TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 10034:2013 ISO 1871:2009 THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Food and feed products - General guidelines for the determination of nitrogen by the Kjeldahl method Lời nói đầu TCVN 10034:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 1871:2009; TCVN 10034:2013 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố Lời giới thiệu Đối với sản phẩm thực phẩm thức ăn chăn nuôi có nguồn gốc động vật thực vật, để xác định hàm lượng nitơ thường sử dụng phương pháp Kjeldahl Về nguyên tắc, phương pháp Kjeldahl chuẩn hóa được, phương pháp thường chấp nhận thiết bị khác phương pháp tương tự cho kết tương đương Mục đích tiêu chuẩn mô tả bước khác phương pháp, điểm tới hạn kèm theo mục tiêu tối thiểu đạt nhằm đảm bảo phương pháp áp dụng xác Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung tiêu chuẩn không dùng để thay tiêu chuẩn hành sử dụng THỰC PHẨM VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI - HƯỚNG DẪN CHUNG VỀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL Food and feed products - General guidelines for the determination of nitrogen by the Kjeldahl method CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn đưa hướng dẫn chung để xác định hàm lượng nitơ phương pháp Kjeldahl Tiêu chuẩn áp dụng cho thực phẩm thức ăn chăn ni có chứa hợp chất nitơ xác định trực tiếp phương pháp Kjeldahl CHÚ THÍCH Ngun tắc đo phương pháp khơng tính đến nitơ từ nitrat nitrit Nguyên tắc Phân hủy phần mẫu thử axit sulfuric đậm đặc với có mặt chất xúc tác để chuyển hóa nitơ hữu thành amoni sulfat Natri hydroxit dư thêm vào dịch phân hủy nguội để giải phóng amoniac Amoniac giải phóng chưng cất vào dung dịch axit boric dư, sau chuẩn độ dung dịch axit sulfuric axit clohydric chuẩn Hàm lượng nitơ tính từ lượng ammoniac tạo thành CHÚ THÍCH Trong phần tiếp theo, thuật ngữ "nitơ" dùng để nitơ hữu Thuốc thử Chỉ sử dụng loại thuốc thử tinh khiết phân tích, nước cất nước khử khống nước có chất lượng tương đương, trừ có quy định khác 3.1 Axit sulfuric, khơng chứa hợp chất nitơ có khối lượng riêng từ ρ20 = 1,83 g/ml đến ρ20= 1,84 g/ml 3.2 Chất xúc tác (xem 5.2.1) 3.3 Dung dịch axit boric, (nồng độ từ 10 g/l đến 40 g/l tùy thuộc vào thiết bị sử dụng) Nếu sử dụng phép đo điểm kết thúc chuẩn độ so màu, dung dịch axit boric phải chứa chất thị (chỉnh pH màu hỗn hợp dung dịch trước sử dụng) 3.4 Dung dịch axit clohydric chuẩn (nồng độ từ 0,02 mol/l đến 0,50 mol/l) dung dịch axit sulfuric chuẩn (nồng độ từ 0,01 mol/l đến 0,25 mol/l) Độ chuẩn dung dịch, ct, phải biết đến khoảng 0,001 mol/l 3.5 Chất thị, đổi màu khoảng pH đến pH CHÚ THÍCH Các chất thị khác có bán sẵn Hỗn hợp thị màu đỏ metyl xanh bromocresol sử dụng rộng rãi Dung dịch axit boric chứa hỗn hợp thị màu có bán sẵn 3.6 Hydro peroxit (H2O2), tối thiểu 30 % khối lượng 3.7 Dung dịch natri hydroxit, tối thiểu 30 % khối lượng 3.8 Chất chống tạo bọt Ví dụ Silicon, parafin dạng lỏng 3.9 Amoni sulfat amoni clorua (độ tinh khiết tối thiểu 99,9 %) Ngay trước sử dụng, sấy amoni sulfat amoni clorua 104 °C ± °C h, để nguội nhiệt độ phòng bình hút ẩm CHÚ THÍCH Có thể sử dụng dung dịch biết nồng độ 3.10 Tryptophan axetanilit lysin hydroclorua (độ tinh khiết tối thiểu 99 % khối lượng) Các loại thuốc thử cần phải giữ cách xa nguồn ẩm CẢNH BÁO – Không sấy loại thuốc thử tủ sấy trước sử dụng 3.11 Sucrose, có hàm lượng nitơ nhỏ 0,002 % khối lượng CẢNH BÁO – Không sấy sucrose tủ sấy trước sử dụng Thiết bị, dụng cụ vật liệu thử Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: 4.