Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chương – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Thiết bị, hóa chất, vật liệu 2.1.1 Thiết bị dụng cụ - Máy điện biến nạp (BTX ECM 399) - Máy gel doc (Biorad) - Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D) - Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf) - Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max - Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf) - Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS) - Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad) - Máy đo quang phổ - Tủ ủ 37 oC - Tủ ủ lắc - Bể điều nhiệt - Tủ đông sâu -80 oC - Tủ lạnh -20 oC - Tủ mát 4oC - Cân phân tích - Eppendorf 1.5 ml; 0.2 ml - Cuvette ml; 0,2 ml - Và dụng cụ chuyên dùng khác 2.1.2 Hóa chất 2.1.2.1 Hóa chất dùng để tách chiết plasmid - Bộ kít tách chiết plasmid Qiagen 2.1.2.2 Hóa chất dùng để tinh sản phẩm PCR Trang 15 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Thạc sĩ Sinh học Bộ kít tinh sản phẩm PCR Qiagen 2.1.2.3 Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose - Bộ kít tách chiết DNA từ gel agarose Qiagen 2.1.2.4 Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn Các enzyme cắt giới hạn cung cấp Biolab: SalI, EcoRI, BamHI, XbaI, BglII Các thành phần phản ứng cắt sử dụng theo hướng dẫn nhà sản xuất 2.1.2.5 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR cung cấp Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X Thành phần phản ứng PCR liệt kê Bảng 2.1 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR Thể tích cho phản ứng Thành phần Nồng độ cuối Taq buffer 10X 1X 2,5 l MgCl2 25 mM mM l dNTPs 25 mM 0.2 mM 0,2 l Taq polymerase U/l 0.04 U 0,2 l Mồi xuôi 10 mM 0.2 mM 0,5 l Mồi ngược 10 mM 0.2 mM 0,5 l (V = 25 µl) 19,1 l H2 O 2.1.2.6 Hóa chất dùng cho điện di DNA Agarose (BioLab), Tris base (Promega), Acid acetic (Merck), Bromophenol blue (Merck), Ethidium Bromide (Merck) Trang 16 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.1.2.7 Thang DNA Thang DNA cung cấp Fermentas bao gồm: - Thang DNA 100 bp - Thang DNA kb - Thang DNA kb plus (a) (b) (c) Hình 2.1 Thang DNA (a): Thang DNA 100 bp; (b): Thang DNA kb; (c): Thang DNA kb plus 2.1.2.8 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp phương pháp hóa biến nạp - Glycerol 10% - CaCl2 1M 2.1.2.9 Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào khả nạp phương pháp điện biến nạp - Glycerol 10% - Nước cất vô trùng Trang 17 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.1.3 Môi trường 2.1.3.1 Môi trường LB (Luria Bertami) Trypton 10 g Yeast extract 5g NaCl 10 g Nước cất đủ 1000 ml 2.1.3.2 Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) BHI (Merk) 37 g Nước cất đủ 1000 ml Mơi trường thạch có thành phần môi trường lỏng bổ sung thêm 1,5% agar Các loại kháng sinh dùng để chọn lọc gồm: colistin, ampicillin, kanamycin bổ sung vào môi trường với nồng độ cuối 50 µg/ml X gal sử dụng nồng độ cuối 40 µg/ml 2.1.4 Chủng vi sinh vật Các chủng vi sinh vật sử dụng đề tài cung cấp Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, bao gồm: - Chủng Edwardseilla ictaluri hoang dại S7 - Chủng Escherichia coli: E.coli DH5α; E coli DH5α λpir; E coli SM10 λpir 2.1.5 plasmid 2.1.5.1 Plasmid pKD4 - Kích thước 3267 bp - Mang trình tự khởi đầu chép ori6K gamma - Mang gen kháng ampicillin gen kháng kanamycin nằm hai trình tự FRT - Được sử dụng để tạo cassette STEP Trang 18 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Hình 2.2 Plasmid pKD4 2.1.5.2 Plasmid pCAMBIA 1300 - Kích thước 8958 bp - Mang gen kháng kanamycin - Được sử dụng làm mẫu để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin dùng thiết kế cassette Hình 2.3 Plasmid pCAMBIA 1300 Trang 19 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.1.5.3 Plasmid pGEM-T Easy - Kích thước 3015 bp - Có gắn thêm T vị trí nối gen chèn giúp tăng hiệu nối - Mang gen kháng ampicillin trình tự khởi đầu chép f1 ori - Mang gen lacZ mã hóa cho tiểu phần α β galactosidase giúp chọn lọc khuẩn lạc có gen chèn dựa chọn lọc màu sắc trắng/ xanh khuẩn lạc - Plasmid pGEM-T Easy sử dụng để nhân dòng Hình 2.4 Plasmid pGEM-T Easy 2.1.5.4 Plasmid pJET1.2/blunt - Kích thước 2974 bp - Mang gen kháng ampicillin giúp cho chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid - Mang gen gây độc eco47IR giúp cho chọn lọc khuẩn lạc có gen chèn - Plasmid đầu cho phép gắn chèn đoạn DNA dạng đầu - Plasmid pJET1.2/blunt sử dụng để nhân dòng Trang 20 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Hình 2.5 Plasmid pJET1.2/blunt 2.1.5.5 Plasmid pKD46 - Kích thước 6329 bp - Mang gen kháng kanamycin - Mang hai trình tự khởi đầu chép repA101ts oriR101 Sự khởi đầu chép repA101ts nhạy cảm với nhiệt độ, plasmid khơng nhân lên 37oC – 42oC - Mang gen exo, bet gam mã hóa cho hệ thống tái tổ hợp λ Red điều khiển promoter ParaB Promoter ParaB tăng cường sản xuất λ Red có arabinose - Mang gen kháng ampicillin - Sử dụng plasmid pKD46 biến nạp vào E ictaluri để tận dụng hệ thống tái tổ hợp λ Red Trang 21 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Hình 2.6 Plasmid pKD46 2.1.5.6 Plasmid pGP704 - Kích thước 3705 bp - Mang trình tự khởi đầu chép oriR6K, cần phải có protein π gen pir mã hóa nhân lên Do đó, plasmid trì chủng có gen pir E coli DH5α λpir; E coli SM10 λ pir - Mang gen kháng ampicillin Hình 2.7 Plasmid pGP704 Trang 22 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen wzz E ictaluri 2.2.1.1 Thiết kế mồi Dựa vào trình tự gen wzz E ictaluri (NC_012779) từ ngân hàng gen NCBI, thiết kế cặp mồi WF1/WR1 để khuyếch đại gen wzz kích thước 1038 bp Mồi WF1 mang trình tự nhận biết SalI, mồi WR1 mang trình tự nhận biết EcoRI có trình tự sau: WF1: 5’-GTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ WR1: 5’-GAATTCTCAGATCCGTGCACGACG-3’ 2.2.1.2 Khuếch đại thu nhận đoạn gen wzz E ictaluri Ly trích DNA gen E ictaluri theo quy trình sau: - Cấy khuẩn lạc E ictaluri vào ml môi trường BHI colistin, ni cấy lắc 250 vòng/phút, 28oC, 16 - Li tâm ml dịch nuôi cấy 6000 vòng/phút, phút - Bỏ dịch nổi, lấy cặn - Hòa tan cặn vào ml nước cất vơ trùng - Ly tâm 6000 vòng/phút, phút - Bỏ dịch nổi, thu cặn - Bổ sung 200 µl TE 1X vơ trùng, hòa tan cặn - Ủ 950C, 10 phút - Ly tâm 13000 vòng/phút, phút - Thu dịch nổi, bảo quản - 20oC DNA gen E ictaluri sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen wzz cặp mồi WF1/WR1 Sản phẩm PCR tinh qua cột để dòng hóa Trang 23 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.1.3 Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy mang đoạn gen wzz (pGEMT::wzz) Taq DNA polymerase có hoạt tính terminal transferase, thêm deoxyadenosine (A) vào đầu 3’ sản phẩm PCR Hệ thống vector pGEM-T Easy thiết kế mang thymidine (T) đầu 3’của hai bên T nhơ vị trí gắn tăng hiệu trình nối cách ngăn chặn việc tự đóng vòng vector cung cấp đầu T tương thích với đầu A sản phẩm PCR Nhờ vậy, phản ứng nối xảy dễ dàng Thành phần phản ứng nối sau: 2X buffer 5l Sản phẩm PCR 3l pGEM-T Easy 1l DNA T4 ligase 1l Phản ứng nối thực nhiệt độ phòng 2.2.1.