BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẠM TIẾN DŨNG Phạm Tiến Dũng CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHỐ 2015B Hà Nội– Năm 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Phạm Tiến Dũng NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT RNA VI RÚT TỪ CÁC LOẠI NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS LÊ QUANG HÒA Hà Nội – Năm 2017 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 13 1.1 Tình hình tiêu thụ xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam 13 1.2 Tác nhân gây ngộ độc thực phẩm phổ biến: Norovirus HAV 15 1.2.1 Norovirus 16 1.2.2 Virút viêm gan A 17 1.3 Khó khăn phát virút thực phẩm 18 1.4 Chiến lƣợc phát virút thực phẩm 19 1.5 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm 19 1.5.1 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm cách rửa giải cô đặc virút 19 1.5.2 Quy trình tách chiết virút từ thực phẩm cách xử lý proteinase K 23 1.5.3 Quy trình tách chiết trực tiếp virút từ thực phẩm 24 1.6 Quy trình tinh dịch rửa giải / cô đặc virút RNA sau tách chiết 24 1.7 Kiểm sốt q trình tách chiết tinh RNA virút từ thực phẩm 27 1.8 Các phƣơng pháp phát Norovirus HAV 28 1.8.1 Phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử 28 1.8.2 Kỹ thuật ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 28 1.8.3 Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 29 1.8.4 Kỹ thuật RT-LAMP (Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification) 30 1.9 Phƣơng pháp phát định lƣợng HAV NoV nhuyễn thể hai mảnh vỏ ISO/TS 15216-1:2013 ISO/TS 15216-2:2013 30 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng 1.9.1 Nguyên tắc phương pháp ISO 30 1.9.2 Các nghiên cứu giới sử dụng phương pháp ISO 31 CHƢƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 34 2.1 Vật liệu nghiên cứu 34 2.1.1 Chủng virút mẫu chuẩn RNA 34 2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 34 2.1.3 Mồi mẫu dò 34 2.1.4 Hóa chất 34 2.1.5 Thiết bị 35 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 35 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 35 2.2.2 Phương pháp Trizol 37 2.2.3 Phương pháp tinh cột silica Purelink RNA mini Kit 38 2.2.4 Phương pháp xử lý mẫu CTAB 39 2.2.5 Phương pháp kết tủa RNA LiCl 40 2.2.6 Phương pháp tinh bi từ silica 41 2.2.7 Phương pháp Real-time RT-PCR 41 2.2.8 Phương pháp tách chiết RNA virút theo ISO/TS 15216-2:2013 43 2.2.9 Phương pháp nhiễm chủ động Mengovirus, Norovirus HAV theo ISO 44 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 3.1 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phƣơng pháp dựa Trizol màng silica 45 3.1.1 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp A (Trizol) 46 3.1.2 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp B (Trizol tinh Purelink RNA mini Kit) 48 3.1.2 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp C (Trizol, tinh Purelink RNA mini Kit kết tủa với LiCl) 49 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng 3.1.3 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp D (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit xử lý với CTAB) 50 3.1.3 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp E (Trizol, tinh Purelink RNA mini Kit, xử lý CTAB kết tủa với LiCl) 51 3.1.6 Tổng hợp kết tách chiết tinh sách RNA Mengovirus phương pháp dựa Trizol màng silica 53 3.2 Hiệu tinh RNA Mengovirus bi từ silica 57 3.2.1 Tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao 57 3.2.2 Tối ưu nồng độ cồn dịch ủ với bi từ silica để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao 58 3.2.3 Tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus tinh