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,001 g 4.2 Hệ thống phân hủy, chưng cất nước chuẩn độ Các hệ thống sử dụng để thực thao tác quy định Điều để đảm bảo mục tiêu thực quy định 5.5.3 5.5.4 thỏa mãn 4.3 Chất điều chỉnh điểm sơi (nếu cần), ví dụ viên đá bọt, hạt thủy tinh, nhôm oxit (corundum) silic cacbua 4.4 Giấy cân vật liệu cân, không chứa hợp chất nitơ, thích hợp cho phần mẫu thử dạng sản phẩm 5 Cách tiến hành CHÚ THÍCH Tùy thuộc vào chất mẫu mà chuẩn bị trước phần mẫu thử để thu mẫu đồng (nghiền, đồng hóa, v.v ) 5.1 Phần mẫu thử Phần mẫu thử lấy phụ thuộc vào hàm lượng nitơ dự kiến có mặt mẫu, phải đại diện cho mẫu chứa khoảng từ 0,005 g đến 0,2 g nitơ Dùng cân phân tích (4.1) để cân khối lượng phần mẫu thử, m, tính gam dùng pipet để lấy thể tích phần mẫu thử, Vt, tính mililit Phần mẫu thử cho trực tiếp vào ống cho qua giấy cân (4.4) Khối lượng phần mẫu thử điều chỉnh phụ thuộc vào thành phần sản phẩm dùng phép thử lượng axit sulfuric (xem 5.2.2) 5.2 Phân hủy 5.2.1 Chất xúc tác Cần phân biệt hợp chất sử dụng để nâng điểm sôi chất lỏng suốt trình phân hủy với chất xúc tác tạo điều kiện thuận lợi cho trình phân hủy Trước thường sử dụng kali sulfat natri sulfat Các chất xúc tác thêm vào với lượng vừa đủ để làm tăng điểm sôi axit từ 380 °C đến 430 °C Chất xúc tác sử dụng phổ biến đồng dạng tinh thể đồng sulfat sử dụng riêng dạng hỗn hợp với titan oxit Cho vào ống từ ml đến ml hydro peroxit (3.6) trước làm nóng để tăng tốc độ phân hủy cần sử dụng hydro peroxit cẩn thận để đảm bảo khơng làm thất nitơ dạng bay Ngoài ra, cần ý cho hydro peroxit vào ống, xảy phản ứng tỏa nhiệt mạnh Lượng kali sulfat từ chất xúc tác không g Có thể sử dụng tổ hợp khác Các tổ hợp phải đáp ứng yêu cầu phép thử mẫu trắng (5.5.2) phép thử kiểm soát (5.5.3 5.5.4) Người thực cần cẩn thận sử dụng chất xúc tác chứa selen điều kiện thải bỏ CHÚ THÍCH Các chất xúc tác hỗn hợp có bán sẵn thị trường (ví dụ dạng viên dạng hạt) 5.2.2 Bổ sung axit Điều quan trọng sử dụng lượng vừa đủ axit sulfuric để đảm bảo cho trình phân hủy do: - Sự tiêu tốn axit chất hữu có mẫu, thực tế g chất béo tiêu tốn 10 ml axit sulfuric, g protein tiêu tốn ml axit sulfuric, g cacbohydrat tiêu tốn ml axit sulfuric; - Sự tiêu tốn axit thuốc thử (các muối); - Hao hụt axit bay Thêm từ 20 ml đến 25 ml axit (3.1) vừa đủ để phân hủy tốt để trì lượng axit dư cuối phản ứng 5.2.3 Làm nóng CẢNH BÁO – Các thao tác phải thực tủ hút thơng gió tốt Cần tn thủ hướng dẫn nhà sản xuất liên quan đến việc sử dụng thiết bị Hệ thống phân hủy phải đồng đều, ví dụ cách tạo sơ đồ quy trình phân hủy quy trình nhiệt hiệu (5.5.3) Đối với mẫu có chứa chất sinh bọt cần đưa đến điểm sôi cách tăng nhiệt độ từ từ tăng nhiệt độ theo giai đoạn Có thể sử dụng từ ba đến bốn giọt chất chống tạo bọt (3.8) cho ống Đối với sản phẩm “khô” (nghĩa không thấy ướt), ống đặt trực tiếp vào phận gia nhiệt sơ Khói axit phải loại bỏ hệ thống chiết thích hợp thiết bị sử dụng