BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y ******************* LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP., VIBRIO CHOLERAE VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRÊN TÔM VÀ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ TẠI TPHCM Sinh viên thực hiện: NGUYỄN BÌNH THIÊN TIÊN Lớp: DH05DY Ngành: Dược Thú Y Niên khóa: 2005 – 2010 Tháng 08/2010 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI THÚ Y ******************* NGUYỄN BÌNH THIÊN TIÊN PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP., VIBRIO CHOLERAE VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRÊN TÔM VÀ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ TẠI TPHCM Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sỹ thú y Giáo viên hướng dẫn PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN BSTY LÊ HỮU NGỌC Tháng 8/2010 i Xác nhận giáo viên hướng dẫn Họ tên sinh viên thực tập: Nguyễn Bình Thiên Tiên Tên luận văn: “PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ESCHERICHIA COLI, SALMONELLA SPP., VIBRIO CHOLERAE VÀ VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRÊN TÔM VÀ NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH” Đã hồn thành luận văn theo yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày Giáo viên hướng dẫn PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân ii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn nuôi – Thú y củng tất thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian học trường Con xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Ngọc Tuân – người tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt cho thực hoàn thành đề tài tốt nghiệp Xin gửi lời cám ơn đến thầy Lê Hữu Ngọc bạn phòng Thực hành Kiểm nghiệm thú sản Môi trường sức khỏe vật nuôi phòng Vi sinh – Truyền nhiễm giúp đỡ tơi hoàn thành tốt đẹp đợt thực tập Cám ơn kỉ niệm có bạn lớp Dược Y 31 suốt năm năm qua Cám ơn, cám ơn nhóm năm người chúng ta, người chia buồn vui học tập sống với thời gian qua Và xin chân thành cám ơn Bố Mẹ, sinh thành, nuôi dưỡng dạy dỗ suốt hai mươi ba năm qua Khơng có Bố Mẹ khơng có ngày hơm Con khắc ghi hình bóng Mẹ lòng con, dù trước khơng nói ra, u Mẹ nhiều iii TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Phân lập xác định Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus tôm nhuyễn thể hai mảnh vỏ Thành phố Hồ Chí Minh” tiến hành phòng thực hành Kiểm nghiệm thú sản Môi trường sức khỏe vật nuôi, khoa Chăn nuôi - Thú y, trường đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh Thời gian thực từ ngày 29/01/2010 đến ngày 31/07/2010 Qua 60 mẫu thu thập từ số chợ thuộc địa bàn thành phố Hồ Chí Minh, tiến hành phân lập, xác định vi khuẩn cần nghiên cứu thực kháng sinh đồ với loại kháng sinh: amoxicillin / clavulanic acid, tetracycline, chloramphenicol, ciprofloxacin norfloxacin Kết thu sau: • Tỉ lệ nhiễm S aureus tôm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 31,67 % Trong 19 mẫu khơng đạt có 15 mẫu tơm chiếm tỉ lệ 78,94 % cao gần lần so với mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ • Tỉ lệ nhiễm E coli, Salmomella spp., V cholerae V parahaemolyticus tôm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 86,67 %, 58,33 %, 51,67 % 13,33 % Tỉ lệ nhiễm E coli