Đang tải... (xem toàn văn)
Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích Tốn nhiều thời gian nuôi cấy và phân tích, chậm thu kết quả. Mất nhiều công sức, tốn kém. Không đáp ứng yêu cầu phân tích
Bộ công thương Trường đại học công nghiệp thực phẩm HCM PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ (Hybridization) Nhóm 15 GVHD: Hồng Xn Thế NHĨM 15 Tên Phạm Ngọc Ý Vy Nguyễn Thị Hoài Yến Phạm Thị Hoài Xinh Trần Thị Thúy Vy Phạm Thị Hồng Nguyên MSSV 2022150235 2022150242 2022150117 2022150175 2022150150 Nhược điểm phương pháp phân tích vi sinh vật truyền thống - Tốn nhiều thời gian ni cấy phân tích, chậm thu kết - Mất nhiều công sức, tốn - Khơng đáp ứng u cầu phân tích thực tế Nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm áp dụng thành tựu kỹ thuật di truyền, sinh học phân tử vào lĩnh vực thực phẩm Trong đó, phương pháp lai phân tử thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật thương mại hóa dạng kit để phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Khái niệm - Mục đích: Phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò) dùng để phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật - Cơ sở lai phân tử: biến tính hồi tính DNA Khi phân tử DNA mạch đôi đun lên nhiệt độ q "nhiệt độ nóng chảy Tm" mạch đôi tách rời phá vỡ liên kết Hydro nối liền mạch Sau tách mạch, nhiệt độ phản ứng làm giảm từ từ cộng với điều kiện thích hợp, chúng bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử Khái niệm - Đặc điểm lai phân tử: tái bắt cặp xảy trình tự có trình tự hồn tồn bổ sung Các trình tự bổ sung DNA RNA dẫn đến hình thành phân tử lai DNA-DNA, RNA-RNA hay DNARNA * Quá trình lai phân tử hai mạch DNARNA Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lai phân tử * Nồng độ DNA: nghĩa số lượng trình tự bổ sung, cao xác suất tiếp xúc với tăng dẫn tới làm tăng tốc độ phản ứng lai phân tử * Thời gian phản ứng: Thời gian phản ứng dài xác suất tiếp xúc lớn số lượng phân tử lai tăng dần toàn trình tự bổ sung tái bắt cặp * Nhiệt độ: Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại nhiệt độ thấp Tm nucleic acid độ 25% Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lai phân tử * Độ dài trình tự: Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với bậc hai tốc độ dài trình tự bổ sung * Lực ion: Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần Nồng độ NaCl >1,2 M lại hồn tồn khơng tác dụng Phân loại: - Lai pha lỏng - Lai pha rắn + Southern blot + Nouthern blot + Western blot + Dot (slot) blot - Lai chỗ Phân loại - Lai pha lỏng Nguyên tắc + Các mạch đơn nằm môi trường lỏng dung dịch đệm + Sự lai phân tử xảy trình tự gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ mơi trường thấp Tm vài độ - Lai chỗ Nguyên tắc : + Lai chỗ phát triển từ phép lai Southern blot + Kỹ thuật sử dụng mồi đánh dấu (đoạn nucleotide kháng thể ) để lai với ADN, ARN với protein tế bào mà không cần tách chiết Ứng dụng : định vị gen NST, phát dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu RNA chuyên biệt tế bào mô + Lai khuẩn lạc Sử dụng để phát dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp cần tìm ngân hàng gen + Lai nhiễm sắc thể • PP cung cấp thơng tin xác vị trí phân bố trình tự DNA cần tìm NST nhờ mẫu dò chun biệt • Khi nghiên cứu với ARN, NST khơng ủ pH cao, đó, chúng giữ nguyên trạng thái sợi kép không lai với mồi • Nhờ phương pháp mà chế hoạt động gen quan sát trong tổ chức mô + Lai tế bào mơ • Trong tế bào mơ, mRNA có phân bố khơng gian xác định Điều có liên quan đến chức năng, điều hòa biểu tương tác mRNA với thành phần khác tế bào