Việc chiết mức gây kết tinh hao hụt nitơ (xem Phụ lục A) Trong trường hợp, nhiệt độ thời gian phân hủy cần xác định để đáp ứng u cầu phép thử kiểm sốt q trình phân hủy (5.5.3) CHÚ THÍCH Đun nóng 420 °C h thích hợp nhiều loại mẫu Dịch phân hủy phải hạt màu đen Tại cuối q trình phân hủy, làm nguội ống cách xa nguồn có khả nhiễm bẩn Ở giai đoạn này, phần mẫu thử bảo quản để chưng cất sau CHÚ THÍCH Bước pha lỗng nước quy định 5.3.1 thực giai đoạn để tránh kết tinh 5.3 Chưng cất amoniac 5.3.1 Kiềm hóa Pha lỗng dịch phân hủy nước kiềm hóa cách thêm 3,5 ml dung dịch natri hydoxit (3.7) cho mililit axit sulfuric (3.1) sử dụng cho trình phân hủy CHÚ THÍCH Thể tích dung dịch natri hydroxit (3.7) thêm vào thấp hơn, nồng độ khối lượng dung dịch natri hydroxit cao 30 % CẢNH BÁO – Phải cẩn thận bổ sung dung dịch, mơi trường nóng 5.3.2 Chưng cất Thực trình chưng cất sử dụng thiết bị điều kiện hoạt động bình thường Thu lấy dịch chưng cất vào dung dịch axit boric (3.3) có chứa chất thị (3.5) Chỉnh pH dung dịch chuyển sang màu xám (chất thị xanh bromocresol + đỏ metyl) trước bắt đầu chưng cất Có nhiều tiêu chí để xác định điểm kết thúc trình chưng cất, ví dụ thu thể tích xác định dịch chưng cất sau thời gian chưng cất định v.v Đảm bảo phù hợp với phép thử kiểm sốt (5.5), q trình chưng cất amoniac xảy hồn tồn khơng có dung dịch kiềm bị lôi theo 5.4 Chuẩn độ Dịch chưng cất thu được chuẩn độ axit sulfuric (3.1) axit clohydric (3.4); chuẩn độ đồng thời sau chưng cất Chuẩn độ sau chưng cất cần thực sớm tốt sau chưng cất Có hai phương pháp để nhận biết điểm kết thúc chuẩn độ: - Bằng phép so màu mắt thường sử dụng hệ thống đo quang: Điểm kết thúc đạt chất thị đổi màu Trong trường hợp nhìn mắt thường điều quan trọng để chuẩn độ mẫu thử dựa vào điều kiện thu phép thử mẫu trắng - Bằng phép phân tích điện sử dụng hệ thống đo pH: Tùy thuộc vào thiết bị phương pháp thực mà điểm kết thúc giá trị pH cố định (thường pH 4,6 tương ứng với điểm uốn đường chuẩn độ), giá trị pH thu phép thử mẫu trắng pH ban đầu dung dịch axit boric Trong hai trường hợp trên, tính phù hợp thao tác chuẩn độ cần kiểm tra theo quy định 5.5.4 Ghi lại thể tích chất chuẩn độ thu được: V0 phép thử mẫu trắng V1 mẫu thử 5.5 Phép thử kiểm soát 5.5.1 Yêu cầu chung Đối với dãy phép xác định nitơ cần có phép thử mẫu trắng, phép thử kiểm sốt q trình chưng cất phép thử kiểm sốt q trình phân hủy 5.5.2 Phép thử mẫu trắng Thực phép thử mẫu trắng sử dụng phương pháp quy định trên, thay phần dung dịch mẫu thử thể tích nước bổ sung lượng sucrose (3.11) thích hợp CHÚ THÍCH Trong phép thử mẫu trắng phép thử kiểm sốt q trình phân hủy, sucrose sử dụng chất hữu tiêu tốn lượng axit sulfuric tương đương với lượng axit sulfuric dùng cho phần mẫu thử trình phân hủy 5.5.3 Phép thử phân hủy Thực phép thử kiểm sốt q trình phân hủy sử dụng phương pháp quy định trên, thay phần mẫu thử lượng tryptophan axetanilit lysin hydroclorua (3.10) có lượng nitơ mẫu thử bổ sung lượng sucrose (3.11) thích hợp Tính phần trăm khối lượng nitơ thu hồi được, cần nằm khoảng từ 98 % đến 101 % 5.5.4 Phép thử chưng cất-chuẩn độ Thực phép thử chưng cất-chuẩn độ mẫu trắng sử dụng phương pháp quy định 5.3, khơng có phần mẫu thử Thể tích thu trừ từ thể tích dung dịch phép thử chưng cất-chuẩn