tôm cao nhuyễn thể hai mảnh vỏ (29 mẫu tôm so với 52 mẫu bị nhiễm, chiếm tỉ lệ 55,77 %) Còn tỉ lệ nhiễm Salmomella spp tơm nhuyễn thể hai mảnh vỏ tương đương (18 mẫu tôm 17 mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ bị vấy nhiễm Salmomella, chiếm tỉ lệ 51,43 % 48,57 %) Trong đó, tỉ lệ nhiễm V cholerae tôm cao gần gấp đôi so với nhuyễn thể hai mảnh vỏ (trong 31 mẫu bị nhiễm V cholerae, có 19 mẫu tơm chiếm tỉ lệ 61,29 %) nhiễm V parahaemolyticus tôm cao gấp lần so với nhuyễn thể hai mảnh vỏ (có mẫu tôm mẫu bị nhiễm, chiếm tỉ lệ 75 %) iv • Tỉ lệ mẫn cảm S aureus V cholerae với loại kháng sinh amoxicillin / clavulanic acid, tetracycline, chloramphenicol, ciprofloxacin norfloxacin cao (100 % nhạy với loại kháng sinh này) Tỉ lệ mẫn cảm Salmomella spp cao (chỉ có 33,33 % đề kháng với tetracycline) E coli tương đối cao (33,33 % đề kháng với tetracycline 100 % mẫn cảm trung gian với amoxicillin) Ngược lại, tỉ lệ mẫn cảm V parahaemolyticus thấp, có tetracycline, ciprofloxacin norfloxacin cho hiệu tốt (100 % nhạy) Còn amoxicillin chloramphenicol có tượng đề kháng (tỉ lệ đề kháng 66,67 % 33,33 %) v MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Xác nhận giáo viên hướng dẫn .ii Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục vi Danh sách chữ viết tắt ix Danh sách hình sơ đồ xi Danh sách bảng xii Danh sách biểu đồ xiii Chương MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 2.1 Ngộ độc thực phẩm 2.1.1 Ngộ độc thực phẩm tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 2.1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn 2.1.1.2 Cơ chế gây bệnh 2.1.1.3 Triệu chứng bệnh 2.1.1.4 Phòng ngừa 2.1.2 Ngộ độc thực phẩm Escherichia coli 2.1.2.1 Đặc điểm vi khuẩn 2.1.2.2 Triệu chứng chung bệnh 10 2.1.3 Ngộ độc thực phẩm Salmonella 11 2.1.3.1 Đặc điểm vi khuẩn 11 2.1.3.2 Cơ chế gây bệnh 12 2.1.3.3 Triệu chứng bệnh 14 2.1.3.4 Phòng ngừa 14 vi 2.1.4 Ngộ độc thực phẩm Vibrio cholerae 15 2.1.4.1 Đặc điểm vi khuẩn 15 2.1.4.2 Cơ chế gây bệnh 17 2.1.4.3 Triệu chứng bệnh 18 2.1.4.4 Phòng ngừa 18 2.1.5 Ngộ độc thực phẩm Vibrio parahaemolyticus 19 2.1.5.1 Đặc điểm vi khuẩn 19 2.1.5.2 Triệu chứng bệnh 19 2.1.5.3 Phòng ngừa 19 2.2 Kháng sinh đồ 20 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 3.1 Thời gian địa điểm thực 21 3.2 Nội dung nghiên cứu 21 3.3 Phương pháp tiến hành 22 3.3.1 Nguyên vật liệu 22 3.3.2 Phương pháp lấy mẫu 23 3.3.3 Phương pháp nuôi cấy, phân lập xác định vi khuẩn 23 3.3.3.1 Xử lý mẫu trước nuôi cấy 23 3.3.3.2 Quy trình ni cấy, phân lập xác định vi khuẩn 24 3.3.3.3 Định lượng Staphylococcus aureus phương pháp đếm khuẩn lạc 24 3.3.3.4 Định tính Escherichia coli 26 3.3.3.5 Định tính Salmomella 27 3.3.3.6 Định tính Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus 28 3.3.4 Phương pháp kháng sinh đồ 30 vii Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Tình hình nhiễm S aureus, E coli, Salmonella spp., V cholerae V parahaemolyticus mẫu tôm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 32 4.1.1 Tình hình nhiễm Staphylococcus aureus 32 4.1.2 Tình hình nhiễm Escherichia coli, Salmomella spp., Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus 34 4.2 Tỉ lệ mẫn cảm S aureus, E coli, Salmonella spp., V cholerae, V parahaemolyticus với số loại