2012) 2.4.6 Viêm ruột hoại tử Clostridium perfringens type C Theo Đào Trọng Đạt, (1999) bệnh viêm ruột hoại tử ác tính heo Clostridium perfringens type C có biểu lâm sàng trầm trọng tiêu chảy máu có tỷ lệ tử vong cao Trực khuẩn Clostridium perfringens type C Gr(+), yếm khí, tạo nha bào, tiết độc tố α toxin β toxin mơi trường ni cấy Hình 2.13 Phân tiêu chảy có máu dịch nhầy Dịch tễ học: Bệnh chủ yếu xảy heo con, heo ngày tuổi thường mắc bệnh thể cấp cấp tính với dấu hiệu tiêu chảy máu Heo nái heo bị bệnh ẩn tính nguồn tàng trữ lây truyền mầm bệnh đàn heo Đường truyền lây: đường miệng, thường thấy đàn mắc bệnh Cơ chế sinh bệnh: Trực khuẩn Clostridium perfringens type C xuất heo sau sinh cảm nhiễm heo xảy sớm ruột non Trực khuẩn phát triển số lượng công vào hệ tế bào nhung mao ruột màng ruột, phá hoại lớp nhung mao, kèm theo tượng hoại tử niêm mạc ruột xuất huyết trầm trọng hệ mao mạch ruột bị phá vỡ Hiện tượng hoại tử sâu vào lớp vòng ruột, làm cho thành ruột bị mỏng ra, niêm mạc ruột tróc mảng Trực khuẩn xâm nhập vào hạch ruột gây hoại tử xuất huyết Triệu chứng bệnh tích: Heo có thời gian ủ bệnh từ – ngày Thể cấp tính: Xuất heo sinh (khoảng – ngày tuổi) Heo mệt, tiêu chảy máu, chết nhanh sau 1-2 ngày tiêu chảy, mổ khám thấy xuất huyết nặng ruột non Thể cấp tính: Thường xảy heo 5-7 ngày tuổi Heo tiêu chảy máu (phân màu đen), chết sau 2-3 ngày mắc bệnh Ngoài xuất huyết, ruột non thấy nhiều vùng bị hoại tử bị loét Thể bán cấp tính: Xảy heo từ tuần tuổi đến cai sữa, với đặc điểm: tiêu chảy kéo dài, phân màu xanh, máu, heo suy yếu chết sau – ngày tiêu chảy Trên ruột non có nhiều vùng bị hoại tử, khơng thấy có dấu hiệu xuất huyết 2.4.7 Tiêu chảy cầu trùng Isospora suis nguyên sinh động vật (protozoa), gọi noãn nang, nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy heo Cơ chế sinh bệnh: Heo bị nhiễm nỗn nang từ đường tiêu hóa, bị nhiễm noãn nang đến ruột non xâm nhập vào vách ruột trải qua chu trình phát triển phức tạp, thời gian khoảng ngày, sau heo có biểu tiêu chảy thải nỗn nang ngồi mơi trường qua phân Ở điều kiện thích hợp nhiệt độ, ẩm độ oxy chúng phát triển thành noãn nang gây nhiễm Triệu chứng: Thời gian ủ bệnh từ 5-6 ngày Đầu tiên heo tiêu chảy phân sệt, sau trở nên lỏng (có thể lẫn bọt) Tiêu chảy kéo dài 5-6 ngày, phân có màu trắng đến vàng, có có màu nâu nhạt xám Heo nhiễm bệnh nặng, xù lông, gầy ốm Tỉ lệ chết bệnh cầu trùng thấp (khoảng 20% heo mắc bệnh) làm tăng trưởng cho heo giai đoạn trước sau cai sữa Tỉ lệ chết gia tăng kết hợp đồng thời với bệnh E.coli hay bệnh khác C perfringens, rotavirus, adenovirus Bệnh tích: Mổ khám heo bệnh thấy niêm mạc ruột viêm loét, tróc lớp nhung mao ruột, xuất huyết mao mạch ruột bị phá hủy Do đó, heo bệnh có nhiều dịch nhầy, lẫn máu ruột theo phân (Đào Trọng Đạt et al., 1999) Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nội dung nghiên cứu Điều tra điều kiện mơi trường, tình hình chăn ni heo tình hình dịch bệnh tiêu chảy cấp heo theo mẹ thành phố Cần Thơ Khảo sát số yếu tố nguy liên quan đến bệnh dịch tiêu chảy cấp heo thành phố Cần Thơ Khảo sát biểu bệnh lý bệnh PED heo theo mẹ Xác định lưu hành bệnh PED đàn heo theo mẹ thành phố Cần Thơ 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Thời gian địa điểm thực - Thời gian thực hiện: Đề tài thực từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2015 - Địa điểm lấy mẫu: Các hộ chăn nuôi thuộc quận, huyện: quận Cái Răng, quận Ơ Mơn huyện Vĩnh Thạnh - Địa điểm phân tích xét nghiệm mẫu Test PED-Ag: thực chuồng nuôi RT-PCR: thực phòng Xét nghiệm Chẩn đốn thú y Hàn-Việt, Trung tâm thực nghiệm, Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh Tiêu vi thể: Thực Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Vemedim 3.2.2 Đối tượng mẫu xét nghiệm Đối tượng: Heo theo mẹ giai đoạn sơ sinh đến cai sữa (từ đến 28 ngày tuổ) heo nái nuôi con, nuôi từ hộ chăn nuôi Mẫu xét nghiệm - Mẫu phân heo theo mẹ có khơng có biểu tiêu chảy, đồng thời lấy mẫu phân heo mẹ - Mẫu ruột: Mẫu ruột heo dương tính với PED Ag test kít 3.2.3 Vật tư - Dụng cụ: Thùng đựng mẫu, găng tay, trang, bọc nilong, tăm bơng vơ trùng… - Kít sử dụng Kít Anigen Rapid PED Ag Test Kit Bộ kít PED-Ag (Công ty Bionote, Hàn Quốc), phát diện virus PED có phân heo (Hình 3.1) Hình 3.1 Anigen rapid PED Ag test Kit 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp điều tra điều kiện mơi trường, tình hình chăn ni heo tình hình dịch bệnh tiêu chảy cấp heo theo mẹ (HCTM) Sử dụng phương pháp điều tra hồi cứu để thu thập thông tin số lượng đàn, phương thức chăn nuôi heo, tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy hàng năm đàn heo theo mẹ từ Cục thú y, Cục thống kê, Chi cục thú y, Trạm thú y phối hợp với cán Thú y xã thực chọn hộ vấn trực tiếp chủ hộ chăn nuôi thông tin cần thiết Thông tin điều tra ghi nhận vào phiếu điều tra (Phiếu điều tra - Xem phụ lục 2) 3.3.2 Phương pháp khảo sát số yếu tố nguy liên quan đến bệnh dịch tiêu chảy cấp heo theo mẹ Sử dụng phương pháp điều tra hồi cứu sưu tra tài liệu lưu trữ ổ dịch tiêu chảy cấp: tuổi, giống, điều kiện vệ sinh thú y, cơng tác phòng trị bệnh,… để phân tích tình hình dịch bệnh yếu tố liên quan bao gồm: Hệ số tương quan R (correlation coefficient), tỉ số chênh OR (odds ratio) nguy tương đối RR (relation to relative risk) yếu tố liên quan ổ dịch Các yếu tố xem xét ảnh hưởng đến xảy dịch bệnh tiêu chảy cấp là: Quy mô chăn nuôi, nguồn nước sử dụng chăn nuôi, tiêu độc sát trùng chuồng trại, mua giống bên Căn vào khả mắc bệnh yếu tố xem xét để tính yếu tố nguy OR (odds ratio) 3.3.3 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm diện virus PED có mẫu phân heo Sử dụng phương pháp điều tra cắt ngang: Phương thức chăn nuôi, giống, chuồng trại, tình hình dịch bệnh, vệ sinh sát trùng Thơng qua phiếu điều tra, khảo sát – vấn trực tiếp chủ hộ chăn nuôi, đồng thời tiến hành thu thập mẫu (mẫu phân heo heo mẹ) để xét nghiệm Các hộ chăn nuôi điều tra lấy mẫu 3.3.3.1 Dung lượng mẫu cần nghiên cứu Theo nghiên cứu gần tình hình nhiễm PED heo tỉnh miền Nam Việt Nam Nhận thấy tỷ lệ nhiễm virus PED qua xét nghiệm mẫu phân 16,96% (Nguyễn Tất Toàn Đỗ Tiến Duy, 2012) Do đó, chúng tơi ước tính tỷ lệ nhiễm virus PED thành phố Cần Thơ khoảng 20% Theo Thrusfield (1997) với tỷ lệ nhiễm 20%, độ tin cậy 95%, độ xác tuyệt đối 5% Số mẫu cần lấy tối thiểu 246 mẫu Số mẫu heo theo mẹ dự kiến 400 mẫu phân bố theo tổng đàn đơn vị huyện trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Dung lượng mẫu lấy số quận, huyện TP Cần Thơ Tổng đàn heo Số hộ chăn nuôi Số hộ điều tra (con) (hộ) (10% hộ nuôi) Cái Răng 3.430 352 35 92 Ơ Mơn 12.655 963 96 141 Vĩnh Thạnh 24.098 1431 143 233 Tổng cộng 40.183 2.746 274 466 Quận (Huyện) Số mẫu 3.3.3.2 Phương pháp chọn mẫu Lấy mẫu phân heo (heo khỏe heo bệnh) 01 trại mẫu phân heo mẹ đàn heo Heo bệnh lấy mẫu heo có dấu hiệu: - Tiêu chảy nặng, phân nhiều nước, lười bú, nôn sữa - Heo gầy nước - Nằm tụm lại, nằm chồng lên thích nằm bụng mẹ - Bệnh xảy lây lan nhanh cho toàn đàn Cách lấy mẫu: - Mẫu phân: Lấy trực tiếp trực tràng heo tăm vô trùng (có sẵn test) Sau đưa tăm bơng vào ống dung dịch pha lỗng có test thực theo hướng dẫn nhà sản xuất kít PED-Ag - Mẫu ruột: Dự kiến 30 heo có phân dương tính PED Ag test kít mổ khám thu thập mẫu ruột non để xét nghiệm RT-PCR 3.3.3.3 Phương pháp chẩn đoán bệnh Kít PED-Ag test kit * Nguyên lý: Bộ kít dựa nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch sử dụng phương pháp Direct Sandwich Hai kháng thể (KT) đơn dòng thiết bị kết hợp đặc thù với khu định kháng nguyên khác kháng nguyên cần chẩn đoán Sau cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose thiết bị, kháng nguyên virus PED di chuyển kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus PED, để tạo thành phức chất ‘KT-KN’ Sau đó, phức hợp kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng virus PED khác màng nitơ-cellulose thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh ‘KT-KN-KT’ (“Ab-Ag-Ab” direct sandwich] * Phương pháp thực Tất thành phần có test bao gồm - Dung dịch pha loãng - Tăm - Dụng cụ thử cho kết Được lấy để nơi phẳng, sẽ, thoáng mát Chuẩn bị mẫu Lấy mẫu phân (để thăm dò diện virus PED) thực theo hướng dẫn nhà sản xuất kit PED-Ag test kit (Hình 3.3) Thực theo bước Sử dụng que tăm test kit để lấy mẫu phân trực tràng heo Cho que tăm bơng vào lọ mẫu có chứa 1ml dung dịch pha loãng (được cung cấp test kit) Khuấy xoay tròn que tăm bơng dung dịch pha loãng đến phân tan hết (khoảng 10 giây) Lấy dụng cụ xét nghiệm túi bạc, đặt nơi phẳng khô Sử dụng ống nhỏ giọt có sẵn, rút lấy dung dịch lọ mẫu hòa lẫn với phân Nhỏ 4-5 giọt dung dịch lọ mẫu hòa lẫn vào lỗ tròn dụng cụ thử nghiệm Phản ứng xảy có đường màu tím chạy dọc bảng kết (nằm dụng cụ xét nghiệm) cạnh lỗ tròn chứa dung dịch bệnh phẩm Sau phút khơng thấy có di chuyển màu tím, nhỏ thêm giọt dung dịch bệnh phẩm Đọc kết 5-10 phút 3.3.3.4 Đọc kết Ở phía bên trái giếng kết quả, màu xuất (tại chữ C), có nghĩa bước thực phản ứng cách Kết dương tính có thêm màu xuất bên phải (tại chữ T) giếng kết (Hình 3.4) Ở phía bên trái giếng kết quả, khơng có xuất màu nào, có nghĩa thao tác thực khơng đúng, khơng thực hướng dẫn quy định Do đó, phản ứng phải thực lại Hình kếtthực quả:hiện Mẫuphản âm tính, cóbộ vạch đỏ test vị kít trí C (control); Mẫu dương tính có vạch màu đỏ vị trí C T (test) với Hình 3.3 3.4 CácĐọc bước ứng kít màu PED-Ag 3.3.3.5 Sử dụng phương pháp RT-PCR số mẫu dương tính nhằm khẳng định nhiễm virus PED Heo có mẫu phân dương tính test nhanh với kít test PED-Ag, mổ khám thu mẫu ruột để xét nghiệm tái khẳng định RT-PCR Phương pháp mổ khám (theo Tiêu chuẩn, quy chuẩn ngành Thú y, 2006) - Làm chết bệnh súc biện pháp chọc tiết tiêm thuốc gây mê - Đặt heo nằm phẳng, dùng dao cắt nách tới khớp xương bả vai, cắt bẹn tới khớp hông hai bên chân Bẻ gập chân sang hai bên cho heo nằm ngửa - Dùng dao rạch lớp da từ cằm kéo dài tới cửa vào lồng ngực, cắt tiết lớp sụn xương ức hai bên lật xương ức, kéo dài tới hai bên thành bụng để bộc lộ toàn tổ chức vùng cổ, xoang ngực, xoang bụng - Quan sát biến đổi bên tổ chức: dày, ruột non, ruột già… màu sắc, kích thước, hình dáng… - Cắt tách lưỡi, thực quản, khí quản, phổi, cuối cắt đứt thực quản, mạch quản giáp với hoành (trước cắt thực quản dùng dây buộc chặt phía tránh thức ăn trào từ phía dày) Kéo tồn hệ thống dày ruột bên kiểm tra sau tránh gây nhiễm bẩn - Kiểm tra hệ thống hạch lâm ba: hạch lâm ba bẹn, hạch màng treo ruột… màu sắc, kích thước độ đàn tính… - Kiểm tra bên hệ thống tiêu hóa theo thứ tự từ dày tới hậu môn quan sát bề mặt niêm mạc đặc biệt ý tới vùng van hồi manh tràng chất chứa, dịch, màu sắc,… Thu mẫu: Tách lấy bệnh phẩm ruột non (Tá tràng, không tràng hồi tràng), đựng túi nilon đậy kín, ghi nhãn, kí hiệu mẫu đặt phích có đủ đá lạnh để gửi tới phòng xét nghiệm Bảo quản mẫu: Mẫu bệnh phẩm ruột non bảo quản nhiệt độ từ 0C – 80C xét nghiệm vòng 24 trữ mẫu -20 0C, tiến hành xét nghiệm vào ngày sau 3.3.5 Phương pháp thực tiêu vi thể Những heo dương tính với PED thu thập đoạn ruột non (tá tràng, không tràng hồi tràng) đoạn cm Những mẫu bệnh phẩm cố định formol 10%, đúc parafin hệ thống tissue processing Microm STP 120 Các slide cắt độ dày 2-7 µm, sau nhuộm phương pháp HE (Haematoxylin Eosin) Tiêu vi thể thực phòng chẩn đốn thú y Hàn Việt, Trung tâm thực nghiệm trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Sau quan sát, đọc tiêu vi thể chụp hình lại kính hiển vi quang học (40X) Đọc tiêu vi thể thực phòng thí nghiệm, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển, Cty Vemedim 3.4 Các tiêu theo dõi Số heo tiêu chảy Tỷ lệ heo tiêu chảy = x 100 Tổng số heo điều tra Số mẫu phân dương tính với PEDV Tỷ lệ mẫu phân nhiễm PEDV = x 100 Tổng số mẫu phân xét nghiệm p Khả mắc bệnh: Odd = 1-p Với p: Xác suất mắc bệnh – p: Xác suất không mắc bệnh Odd1 Yếu tố nguy cơ: OR = Odd2 Với Odd1: Khả mắc bệnh nhóm phơi nhiễm với yêu tố nguy Odd2: Khả mắc bệnh nhóm khơng phơi nhiễm với yếu tố nguy 3.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thơ xử lý tính tốn Excel, số liệu tổng hợp xử lý chương trình thống kê Minitab 16.0 Phép thử chi bình phương (χ 2) sử dụng để so sánh tỷ lệ dương tính giá trị P < 0,05 coi có ý nghĩa Phần Tham khảo thêm lấy mẫu huyết Phương pháp thực Tồng hợp phiếu điều tra báo cáo dịch bệnh mạng lưới thú y sở thời gian từ 2007 -2010 (Phiếu điều tra – xem phụ lục) Tham chiếu tổng hợp báo cáo dịch bệnh gia súc gia cầm CCTY TP.Cần Thơ, tỉnh khu vực báo cáo tổng hợp Cục Thú y thời gian tương ứng để xác định mức độ lây lan tiến triển dịch bệnh phạm vi rộng lớn Điều tra hồi cứu: điều tra 10% hộ chăn ni tồn thành phố Cần Thơ tất trang trại (585 hộ + 38 trang trại ) phân bố theo số tổng đàn heo quận huyện (bảng 3) 3.3.2 Điều tra huyết học Tất trại chăn nuôi tập trung hộ chăn ni đạt tiêu chí trang trại (≥ 20 nái ≥ 100 heo thịt toàn thành phố thu thập liệu điều tra bệnh PRRS lấy mẫu máu để kiểm tra lưu hành bệnh PRRS (Thông tư liên tịch số 69/2000/TTLT/BNN-TCTK) Các hộ chăn ni gia đình điều tra lấy mẫu đại diện sau: huyện chọn xã, xã chọn ấp để điều tra lấy mẫu huyết heo Phương pháp thực - Điều tra huyết học: tiến hành lấy mẫu 10 trại sở chăn nuôi nhỏ với 484 mẫu huyết mẫu huyết lấy ngẫu nhiên tất loại heo có tiêm vaccine phòng bệnh PRRS heo khơng tiêm phòng bệnh PRRS Nếu mẫu huyết heo khơng có tiêm vaccine dùng để xác định tỷ lệ nhiễm PRRS mẫu huyết heo có tiêm vaccine xác định khả đáp ứng miễn dịch với loại vaccine mà heo tiêm phòng Phương pháp lấy mẫu Sử dụng dây dù để khớp mõm, cố định heo, dùng bơng gòn tẩm cồn 70 o sát trùng vị trí lấy máu Sử dụng ống tiêm 10 ml với kim số 18 19 để lấy máu Mỗi mẫu lấy 2-5 ml tĩnh mạch chủ trước Gỡ kim bơm nhẹ cho máu chảy theo thành ống nghiệm vô trùng, dán nhãn ký hiệu (số tai, ngày lấy mẫu) Máu để đơng chuyển phòng thí nghiệm để ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút 10 phút để lấy huyết Huyết chiết cho vào tube nhựa vô trùng ghi ký hiệu mẫu Các huyết bảo quản -20 0C chờ xét nghiệm ... Oklahoma-Mỹ PEDV phát khoảng cách lên đến 16 km (10 dặm) Các mẫu khơng khí nhiễm PED gây nhiễm heo 7-8 tuần, kết cho thấy heo gây nhiễm có biểu lâm sàng bệnh PED virus PED phát có phân mơ Virus PED tìm... nhiễm PEDV) bị gây nhiễm chủng PEDV thích nghi mơi trường ni cấy tế bào (ca-PEDV) nhẹ nhiều so với heo nhiễm chủng PEDV chủng hoang dại (wt-PEDV) So với chủng wt-PEDV, độc lực chủng ca-PEDV yếu... Chương LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2 .1 Sơ lược tình hình nghiên cứu nước bệnh PED heo 2 .1. 1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Nghiên cứu sinh bệnh học PED, Ducatelle et al., (19 82) gây nhiễm heo 2-3 ngày