độ Thực phép thử kiểm sốt q trình chưng cất-chuẩn độ điều kiện tương tự phần mẫu thử muối amoni (3.9) tương ứng với lượng nitơ có mẫu thử Tính phần trăm khối lượng nitơ thu hồi được, cần nằm khoảng từ 99 % đến 101 % Biểu thị kết Hàm lượng nitơ biểu thị phần trăm khối lượng tính gam 100 ml, theo cơng thức: (V1 − V0 ) × ct × 14 × 100 m × 100 (V1 − V0 ) × ct × 14 × 100 Vt × 1000 Trong đó: m khối lượng phần mẫu thử, tính gam (g); ct độ chuẩn axit clohydric axit sulfuric, tính mol lít (mol/l); V0 thể tích axit clohydric axit sulfuric dùng phép chuẩn độ mẫu trắng, tính mililit (ml); V1 thể tích axit clohydric axit sulfuric dùng phép chuẩn độ phần mẫu thử, tính mililit (ml); Vt thể tích phần mẫu thử, tính mililit (ml) PHỤ LỤC A (Tham khảo) CÁC NGUỒN CÓ KHẢ NĂNG GÂY SAI SỐ Các lỗi ghi lại Nguyên nhân Các giải pháp dự kiến Trong suốt trình phân hủy Quá nhiều bọt khí bọt Tăng nhiệt độ nhanh Giảm tốc độ đun nóng điều chỉnh giai đoạn Các mẫu thử chứa chất béo chứa đường Sử dụng chất chống tạo bọt Thể tích dung dịch mẫu thử Sử dụng phần mẫu thử nhỏ lớn Các hạt màu đen dịch phân hủy Thời gian chưng cất/nhiệt độ chưng cất khơng thích hợp Tối ưu hóa điều kiện: kiểm tra lại q trình phân hủy (5.5.3) Kiểm tra tỷ lệ mẫu/axit/chất xúc tác Kết tinh dạng hạt Hao hụt axit hệ thống chiết bay mạnh Giảm tốc độ chiết: tốc độ chiết giảm nhanh tốt hết khói trắng Kiểm tra tỷ lệ mẫu/axit/chất xúc tác Trong trình chưng cất xác định hàm lượng nitơ Kết phép thử chưng cấtchuẩn độ thấp Kết phép thử chưng cấtchuẩn độ cao Hao hụt amoniac Kiểm tra độ kín thiết bị (các mối hàn kín dụng cụ thủy tinh) Lượng axit boric không đủ Giảm nồng độ thể tích dung dịch axit boric Lơi amoniac chưa hết Giảm thời gian chưng cất Phép đo độ chuẩn axit khơng xác Chuẩn độ axit Kết phép thử chưng cấtchuẩn độ mẫu trắng cao Tiến hành phép thử mẫu trắng Phép đo độ chuẩn axit khơng xác Chuẩn độ axit Nhiễm bẩn bay amoniac Tránh xử lý amoniac vùng lân cận nơi thực phép thử Lôi natri hydroxit dịch Giảm thể tích nước thêm vào chưng cất trước chưng cất Kết phép thử phân hủy Thời gian/nhiệt độ phân hủy thấp không thích hợp Tối ưu điều kiện: kiểm tra phép thử phân hủy (5.5.3) Kiểm tra tỷ lệ mẫu/axit/chất xúc tác THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4328-1:2007 (ISO 5983-1:2005) Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng nitơ tính hàm lượng protein thơ - Phần 1: Phương pháp Kjeldahl [2] TCVN 8099-1:2009 (ISO 8968-1:2001) Sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phần 1: Phương pháp Kjeldahl [3] TCVN 8125:2009 (ISO 20483:2006) Ngũ cốc đậu đỗ - Xác định hàm lượng nitơ tính hàm lượng protein thơ - Phương pháp Kjeldahl  ... [1] TCVN 4328-1:2007 (ISO 5983-1:2005) Thức ăn chăn nuôi - Xác định hàm lượng nitơ tính hàm lượng protein thơ - Phần 1: Phương pháp Kjeldahl [2] TCVN 8099-1:2009 (ISO 8968-1:2001) Sữa - Xác định. .. (ISO 8968-1:2001) Sữa - Xác định hàm lượng nitơ - Phần 1: Phương pháp Kjeldahl [3] TCVN 8125:2009 (ISO 20483:2006) Ngũ cốc đậu đỗ - Xác định hàm lượng nitơ tính hàm lượng protein thơ - Phương pháp... với lượng nitơ có mẫu thử Tính phần trăm khối lượng nitơ thu hồi được, cần nằm khoảng từ 99 % đến 101 % Biểu thị kết Hàm lượng nitơ biểu thị phần trăm khối lượng tính gam 100 ml, theo cơng thức: