BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - PHẠM ÍCH TÙNG NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH CHẾ POLIOVIRUS PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN VẮC XIN BẠI LIỆT BẤT HOẠT CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG GS.TS NGUYỄN ĐĂNG HIỀN Hà Nội - Năm 2017 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng- CB150061 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Luận văn “Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt” cơng trình nghiên cứu tơi nhóm nghiên cứu sản xuất vắc xin bại liệt bất hoạt thuộc Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế thực hướng dẫn PGS.TS Trương Quốc Phong GS.TS Nguyễn Đăng Hiền Tơi nhận đồng ý trưởng nhóm tất thành viên nhóm nghiên cứu việc công bố nội dung thực kết thu Các nội dung nghiên cứu kết trình bày luận văn trung thực rõ ràng Học viên Phạm Ích Tùng Xác nhận quan (Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế) Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS.TS Trương Quốc Phong Giám đốc - Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học - Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình bảo em suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Đăng Hiền Giám đốc trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế, tận tình bảo cho em suốt trình nghiên cứu để hoàn thành luận văn Em xin cảm ơn thầy, cô môn Công nghệ Sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền đạt kiến thức cho em trình học tập rèn luyện Trong thời gian học tập nghiên cứu nhận dạy tận tình đầy trách nhiệm tập thể cán nghiên cứu thuộc Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế, xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Cuối cùng, cho phép gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè ln quan tâm, cổ vũ cho vững bước đường học tập nghiên cứu Hà Nội, tháng 10 Năm 2017 Học viên Phạm Ích Tùng Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 CÁC CHỮ VIẾT TẮT ARN Axit Ribonucleic ATCC American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ) BS Bovine serum (huyết bê) BTP Bán thành phẩm CCID50 Cell Culture Infective Dose 50 (liều gây hủy hoại 50% tế bào) DU D-antigen unit ( đơn vị kháng nguyên D) FBS Fetal Bovine serum (huyết bê bào thai) GMP Good Manufacturing Practice (Thực hành sản xuất tốt) IgA Imuno globulin A IgG Imuno globulin G IgM Imuno globulin M K Mẫu đối chứng âm MCB Master Cell Bank (ngân hàng tế bào gốc) MEM Minimum Essential Medium (Môi trường cần thiết tối thiểu) MS Master Seed (chủng giống gốc) PB Phospate Buffer POLYVAC Center for Research and Production of Vaccines and Biologicals (Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế) TCMR Tiêm chủng mở rộng TGC Thioglycolate SCD Soybean Casein Digest Vero Tế bào thận khỉ Cercopithecus aethiops WCB Working Cell Bank (ngân hàng tế bào sản xuất) WHO/ TCYTTG World Health Organization /Tổ chức y tế giới WS Working Seed (chủng sản xuất) Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 Mục lục MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Vi rút Bại liệt 1.1.1.Về hình thái học 1.1.2.Về thành phần hóa học vi rút Bại liệt 1.1.3.Về tính chất hóa lý 1.1.4.Về cấu tạo kháng nguyên 1.1.5.Về tính sinh miễn dịch 1.2 Dịch tễ học bệnh bại liệt 1.2.1.Tình hình bệnh bại liệt Việt Nam 1.2.2.Tình hình bệnh bại liệt giới 1.3 Vắc xin Bại liệt 1.3.1.Vắc xin Bại liệt sống giảm độc lực (OPV) 1.3.2.Vắc xin Bại liệt bất hoạt (IPV) 1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng vắc xin IPV 1.4.1.Trên giới 1.4.2.Ở Nhâ ̣t Bản 10 1.4.3.Ở Việt Nam 10 1.5 Các phương pháp tinh chế virus 11 1.6 Tiêu chuẩn vắc xin IPV 13 1.6.1.Sản xuấ t 13 1.6.2.Kiể m đinh ̣ vắ c xin thành phẩ m 13 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1.Phương pháp nuôi thu Poliovirus 16 2.2.2 Phương pháp tinh chế Poliovirus 20 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 2.2.3 Phương pháp đánh giá hiê ̣u quả sản xuấ t bán thành phẩ n vắ c xin IPV 26 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 38 3.1 Kế t quả nuôi thu Poliovirus 38 3.2 Kết tinh chế Poliovirus 40 3.2.1 Kết tinh chế Poliovirus bằ ng siêu lo ̣c 40 3.2.2 Kết tinh chế Poliovirus bằ ng siêu ly tâm 42 3.2.3 Kết tinh chế Poliovirus bằ ng sắ c ký 43 3.2.4 Kết bất hoạt Poliovirus 45 3.3 Kế t quả đánh giá hiê ̣u quả sản xuấ t bán thành phẩ m vắ c xin IPV 47 3.3.1 Kiể m tra vô trùng các giai đoa ̣n 47 3.3.2 Kết thử nghiệm nhận dạng 49 3.3.3 Kiể m tra hàm lượng protein 49 3.3.4 Kiể m tra nồ ng đô ̣ formandehyd tồ n dư 50 3.3.5 Kết tinh chế Poliovirus thông qua đánh giá hiệu suất, hiệu thu qua môi công đoạn 51 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất IPV bán thành phẩm 53 KẾT LUẬN 54 KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 Danh mục bảng, biểu đồ Bảng 2.1: Kiểm tra vô trùng mẫu vắc xin sau ly tâm 26 Bảng 2.2: Pha mẫu chuẩ n BSA các nồ ng đô 32 ̣ Bảng 2.3: Pha mẫu chuẩ n với thuố c thử Bradford 1X 32 Bảng 2.4: Pha dung dich ̣ formandehyd chuẩ n 33 Bảng 2.5: Thực hiê ̣n phản ứng dung dich ̣ formandehyd chuẩ n, mẫu thử, mẫu trắ ng với acetylaceton 34 Bảng 3.1: Kế t quả nuôi thu Poliovirus 39 Biểu đồ 1: Thu nhận Poliovirus typ 1, 2, từ dịch nuôi 40 Bảng 3.2 Kế t quả tinh chế Poliovirus bằ ng siêu lo ̣c 41 Bảng 3.3 Kế t quả tinh chế Poliovirus bằ ng phương pháp siêu ly tâm 42 Bảng 3.4: Kết tinh chế Poliovirus sắc ký 45 Bảng 3.5: Kết kiểm tra virus sống tồn dư 46 Bảng 3.6: Kết bất hoạt poliovirus 47 Bảng 3.7: Kết thử vô trùng giai đoạn 48 Bảng 3.8: Kết định typ Poliovirus thử nghiệm nhận dạng 49 Bảng 3.9 Kết kiểm tra hàm lượng protein 49 Bảng 3.10: Kết kiểm tra nồng độ formandehyd tồ n dư 50 Bảng 3.11: Kết thu hồi Poliovirus qua công đoạn 52 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 Danh mục hình Hình 1.1: Hình thái học Poliovirus[26 ] Hình 1.2: Đă ̣c điể m của màng siêu lo ̣c[37] 11 Hình 1.3: Phân loa ̣i màng siêu lo ̣c dựa vào kić h thước chấ t tan [37] 12 Hình 2.1: Tuyp tế bào Vero từ ngân hàng tế bào Polyvac 17 Hình 2.2: Thực siêu lo ̣c mẫu Poliovirus 21 Hình 2.3: Thực siêu ly tâm mẫu Poliovirus 22 Hình 2.4: Đồ thi ̣test cô ̣t 24 Hình 2.5: Đồ thi ̣đường “cond” ≈ ms/cm 25 Hình 3.1: Tế bào bám kín lớp 38 Hình 3.2: Tế bào bi ̣hủy hoa ̣i Poliovirus 39 Hình 3.3: Kết nhồi cột gel 43 Hình 3.4: Sắc ký đồ tinh chế Poliovirus qua cột DEAE sepharose CL-6B 44 Hình 3.5: Tiêu chuẩn kết protein tồn phần mẫu poliovirus 50 Hình 3.6: Tiêu chuẩn kết nồng độ formandehyd tồn dư 51 Hình 3.7: Kết tinh typ Poliovirus qua công đoạn 52 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 MỞ ĐẦU Bệnh bại liệt virus bệnh truyền nhiễm cấp tính Thể điển hình bệnh có biểu liệt mềm để lại di chứng, dẫn tới tử vong Nguyên nhân gây bệnh virus bại liệt (Poliovirus) týp 1, [4] Sabin người tìm vắc xin phòng bại liệt uống (OPV, vắc xin sống uống giảm độc lực) vào năm 1957 Vắc xin sử dụng toàn giới 60 năm qua Văc xin Sabin nhà khoa học đánh giá thực tế kiểm nghiệm loại vắc xin phòng bệnh bại liệt có nhiều ưu việt Chính vắc xin Sabin giúp nhiều nước giới toán bệnh bại liệt Năm 1988 Tổ chức Y tế Thế giới dựa vào thành tựu vắc xin đem lại để đưa chương trình tốn bệnh bại liệt tồn giới vào năm 2000 Ở Việt nam từ năm 60 kỷ thứ 20, trẻ em dùng vắc xin bại liệt Đến năm 2000 Việt nam trở thành số nước giới tốn bệnh bại liệt Tuy nhiên nhiều nước giới chưa toán bệnh bại liệt nên Tổ chức Y tế Thế giới khuyến cáo việc phòng bệnh vắc xin cho trẻ em cần tiếp tục thực Vắc xin OPV có nhược điểm chủng Sabin có nguồn gốc từ chủng hoang dại làm giảm độc lực, trình phát triển tự nhiên virus Sabin bị đột biến quay trở lại dạng độc lực, gây nên bệnh bại liệt liên quan đến việc sử dụng vắc xin Vắc xin IPV (vắc xin bại liệt bất hoạt) đời từ sớm năm 1955 (Jonas Salt) chế phẩm IPV có ưu điểm cao an tồn, khơng gây tượng bệnh bại liệt liên quan đến sử dụng vắc xin Trước tình hình tổ chức y tế giới khuyến cáo nước sử dụng OPV nên bước chuyển sang sử dụng vắc xin IPV tiến tới sử dụng hoàn toàn vắc xin Yêu cầu vắc xin IPV cần độ tinh khiết cao, không chứa tạp chất, protein lạ… Poliovirus tinh khiết thu cần có hiệu giá cao, sau bất hoạt formandehyd, lượng formandehyd tồn dư không 0.02% thể tích bán thành Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Ích Tùng – CB150061 phẩm thu Để đảm bảo tính an tồn vắc xin thành phẩm, đạt yêu cầu theo quy định Dược điển Việt Nam IV theo tiêu chuẩn WHO tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình tinh chế poliovirus phục vụ phát triển vắc xin bại liệt bất hoạt” Mục tiêu đề tài: - Xây dựng quy trình tinh chế virus bại liệt sản xuất tế bào vero Nội dung nghiên cứu bao gồm: - Nuôi thu Poliovirus - Nghiên cứu xây dựng quy trình tinh chế Poliovirus - Nghiên cứu bất hoạt Poliovirus đánh giá hiệu sản xuất bán thành phẩm vắc xin IPV Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Dựa vào sắc ký đồ (hình 3.4) ta thu ống nằm đỉnh sắc ký đồ từ ống số 3, 4, Lấy mẫu ống kiểm tra hiệu giá, đánh giá kết tinh chế poliovirus sắc ký Bảng 3.4: Kết tinh chế Poliovirus sắc ký STT Kháng Thể tích nguyê n trước tinh chế (ml) Thể tích sau tinh chế (ml) Hiệu giá trước tinh chế log CCID50/0,1 ml Hiệu giá sau tinh chế Hiệu suất log CCID50/0,1ml % Týp 420 693 10,15 9,90 92,8 Týp 420 693 10,05 9,79 90,6 Týp 420 693 9,60 9,34 90,7 Týp 420 693 9,65 9,40 92,7 Týp 420 693 9,93 9,67 90,7 Týp 420 693 9,89 9,62 88,6 Với lần tinh chế thực sử dụng 20ml mẫu Poliovirus, theo kết hình 3.8 thu đỉnh đồ thị ống ống thu phân đoạn 11ml, sau tinh chế từ 20ml ban đầu thu 33ml Như từ 420 ml ban đầu thu 693ml mẫu Poliovirus sau sắc ký Hiệu suất thu hồi sau tinh chế sắc ký trao đổi ion đạt 90-92% (bảng 3.4) cao so với nghiên cứu Levintow Darnell (1960) (40%) [27] 3.2.4 Kết bất hoạt Poliovirus Trước bất hoạt poliovirus lọc qua màng 0.22m để đảm bảo tính vơ trùng, lấy mẫu kiểm tra hiệu giá Chúng sử dụng formandehyd để thực bất hoạt với tỷ lệ 0,025% thời gian bất hoạt 12 ngày, nhiệt độ 37oC Ngày thứ 12 kết thúc bất hoạt hỗn dich virus trung hòa dung dịch sodium sulfite nồng độ 8,8% với tỷ lệ 0,005ml/ml [13] Hỗn dịch lọc qua 45 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 màng lọc vô trùng 0.22m để loại bỏ bỏ chất huyền phù, chất kết tủa hình thành trình bất hoạt Lấy mẫu để kiểm tra hiệu giá để đánh giá hiệu bất hoạt poliovirus dựa hiệu giá độ sống virus tồn dư Trong trình bất hoạt Poliovirus lấy mẫu kiểm tra độ sống tồn dư Poliovirus vào ngày thứ ngày thứ 12 sau kết thúc bất hoạt Kết kiểm tra độ sống virus tồn dư thể bảng sau Bảng 3.5: Kết kiểm tra virus sống tồn dư Hiệu giá virus sống log CCID50/0,1ml STT Kháng Ngày bất hoạt nguyên 12 Týp 9,90 0 Týp 9,79 0 Týp 9,34 0 Týp 9,40 0 Týp 9,67 0 Týp 9,62 0 Kết thử nghiệm (bảng 3.5) cho thấy kháng nguyên typ bị bất hoạt hoàn toàn sau 06 ngày bất hoạt formandehyd với tỷ lệ 0,025% Quy trình bất hoạt áp dụng viện Polio Nhật Bản [33]: sử dụng formandehyd tỷ lệ 0,025% 37oC bất hoạt virus vắc xin Sabin 12 ngày an toàn hiệu Chúng áp dụng phương pháp bất hoạt viện Polio Nhật Bản cho nghiên cứu 46 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Bảng 3.6: Kết bất hoạt poliovirus STT Thể tích Kháng trước bất nguyên hoạt (ml) Thể tích sau bất  Hiệu giá  Hiệu giá trước bất sau bất hoạt hoạt (ml) hoạt DU/ml DU/ml Hiệu suất % Týp 693 693 6025 ± 21 3359 ± 17 55,7 Týp 693 693 4677 ± 19 2351 ± 15 50,3 Týp 693 693 2754 ± 18 1529 ± 21 55,5 Týp 693 693 3162 ± 23 1722 ± 20 54,5 Týp 693 693 9332 ± 25 4954 ± 21 53,1 Týp 693 693 8317 ± 15 4359 ± 23 52,4 Dựa vào kết (bảng 3.6) ta thấy tổng hiệu giá thu cao typ III 4954 DU/ml 4359 DU/ml thấp typ 1722 DU/ml 1529 DU/ml Tổng hiệu giá trung bình typ 2855 DU/ml typ II 1625 DU/ml typ 4656 DU/ml Hiệu suất thu hồi đạt từ 50 – 55% tương đương với nghiên cứu Doi Y, Abe S, (2001) [40] 3.3 Kết quả đánh giá hiêụ quả sản xuấ t bán thành phẩ m vắ c xin IPV 3.3.1 Kiểm tra vô trùng các giai đoa ̣n Nhằ m phát hiê ̣n và loa ̣i bỏ các loa ̣t tế bào, các loa ̣t bán thành phẩ m thô, các loa ̣t bán thành phẩ m bi ̣ nhiễm loại vi khuẩ n và nấ m có sản sinh nội độc tố khơng loại bỏ q trình tinh chế Chúng thực thử nghiệm vô trùng giai đoạn với môi trường thử nghiệm Soybean Casein Digest (SCD) để phát nấm Thioglycolat để phát vi khuẩn công đoạn nuôi tế bào, thu Poliovirus vắc xin bán thành phẩm 47 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Bảng 3.7: Kết thử vô trùng giai đoạn Mẫu thử Nước nổ i tế bào Loại môi Số lượng Nhiệt độ Thời gian trường mẫu nuôi cấy theo dõi Kết 37oC Âm tính SCD 20-25oC Âm tính Thioglycolat 37oC Âm tính SCD 20-25oC Âm tính Thioglycolat 37oC Âm tính SCD 20-25oC Âm tính Thioglycolat 37oC Thioglycolat 1ml/ ống K BTP thô 1ml/ ống K 14 ngày Âm tính SCD 20-25oC Âm tính Thioglycolat 37oC Âm tính SCD 20-25oC Âm tính Thioglycolat 37oC Âm tính 20-25oC Âm tính BTP 1ml/ ống K SCD ❖ K: mẫu kiểm chứng âm Sau thử nghiệm hàng ngày theo dõi ống thử, kết thúc vào ngày thứ 14 sau thử nghiệm So sánh màu môi trường ống thử nghiệm ống K mơi trường đồng nhất, suốt, khơng có tượng nhiễm nấm nhiễm trùng Các ống coi âm tính chứng tỏ quy trình thực ổn định, kiểm soát tốt tác nhân, sản phẩm đạt yêu cầu (bảng 3.7) 48 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 3.3.2 Kết thử nghiệm nhận dạng Xác định typ Poliovirus kháng huyết đặc hiệu typ loạt thử nghiệm nhằm xác định, sử dụng typ Poliovirus vào nghiên cứu Bảng 3.8: Kết định typ Poliovirus thử nghiệm nhận dạng STT Kháng nguyên Kết 02 loạt týp 02 loạt týp 02 loạt týp 02 loạt týp 02 loạt týp 02 loạt týp 06 loạt Poliovirus sản xuất thử nghiệm nhận dạng phương pháp trung hòa vi lượng, sử dụng kháng thể đặc hiệu typ để trung hòa với mẫu kháng nguyên Kết từ (bảng 3.8) ta thấy với 02 loạt Poliovirus typ 1, 02 loạt Poliovirus typ 2, 02 loạt Poliovirus typ 3, sau định typ cho ta kết với typ dùng cho nghiên cứu 3.3.3 Kiểm tra hàm lượng protein Bảng 3.9 Kết kiểm tra hàm lượng protein Kết STT Kháng nguyên (µg/DU) Týp 0,034 Týp 0,017 Týp 0,008 Týp 0,021 Týp 0,040 Týp 0,031 49 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Theo Dược điểm IV tiêu chuẩn hàm lượng protein tồn dư vắc xin nhỏ 0,1 µg/DU Dựa vào kết (bảng 3.9) thu ta thấy hàm lượng protein mẫu thử nghiệm nhỏ tiêu chuẩn, kết cao 0,040 µg/DU typ kết thấp 0,008 µg/DU typ Hình 3.5 : Tiêu chuẩn kết protein toàn phần mẫu poliovirus Dựa vào kết đo hàm lượng protein (hình 3.5) mẫu thấp nhiều so với tiêu chuẩn Quy trình tinh chế poliovirus đạt yêu cầu lượng protein tồn phần mẫu vắc xin 3.3.4 Kiểm tra nờ ng độ formandehyd tồ n dư Bảng 3.10: Kết kiểm tra nồng độ formandehyd tồ n dư Kết STT Kháng nguyên (% g/l) Týp 0,013 Týp 0,011 Týp 0,012 50 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Týp 0,010 Týp 0,008 Týp 0,009 Theo Dược điểm IV tiêu chuẩn nồng độ formandehyd tồn dư không vượt 0,02% (hay ≤ 0,02 g/l)[3; 38] Dựa vào bảng kết ( bảng 3.10) ta thấy nồng độ formandehyd tồn dư mẫu thử nghiệm nhỏ tiêu chuẩn, kết thử nghiệm cao 0,013% typ kết thấp 0,008 % typ Hình 3.6 : Tiêu chuẩn kết nồng độ formandehyd tồn dư Dựa kết đo nồng độ formandehyd tồn dư (hình 3.6) mẫu thấp nhiều so với tiêu chuẩn Quy trình tinh chế poliovirus đạt yêu cầu lượng protein toàn phần mẫu vắc xin 3.3.5 Kết tinh chế Poliovirus thông qua đánh giá hiệu suất, hiệu thu qua môi công đoạn 51 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 Bảng 3.11: Kết thu hồi Poliovirus qua công đoạn Hiệu suất thu hồi (%) STT Kháng nguyên Sau siêu Sau siêu ly lọc tâm Sau sắc ký Sau bất hoạt Týp 92,25 63,1 92,7 56,0 Týp 94,39 61,6 90,7 50,5 Týp 94,56 58,9 90,6 55,8 Týp 93,80 60,2 92,7 54,7 Týp 92,89 58,8 90,7 53,4 Týp 93,33 57,5 88,6 52,7 Kết thu hồi Poliovirus (bảng 3.11) qua công đoạn siêu lọc thu tương đương typ, 92% Sau siêu ly tâm lượng Poliovirus thu typ cao với 63,1% 61,6% trung bình 62,4% thấp typ 57,5% Sau tinh chế hiệu suất thu hồi typ tương đương trung bình đạt 90% Hiệu suất thu hồi công đoạn sau bất hoạt đạt 50% Hiệu suất thu hồi vắc xin IPV bán thành phẩm có kết thấp không đáng kể với nghiên cứu Doi Y, Abe S, (2001) [40] Hình 3.7: Kết tinh typ Poliovirus qua công đoạn Theo kết điện di (hình 3.7 ) với mẫu M: mẫu chuẩn, mẫu SSL: sau siêu ly tâm, mẫu STC: sau tinh chế Ở typ Poliovirus mẫu sau siêu lọc nhiều 52 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Í ch Tùng – CB150061 “band” phụ, mẫu sau sau siêu ly tâm cho kết nhiều “ band” phụ, mẫu sau tinh chế qua cột trao đổi ion “ band” tương ứng 35,5 KDa; 30,0 KDa; 26,4 KDa; “band” đặc hiệu Poliovirus [13] Như sau tinh chế Poliovirus đạt yêu cầu độ 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất IPV bán thành phẩm Dựa vào nghiên cứu thu kết tương đương với kết nghiên cứu công bố giới đề xuất quy trình sản xuất vắc xin IPV bán thành phẩm áp dụng nước sau Tế bào vero - - Tế bào vero từ ngân hàng tế bào Polyvac, ly tâm thu cặn chia chai nuôi cấy Được cấy truyền tới đời P142, 37oC Gây nhiễm - - Chủng Poliovirus ( typ 1, 2, 3) lên tế bào P142 kín lớp, sau 72 nuôi cấy tế bào hủy hoại 90% tiến hành hộn thu Poliovirus, lọc hỗn dịch qua màng 0,22m Tinh chế Poliovirus qua công đoạn: - Siêu lọc: sử dụng màng loại 100Kda, có kích thức lỗ màng 0,01m, tốc độ dòng 400-500 ml/phút, áp suất