kháng sinh thông dụng 37 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 44 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT aw water activity ADP-ribose adenosine diphosphate ribose ATP adenosine triphosphate BGA Brilliant Green Agar BHI Brain Heart Infusion BP Baird-Parker cAMP cyclic adenosine monophosphate E coli Escherichia coli EAEC Enteroaggregative Escherichia coli EC Escherichia coli broth EHEC Enterohaemorrhagic Escherichia coli EIEC Enteroinvasive Escherichia coli EMB Eosin Methylene Blue EPEC Enteropathogenic Escherichia coli ETEC Enterotoxigenic Escherichia coli GM1 ganglioside monosialosyl ganglioside HC hemorrhagic colitis HUS hemolytic uremic syndrome IMViC indol, MR, VP, citrate LDC Lysine Decarboxylase LT heat labile MHA Mueller Hinton Agar MR methyl red NA Nutrient Agar NAD Nicotinamide adenine dinucleotide ONPG o-nitrophenyl-D-galactopyranoside OPM specific outer membrane protein ix TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Văn Thiên Bảo, 2004 Điều tra tình hình nhiễm Salmomella phân thịt bò, heo, gà thành phố Hồ Chí Minh số tỉnh phía Nam Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Bộ Y Tế, 2007 Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT v/v ban hành quy định giới hạn cho phép vi sinh vật thủy sản Tơ Minh Châu, Trần Thị Bích Liên, 2001 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh Chi cục thú y thành phố Hồ Chí Minh, 1996 Tài liệu tập huấn kiểm dịch sản phẩm động vật Trần Đăng, 2008 Ngộ độc thực phẩm NXB Hà Nội Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Kim Loan, 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật NXB Nơng Nghiệp, TP Hồ Chí Minh Lê Đình Hùng, 1997 Đại cương phương pháp kiểm tra vệ sinh thực phẩm Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng Khoa Y, môn Vi sinh trường đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh,1996 Vi khuẩn học Tủ sách trường đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Dương Thanh Liêm, 2009 Độc chất học Tủ sách trường đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh 10 Dương Thị Ngọc, 2005 Phân lập hệ vi khuẩn cộng sinh cá tra (Pangasius hypophthalmus) thử nghiệm kháng sinh đồ Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Phúc Thiện, 2006 Khảo sát tình hình nhiễm Salmomella thịt heo tươi có nguồn gốc từ số sở giết mổ chợ thuộc địa bàn TP HCM Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 12 Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2005 Phân lập định danh vi khuẩn diện tơm bệnh mòn Khóa luận tốt nghiệp trường Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh 41 13 Trần Linh Thước, 2003 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Phùng Tiến, Bùi Minh Đức, Nguyễn Văn Dịp, 2002 Vi sinh vật thực phẩm kỹ thuật kiểm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm NXB Y Học, Hà Nội 15 Nguyễn Ngọc Tuân, 2002 Vệ sinh thịt NXB Nơng Nghiệp, TP Hồ Chí Minh 16 Phạm Thế Vũ, 2009 Nghiên cứu ứng dụng số kỹ thuật chẩn đoán nhanhVibrio cholerae gây dịch tiêu chảy cấp tỉnh Thái Nguyên năm 2008 Luận văn Thạc sĩ Sinh học trường Đại học Thái Nguyên TIẾNG NƯỚC NGOÀI 17 Bergey, 1998 Bergey’s manual of determination bacteriology Ninth edition page 175 – 210 and page 532 – 534 18 Brands D A., Inman A E., Gerba C P., Maré C J., Billington S J., Saif L A., Levine J F.,and Joens L A., 2005 Prevalence of Salmonella spp in Oysters in the United States Applied and Environmental Microbiology, 71(2): 893-897 19 DePaola A., Nordstrom J L., Bowers J C., Wells J G and Cook D W., 2002 Seasonal Abundance of Total and Pathogenic Vibrio parahaemolyticus in Alabama Oysters Applied and Environmental Microbiology, 69(3): 1521-1526 20 Food and Agriculture organization of the United Nations Rome, 1992 Microbiological analysis Food and Drug administration, Washington D.C, USA, page 13 -131 21 Gould I M., 2000 Towards a common susceptibility testing method? Journal of Antimicrobial Chemotherapy 45: 757-762 22 Hood M A., Ness G E and Blake N J , 1983 Relationship Among Fecal Coliforms, Escherichia coli, and Salmonella spp in Shellfish Applied and Environmental Microbiology, 45(1): 122-126 23 Johnston L M., Elhanafi D., Drake M and Jaykus L A., 2005 A Simple Method for the Direct Detection of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from Raw Alfalfa Sprouts and Spent Irrigation Water Using PCR Journal of Food Protection, 68(11): 2256–2263 42 24 Khaira G., 2006 Descriptive epidemiology of Vibrio parahaemolyticus and other Vibrio species infections in British Columbia: 2001-2006 University of British Columbia, British Columbia 25 Kim J S., Lee G G., Park J S., Jung Y H., Kwak H S., Kim S B., Nam Y S and Kwon S T., 2007 A Novel Multiplex PCR Assay for Rapid and Simultaneous Detection of Five Pathogenic Bacteria: Escherichia coli O157:H7, Salmonella, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, and Vibrio parahaemolyticus Journal of Food Protection, 70(7) 1656–1662 26 Huq A., Grim C., Cowell R R and Nair G B., 2006 Detection, isolation, and identification of Vibrio cholerae from the environment University of Maryland, Baltimore, Maryland 27 Van Thi Thu Hao, 2007 Detection of Enteric Bacteria in Raw Food Samples from Vietnam and Evaluation of Antibiotic Resistance A thesis submitted for the degree of Doctor of Philosophy Biotechnology and Environmental Biology School of Applied Sciences RMIT University INTERNET 28 http://commons.wikimedia.org 29 http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/ 30 http://www.foodylife.com 31 http://www.sggp.org.vn/ytesuckhoe/2010/6/227765 32 http://www.salmonellablog.com 33 http://www.ykhoanet.com/binhluan/nguyenvantuan/dichta_nvt_071106.htm 34.http://vietbao.vn/Suc-khoe/Nhan-dien-va-phong-dich-tieu-chaycap/40227404/248/ 43 PHỤ LỤC Phụ lục Số lượng S aureus tôm nhuyễn thể hai mảnh vỏ 44 45 Ghi chú: • NC (non-count): khơng đếm • t: khuẩn lạc điển hình • k: khuẩn lạc khơng điển hình • N: tổng số khuẩn lạc -Nt: tổng số khuẩn lạc điển hình -Nk: tổng số khuẩn lạc khơng điển hình • H: tỉ lệ -Ht: số khuẩn lạc điển hình cho coagulase dương / tổng số khuẩn lạc điển hình -Hk: số khuẩn lạc khơng điển hình cho coagulase dương / tổng số khuẩn lạc khơng điển hình Phụ lục Các phản ứng sinh hóa quan trọng 2.1 Thử nghiệm khả lên men Thử nghiệm nhằm xác định khả sử dụng nguồn carbon định vi khuẩn để tăng trưởng Vi khuẩn khác sử dụng nguồn carbon khác Các nguồn carbon chia thành nhóm đường đơn (monosaccharide), đường đa (oligo- hay polysaccharide) rượu (alcohol) Khi sử dụng nguồn carbon để lên men, tùy phương pháp lên men, sản phẩm tạo khác bao gồm rượu, acid hữu cơ, CO2,… Trong tất 46 trường hợp, sản phẩm tạo thành làm giảm pH môi trường Do vậy, khả lên men đánh giá thông qua làm giảm pH môi trường dẫn đến thay đổi màu chất thị pH mơi trường Hình 2.1 Thử nghiệm khả lên men (dùng chất thị phenol red) A Âm tính, vi khuẩn sử dụng pepton tạo NH3 làm kiềm hóa mơi trường làm tồn mơi trường chuyển thành màu đỏ B Dương tính, sản phẩm q trình lên men làm acid hóa mơi trường làm tồn mơi trường chuyển thành màu vàng C Mơi trường trước cấy vi khuẩn Ngồi ra, CO2 tạo thành bẫy lại thành bọt khí ống Durham (trường hợp sử dụng mơi trường lỏng) hay làm vỡ thạch cấy ống thạch sâu (trường hợp sử dụng môi trường rắn) Môi trường lỏng thường dùng đa số trường hợp thử nghiệm khả lên men 2.2 Thử nghiệm khả biến dưỡng citrate Một số vi khuẩn có khả sử dụng citrate làm nguồn carbon để thu lấy lượng Sự biến dưỡng citrate thường thông qua kết hợp với acetylCoA thành oxaloacetate để vào chu trình tricarboxylic acid (chu trình Krebs) Trong mơi trường có chứa hợp chất sodium citrate (Na3C6H5O7), số vi khuẩn có khả sử dụng citrate làm thừa gốc Na+ khiến cho môi trường trở nên kiềm (pH tăng) làm cho màu chất thị xanh bromothymol có mơi trường chuyển từ xanh sang màu xanh dương 47 Hình 2.2 Thử nghiệm khả biến dưỡng citrate A Âm tính, mơi trường giữ ngun màu ban đầu (màu xanh cây) B Dương tính, sản phẩm trao đổi chất tạo làm kiềm hóa môi trường nuôi cấy, chất thị môi trường chuyển sang màu xanh dương 2.3 Thử nghiệm coagulase Một số vi khuẩn, đặc biệt loài thuộc Staphylococcus, có khả sản sinh enzyme coagulase có tác dụng làm ngưng kết thành phần huyết tương, tạo thành khối đơng làm đơng huyết tương Coagulase có chất protein nên nhanh chóng bị bất hoạt thủy phân protease Tuy nhiên, enzyme bền với nhiệt, chịu nhiệt độ 600C 30 phút mà khơng làm giảm hoạt tính Hình 2.3 Thử nghiệm coagulase A Âm tính, huyết tương trạng thái lỏng B Dương tính, huyết tương ngưng kết thành khối trạng thái rắn hồn tồn C Dương tính, huyết tương ngưng kết phần 2.4 Thử nghiệm decarboxylase Các loài vi khuẩn đường ruột khác sản sinh enzyme carboxylase khác có vai trò xúc tác phản ứng loại bỏ nhóm carboxyl số acid amin tạo amine hay diamine CO2 điều kiện kị khí Các enzyme 48 tổng hợp mơi trường có tính acid chứa chất cảm ứng đặc hiệu Họ decarboxylase gồm nhiều thành viên, loại tác động lên chất định Hình 2.4 Thử nghiệm decarboxylase A Dương tính, sản phẩm tạo làm môi trường trở nên đục có màu tím B Âm tính, mơi trường có màu vàng C Mơi trường trước cấy vi khuẩn Có loại decarboxylase quan trọng kiểm nghiệm vi khuẩn lysine decarboxylase (LDC), ornithine decarboxylase (ODC) arginine decarboxylase (ADC) có chất lysine, ornithine arginine Phản ứng xúc tác LDC loại bỏ CO2 khỏi lysine, phóng thích CO2 dẫn đến tạo thành cadaverine Trường hợp ODC ADC, sản phẩm tạo CO2 putrescine Trong tất trường hợp, CO2 sinh làm giảm pH môi trường ghi nhận qua đổi màu chất thị pH 2.5 Thử nghiệm khả sinh indol Nhiều vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả phân giải tryptophan môi trường thành indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa p-dimethylaminobenzaldehyde (p-DMABA) Nhân pyrol indol chứa nhóm CH2 kết hợp với nhân benzene p-DMABA tạo nên phức chất dạng quinine có màu đỏ 49 Hình 2.5 Thử nghiệm khả sinh indol A Dương tính, có xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường B Âm tính, lớp màu vàng thuốc thử bề mặt môi trường 2.6 Thử nghiệm MR (Methyl Red) Nhiều vi khuẩn, vi khuẩn đường ruột, có khả oxy hóa đường glucose tạo thành acid pyruvic Acid pyruvic sinh lại tiếp tục chuyển hóa thành nhiều loại acid hữu khác như: acid acetic, acid lactic, acid succinic, làm pH môi trường bị giảm xuống 4,5 Ở độ pH này, chất thị màu methyl red nhỏ vào giữ màu đỏ Như vậy, dựa vào màu chất thị methyl red, người ta xác định phản ứng dương tính (màu đỏ) hay âm tính (màu vàng) Hình 2.6 Thử nghiệm MR A Âm tính, mơi trường có màu vàng sau bổ sung thuốc thử B Dương tính, mơi trường có màu đỏ 2.7 Thử nghiệm ONPG Các vi khuẩn lên men lactose có tổng hợp tế bào hai enzyme β-galactosidase có vai trò xúc tác thủy phân lactose permease có vai trò vận chuyển lactose vào bên tế bào Một số vi khuẩn gen mã hóa enzyme 50 β-galactosidase nên khơng thể lên men lactose Hoạt tính enzyme xác định dựa vào chất o-nitrophenyl-D-galactopyranoside (ONPG) Sự thủy phân chất đường β-galactosidase phóng thích o-nitrophenol có màu vàng Hình 2.7 Thử nghiệm ONPG A Dương tính, mơi trường có màu vàng B Âm tính, mơi trường khơng đổi màu 2.8 Thử nghiệm oxidase Hình 2.8 Thử nghiệm oxidase Âm tính, khơng xuất màu xanh Dương tính, xuất màu xanh dương đậm (Nguồn: http://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/ans6.html) Thử nghiệm nhằm xác định diện hệ enzyme oxidase vi khuẩn Thành viên quan trọng hệ thống cytochrome oxidase chuỗi truyền điện tử hô hấp hiếu khí với O2 chất nhận điện tử sau nên diện loài vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi Số chủng loại cytochrome tế bào thay đổi tùy thuộc vào lồi vi khuẩn Hoạt tính cytochrome oxidase phát nhờ thuốc thử p-phenylenediamine Trong điều kiện có 51 diện cytochrome c khử tế bào, thuốc thử bị oxy hóa thành hợp chất indolphenol có màu xanh dương 2.9 Thử nghiệm KIA, TSI Mơi trường KIA (Kligler Iron Agar) môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar) sử dụng để kết hợp thử nghiệm đồng thời khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose, sucrose) khả sinh H2S chủng vi khuẩn Về nguồn carbon, môi trường KIA chứa hai loại đường % lactose 0,1 % glucose Tương tự, mơi trường TSI có thành phần giống mơi trường KIA có thêm % sucrose (saccharose) Khả sử dụng hai nguồn đường môi trường KIA glucose lactose hay sử dụng glucose để thu lấy lượng cần cho tăng trưởng tùy thuộc vào di truyền chủng vi khuẩn theo dõi ống thạch chứa môi trường KIA Khi cấy chủng vi khuẩn lên mơi trường này, có ba trường hợp xảy ra: sử dụng glucose, sử dụng glucose lactose, không sử dụng hai loại đường Khả vi khuẩn xác định thông qua đổi màu chất thị pH môi trường bề mặt bên mơi trường ống thạch nghiêng • Nếu vi khuẩn lên men glucose, sau 18 -24 nuôi cấy phần môi trường bề mặt ống thạch nghiêng trở nên có pH kiềm phần sâu ống có pH acid Điều giải thích lượng glucose phần bề mặt môi trường vi khuẩn oxy hóa hồn tồn thành H2O CO2 để thu lượng Để đáp ứng nhu cầu lượng cho tăng trưởng, vi khuẩn tiến hành dị hóa peptone mơi trường, qua giải phóng NH3 làm phần bề mặt mơi trường có pH kiềm