mơ • Nghiên cứu RNA tách chiết tinh không cho phép thu nhận thông tin vừa kể → sử dụng pp lai tế bào mơ • Mơ xử lí pp mơ học (cố định, khử nước, tẩm parafin, cắt lát mỏng (710µm), trải lam) Kết đọc trực tiếp lam nhờ kính hiển vi Ứng dụng: + Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp giúp định vị xác vị trí phân bố mRNA nhóm tế bào chuyên biệt tổ chức + Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào lai chỗ, giúp phát đồng thời mRNA protein → xác định mối tương qua hoạt động phiên mã dịch mã gen + Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần đồng với nhiều mẫu dò khác → xác định vị trí, phân bố tương tác mRNA tham gia vào trình sống Thử nghiệm Staphylococcus aureus PNA FISH Đây phương pháp xác định Staphylococcus aureus trực tiếp từ nuôi cấy máu phương pháp lai chỗ với mẫu dò Peptide Nucleic Acid (PNA) có gắn chất huỳnh quang Thí nghiệm dựa đầu dò PNA có dán nhãn chất phát huỳnh quang gắn vào chuỗi đặc hiệu rRNA 16S S aureus • Phương pháp xác định nhanh chóng (2,5h) S aureus trực tiếp từ chai chứa máu chứa cầu khuẩn Gram âm mọc thành chùm (GPCC) cung cấp thông tin quan trọng cho việc điều trị kháng sinh tối ưu * Các chủng tham khảo phân lập lâm sàng Mười bảy chủng tham khảo đại diện cho loài vi khuẩn loài nấm men có liên quan đến sinh học liên quan đến lâm sàng Bốn mươi tám phân lập lâm sàng đại diện cho cầu khuẩn gram dương mọc thành chùm (S aureus, CoNS bao gồm S epidermidis, Micrococcus, Stomatococcus) cụ thể S aureus xác định trực tiếp ni cấy máu tích cực GPCC * Môi trường nuôi cấy máu Hệ thống BBL Septi-Chek với môi trường Columbia broth bổ sung thêm SPS * Cách pha môi trường Pha 35 g bột L nước tinh khiết Pha trộn triệt để Đun nóng thường xun đun sơi phút đê bột hòa tan hồn tồn Thêm Sodium polyanetholesulfonate (SPS) 0,025 - 0,05% Hấp 121 ° C 15 phút Chuẩn bị tiêu 20 μl dung dịch lai với 10% dextran sulfate , 10 mM NaCl , 30% formamide , 0,2% polyvinylpyrrolidon, EDTA disodium mM , 0,1% Triton X-100 , 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) 500nM PNA có dán nhãn huỳnh quang (GCTTCTCGTCCGTTC) nhắm mục tiêu rRNA S aureus 16S Cách tiến hành • Chuẩn bị tiêu • Ủ 90 phút 55°C • Ngâm khoảng 20 ml dung dịch Tris mM (pH 10), 15 mM NaCl , 0,1% Triton X-100 55°C rửa 30 phút • Vết bôi cuối gắn kết cách sử dụng giọt IMAGEN Mounting Fluid • Quan sát kính hiển vi huỳnh quang S aureus xác định cầu khuẩn mọc thành chùm phát quang Kết dương tính cho S aureus phát huỳnh quang màu xanh vết đỏ Ứng dụng lai phân tử : + Một thoi sinh học – tRNA + Trên tờ Science (1 July 2005), nhóm tác giả Tohru Yoshihisa cho tho thấy tRNA trưởng thành tế bào chất chủ động quay trở lại nhân nơi mà chúng sinh + Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai chỗ có hỗ trợ chất phát hùynh quang (fluorescence in situ hybridization) để lần theo di chuyển chúng nấm men + Y học: • Trong lĩnh vực y học, dùng pp với thú cần để thực thử nghiệm việc trị bệnh cho người Nếu lồi thú tìm thấy có di truyền tương đồng với người qua việc lai DNA, có khả phương pháp chữa bệnh cho người khám phá việc thực phẫu thuật dựa kinh nghiệm loài thú + Chăn ni : • Trong ngành thủy sản, dùng pp lai chỗ (in situ hybridization) để chẩn đoán bệnh virus đốm trắng tôm + Thực phẩm : • Dùng pp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen ... Phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò) dùng để phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật - Cơ sở lai phân tử: biến tính hồi tính DNA Khi phân tử. .. điểm + Phân tích định lượng phân tử lai xác + Hiệu thấp + Vận tốc lai pha rắn