bi từ silica 59 3.3 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phƣơng pháp E phƣơng pháp ISO mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ đƣợc nhiễm chủ động 61 3.3.1 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus mẫu hàu, ngao vẹm nhiễm chủ động ngưỡng virút 63 3.3.2 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phương pháp E phương pháp ISO mẫu hàu nhiễm chủ động 64 3.3.3 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phương pháp E phương pháp ISO mẫu ngao nhiễm chủ động 65 3.3.4 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phương pháp E phương pháp ISO mẫu vẹm nhiễm chủ động 67 3.3.5 Tổng hợp kết so sánh phương pháp E phương pháp ISO tách chiết RNA từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ nhiễm chủ động virút 69 3.4 So sánh hiệu tách chiết phƣơng pháp ISO phƣơng pháp E tách chiết NoV từ mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên 71 3.5 Ứng dụng thử nghiệm phƣơng pháp E để tách chiết RNA virút từ nhuyễn thể mảnh vỏ 75 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO 81 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng thí nghiệm Kỹ thuật gen, Trung tâm nghiên cứu phát triển Công nghệ Sinh học, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, Viện nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm viện Cơng nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, bạn sinh viên, học viên trường Đại học Bách khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn TS Elisabetta Suffredini (Istituto Superiore di Sanità) giúp đỡ tơi q trình thực luận văn Đặc biệt xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa Học Công Nghệ cấp kinh phí cho nhiệm vụ Nghị Định Thư Việt Nam Cộng hòa Ý với tiêu đề “Nghiên cứu phát triển phương pháp, cơng cụ phân tích nhanh vi sinh vật gây bệnh độc tố sản phẩm thủy sản”, mã số : 06/2014/HĐ-NĐT để tơi hồn thành nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn ! Học viên Phạm Tiến Dũng Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu công bố đề tài : “Nghiên cứu xây dựng ứng dụng thử nghiệm quy trình tách chiết RNA virút từ loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ” trung thực, thực hướng dẫn TS Lê Quang Hòa chưa cơng bố cơng trình khoa học khác Học viên Phạm Tiến Dũng Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ/ thuật ngữ Từ viết tắt AdV Adenovirus BSA bovine serum albumin CIAA Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1) CTAB Cetyl trimethylammonium bromide DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay EtOH Ethanol G Genogroup HAV Hepatitis A virus ISO International Organization for Standardization LBM Live bivalve molluscs LiCl Lithium chloride NoV Norovirus ORF Open reading frame RNA Ribonucleic acid RoV Rotavirus RT-LAMP Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction RT-qPCR Real time Reverse transcriptase polymerase chain reaction Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số lô hàng nhuyễn thể Việt Nam xuất sang châu Âu bị phát nhiễm Norovirus……………………………………………………………………… 14 Bảng 1.2 Đệm rửa giải chất thêm vào để tách chiết virus từ mẫu thực phẩm 21 Bảng 1.3 Thuận lợi khó khăn phương pháp sử dụng để cô đặc hạt virút…………………………………………………………………………………… 23 Bảng 1.4 Tổng kết phương pháp ly giải virus, cô đặc tách chiết axit nucleic từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa kỹ thuật RT-PCR………………………………… 26 Bảng 2.1 Trình tự mồi mẫu dò định lượng Mengovirus, NoV HAV sử dụng phản ứng RT-qPCR………………………………………………………………42 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV HAV 42 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR định lượng Mengovirus, NoV HAV 43 Bảng 3.1 Kết đánh giá hiệu tách chiết tinh phương pháp A (Trizol) kỹ thuật RT-qPCR……………………………………………………….47 Bảng 3.2 Kết đánh giá hiệu tách chiết tinh phương pháp B (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit) kỹ thuật RT-qPCR……………… 49 Bảng 3.3 Kết đánh giá hiệu tách chiết tinh phương pháp C (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit kết tủa RNA LiCl) kỹ thuật RT-qPCR……………………………………………………………………………… 50 Bảng 3.4 Kết đánh giá hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp D (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit xử lý CTAB) kỹ thuật RT-qPCR…………………………………………………………………………51 Bảng 3.5 Kết đánh giá hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp E (Trizol kết hợp với Purelink RNA mini Kit, xử lý với CTAB kết tủa RNA LiCl) kỹ thuật RT-qPCR…………………………………………… 52 Bảng 3.6 Hiệu tách chiết tinh RNA Mengovirus phương pháp dựa Trizol màng silica…………………………………………………………53 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng Bảng 3.7 Kết tối ưu lượng bi từ silica sử dụng để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao…………………………………………………………………………… 58 Bảng 3.8 Kết tối ưu nồng độ cồn dịch ủ với bi từ silica để tinh RNA Mengovirus đạt hiệu cao…………………………………………………… 59 Bảng 3.9 Kết tối ưu nhiệt độ rửa giải RNA Mengovirus tinh bi từ silica…………………………………………………………………………………… 60 Bảng 3.10 nồng độ HAV NoV ngưỡng nhiễm chủ động vào mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ……………………………………………………………… 61 Bảng 3.11 nồng độ phiên thể gen HAV NoV plasmid dựng đường chuẩn định lượng RT-qPCR………………………………………………… 61 Bảng 3.12 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Mengovirus mẫu hàu, ngao vẹm nhiễm chủ động ngưỡng virút……………………………………………… 63 Bảng 3.13 So sánh hiệu tách chiết RNA virút phương pháp E phương pháp ISO mẫu hàu nhiễm chủ động……………………………………….64 Bảng 3.14 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GI mẫu hàu nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 64 Bảng 3.15 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GII mẫu hàu nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………65 Bảng 3.16 So sánh hiệu suất thu hồi RNA HAV mẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………………… 65 Bảng 3.17 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GI mẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 66 Bảng 3.18 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GII mẫu ngao nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 66 Bảng 3.19 So sánh hiệu suất thu hồi RNA HAV mẫu vẹm nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO…………………………………….67 Bảng 3.20 So sánh hiệu suất thu hồi RNA Norovirus GI mẫu vẹm nhiễm chủ động phương pháp E phương pháp ISO……………………… 68 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng Hình 3.2 Đồ thị so sánh lượng Norovirus GI phát phương pháp ISO phương pháp E mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên Các mẫu âm tính với phương pháp E cho kết âm tính với phương pháp ISO Các mẫu dương tính với phương pháp ISO cho kết dương tính với phương pháp E Ngồi số mẫu âm tính với phương pháp ISO lại cho kết dương tính với phương pháp E Hiệu tách chiết phương pháp thể rõ Hình 3.2 Hình 3.3 Nhìn vào Hình 3.2, dễ dàng nhận thấy lượng Norovirus GI phát từ phương pháp E cao nhiều so với lượng Norovirus GI phát từ phương pháp ISO Hơn nữa, số mẫu âm tính với phương pháp ISO lại cho kết định lượng cao với phương pháp E 73 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng Hình 3.3 Đồ thị so sánh lượng Norovirus GII phát phương pháp ISO phương pháp E mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên Nhìn vào Hình 3.3, dễ dàng nhận thấy lượng Norovirus GII phát từ phương pháp E cao nhiều so với lượng Norovirus GI phát từ phương pháp ISO Hơn nữa, số mẫu âm tính với phương pháp ISO lại cho kết định lượng cao với phương pháp E Tổng kết lại, nhận thấy xem xét đến lượng virút phát mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tự nhiên, phương pháp E cho thấy khả phát vượt trội nhiều (trung bình phát hàng chục ngàn phiên bản) so với phương pháp ISO (chỉ phát vài trăm phiên chí không phát được) 74 Luận văn thạc sĩ khoa học 3.5 Phạm Tiến Dũng Ứng dụng thử nghiệm phƣơng pháp E để tách chiết RNA virút từ nhuyễn thể mảnh vỏ Sau có kết kiểm chứng hiệu phương pháp E mẫu nhiễm chủ động mẫu tự nhiên, tiến hành tách chiết 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập chợ lớn siêu thị Việt Nam định lượng loại virút HAV, NoV GI NoV GII theo kỹ thuật RT-qPCR Kết phân tích việc định lượng loại virút HAV, NoV GI, NoV GII hiệu suất thu hồi trình bày Bảng 3.27 Hiệu suất thu hồi trung bình mẫu hàu ngao 42,9% (dao động từ 11,6% đến 137,6%) 63,2% (dao động từ 10,1% đến 173,4%) Bốn mẫu nhuyễn thể cho kết âm tính tất virút quan tâm, với hiệu suất thu hồi mẫu (13,6% - 55,7%) chấp nhận theo tiểu chuẩn ISO HAV có mặt mẫu ngao với mức nhiễm tạp 2,2×105 phiên thể gen/g mẫu nhuyễn thể Trong đó, nhiễm tạp NoV cao (26/30 mẫu, chiếm 86,7%), NoV GI 15/30 mẫu (chiếm 50%), NoV GII 24/30 mẫu (chiếm 80%) Mức nhiễm tạp NoV dao động từ 1.5×10 đến 3.7×105 phiên thể gen/g mẫu NoV GI từ ngưỡng định lượng (230 phiên thể gen/g) tới 1.9×105 phiên thể gen/g NoV GII Việc phát Norovirus HAV 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập chợ lớn siêu thị Việt Nam cho thấy loại virút có mặt sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ nước ta Như vậy, tồn khả ngộ độc thực phẩm từ sản phẩm Hơn nữa, lô hàng xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ nước ta đứng trước nguy bị trả lại khơng kiểm sốt chất lượng chặt chẽ 75 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng Bảng 3.26 Kết định lượng loại virút RT-qPCR ứng dụng phương pháp E để tách chiết 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập Việt Nam STT Hiệu suất thu hồi (%) NoV GI (phiên thể gen /g) NoV GII (phiên thể gen bản/g) HAV (phiên thể gen bản/g) Tên mẫu 131% 2600 102 - HMT 16.6.16 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 71% 77% 37% 53% 62% 153% 55% 11% 53% 14% 41% 54% 10% 76% 166% 66% 74% 41% 29% 34% 28% 58% 21% 40% 24% 22% 14% 40% 44% 203111 207778 243778 16178 6400 45556 310222 88889 42222 358000 8000 3956 1402 18489 - 12156 289 25 1158 143 104889 26222 48000 1053 74444 2822 1647 9200 5711 4000 177778 3467 3600 4711 125 749 240 1442 214222 - NKL 10.11.15 NKL 21.3.16 NMT 4.4.16 NDT 15.11.16 C.24.5.16 NMT 06.05.16 C.18.5.16 HGL 12.7.16 HKL 02.08.16 HMT 27.7.16 NMT 13.7.16 NBC 9.8.16 NMT 26.7.16 NQN 6.5.16 NMT 27.5.16 NKL 30.5.16 NCT 7.3.16 HBC 05.07.16 NKL 20.7.16 NBC 29.8.16 NBC 24.5.16 HKL 20.7.16 HKL 12.09.16 HGL 24.08.16 HKL 07.07.16 NMT 9.9.16 HKL 30.8.16 NKL 30.8.16 HBC 29.8.16 76 Luận văn thạc sĩ khoa học Phạm Tiến Dũng Bảng 3.27 Phân tích kết sử dụng phương pháp E định lượng RNA HAV NoV 30 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập Việt Nam Hàu (n=11) Ngao (n=19) Tổng số (n=30) Tỉ lệ mẫu dƣơng tính Khoảng dao dộng (phiên bản/g) Tỉ lệ mẫu dƣơng tính Khoảng dao dộng (phiên bản/g) Tỉ lệ mẫu dƣơng tính Khoảng dao dộng (phiên bản/g) HAV 0/11 - 1/19 2,2 × 105 1/30 2,2 × 105 NoV GI 3/11 1,5 × 103 – 8,4 × 103 12/19 4,1 × 103 – 3,7 × 105 15/30 1,5 × 103 – 3,7 × 105 NoV GII 7/11