Ngược lại, phần sâu mơi trường có điều kiện oxy không đầy đủ, glucose lên men kị khí sinh acid hữu làm giảm pH mơi trường Nếu mơi trường có chất thị phenol red mặt thạch nghiêng có màu đỏ phần sâu có màu vàng • Nếu vi khuẩn sử dụng glucose lactose, sau 18 – 24 ni cấy tồn mơi trường trở nên có pH acid biến dưỡng đồng thời glucose 52 lactose bề mặt môi trường giúp vi khuẩn đủ lượng để tăng trưởng mà không cần phải sử dụng đến peptone • Nếu vi khuẩn khơng sử dụng hai nguồn carbon này, pepton sử dụng để biến dưỡng thu lượng vật chất cần cho tăng trưởng vi khuẩn Tuy nhiên, pepton biến dưỡng điều kiện hiếu khí nên tượng kiềm hóa mơi trường diễn phần bề mặt môi trường phần trở nên có màu đỏ Trong đó, phần mơi trường sâu ống nghiệm khơng có tượng đổi màu Trong trường hợp nêu trên, lên men đường tạo sản phẩm khí khí tích tụ bên thành bọt khí làm vỡ thạch Thử nghiệm khả sinh H2S thực đồng thời hai mơi trường thành phần mơi trường có chứa sodium thiosulphate Vi khuẩn khử sulfate khử hợp chất để giải phóng H2S Khí H2S tạo phát dựa vào phản ứng tạo kết tủa màu đen FeS H2S ion Fe2+ thị ferric ammonium citrate diện môi trường Trường hợp sử dụng môi trường TSI, tượng liên quan đến sử dụng nguồn carbon xảy tương tự Hình 2.9 Thử nghiệm TSI A Mơi trường có màu vàng / vàng, sinh hơi, không sinh H2S B Mơi trường có màu đỏ / vàng, khơng sinh hơi, có sinh H2S C Mơi trường có màu đỏ / đen (do sinh nhiều H2S vi khuẩn di động được), khơng sinh D Mơi trường có màu đỏ / không đổi màu, không sinh H2S 53 2.10 Thử nghiệm urease Hình 2.10 Thử nghiệm urease A Môi trường trước cấy vi khuẩn B Âm tính, vi khuẩn khơng thủy giải urea, mơi trường giữ ngun màu ban đầu C Dương tính, urea mơi trường bị vi khuẩn thủy giải tạo sản phẩm có tính kiềm làm chất thị chuyển thành màu hồng cánh sen Một số vi khuẩn sản sinh enzyme urease xúc tác thủy phân urea Urea (NH2)CO diamide acid carbonic Urease thuộc nhóm amidase xúc tác thủy phân liên kết amide C-N phân tử urea để giải phóng hai phân tử NH3 CO2 Enzyme hoạt động tối ưu pH 7,0, thuộc nhóm enzyme cấu trúc, diện thường xuyên tế bào không phụ thuộc vào diện hay không chất urea Sự phóng thích NH3 CO2 làm tăng pH mơi trường theo dõi qua biến đổi màu chất thị pH 2.11 Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer) Hình 2.11 Thử nghiệm VP A Âm tính, mơi trường khơng đổi màu B Dương tính, mơi trường chuyển thành màu Khác với phản ứng MR, số lồi vi khuẩn có khả oxy hóa đường glucose thành acid pyruvic, lại khơng chuyển hóa acid pyruvic thành 54 acid hữu mà thành hợp chất acetyl methyl carbinol (acetoine) Acetoine môi trường kiềm cao bị oxy hóa thành diacetyl Diaceyl sinh kết hợp với nhóm guanine arginin có pepton tạo thành phức chất có màu đỏ với thuốc thử α-naphtol Đây sở việc đánh giá kết phản ứng VP đỏ 2.12 Thử nghiệm tính chịu mặn Đa số vi khuẩn không chịu nồng độ NaCl lớn %, loài thuộc họ Vibrionaceae lại chịu nồng độ NaCl này, chí chịu nồng độ cao (Vibrio alginolyticus chịu nồng độ 10 %) Do đó, vi khuẩn chịu nồng độ muối môi trường thử nghiệm tiếp tục phát triển, ngược lại chết khơng phát triển Ngồi ra, phần lớn loài thuộc giống Vibrio vi khuẩn chịu muối (halophile) nên môi trường thử nghiệm NaCl khơng phát triển Vì vậy, thường dùng để phân biệt loài thuộc giống Vibrio 55