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Các tế bào E coli phát triển pha log Tế bào thu cách li tâm huyền phù tế bào dung dịch có chứa CaCl2, tế bào có khả kết dính DNA (khả nạp) Trộn DNA vào dung dịch đệm phosphate với CaCl2 tạo phức hợp calcium-phosphate-DNA dính chặt vào màng tế bào vào tế bào chất nhờ tượng thực bào Các tế bào phát triển môi trường không chọn lọc, cho phép tổng hợp protein kháng kháng sinh, sau ni mơi trường chứa kháng sinh cho phép xác định khuẩn lạc chứa plasmid Các bước chuẩn bị tế bào khả nạp tiến hành sau: - Cấy khuẩn lạc E coli vào ml môi trường LB lỏng Nuôi cấy qua đêm điều kiện lắc 250 vòng/phút, 37oC - Cấy chuyền ml dịch nuôi cấy vào 100 ml mơi trường LB lỏng Ni cấy lắc 250 vòng/phút, 37oC giá trị OD590 dịch nuôi cấy đạt khoảng 0.375 (không để OD590 0.4) Trang 24 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Sau thu sản phẩm PCR lần 1, tiến hành đo nồng độ trộn chung đoạn (0,3 pmol đoạn) để làm mẫu cho phản ứng PCR lần Phản ứng PCR lần sử dụng cặp mồi WF1/WR1 cho sản phẩm STEP kích thước 1668 bp 2.2.4.3 Biến nạp cassette STEP vào E ictaluri mang pKD46 Các bước biến nạp cassette STEP thực cassette STEP mục 2.2.3.3 Trang 33 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.5 Knockout gen wzz phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 Các bước knockout gen wzz phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 tiến hành Sơ đồ 2.3 Sơ đồ 2.3 Tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz phương pháp sử dụng suicide plasmid pGP704 Trang 34 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.5.1 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu gen wzz a Thiết kế mồi Dựa vào trình tự gen wzz ngân hàng gen NCBI, thiết kế cặp mồi FHwzz/RHwzz để khuếch đại đoạn đầu gen wzz (Hwzz, kích thước 388 bp) FHwzz có trình tự cắt SalI, RHwzz có trình tự cắt BamHI có trình tự sau: FHwzz: 5’-AAGTCGACATGGTGAGTCAAAATCCGATGC-3’ RHwzz: 5’-AAGGATCCGTGCACTCCCCTCTTTATGACG-3’ b Khuếch đại thu nhận đoạn Hwzz E ictaluri DNA gen E ictaluri ly trích mục 2.2.1.2 sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Hwzz cặp mồi FHwzz/RHwzz Sản phẩm PCR có kích thước 404 bp tinh qua cột để dòng hóa c Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz (pJET::Hwzz) Vector pJET1.2/blunt vector mạch thẳng đầu Vì đoạn Hwzz chèn vào phải đầu Do đó, trước nối, phải thực phản ứng cắt đuôi A sản phẩm PCR Taq DNA polymerase thêm vào Thành phần phản ứng sau: 2X buffer 10 l Sản phẩm PCR l H2 O l DNA blunting enzyme l Trộn đều, nhẹ nhàng khoảng 30 giây ủ 70oC phút để bất hoạt enzyme Sau đó, để đá phút bổ sung thành phần sau để tiếp tục phản ứng nối: Trang 35 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học pJET1.2/blunt l T4 ligase l Phản ứng nối thực nhiệt độ phòng 15 phút d Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị mục 2.2.1.4 e Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz vào E coli DH5α Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) ủ 37oC 16 f Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc Vector pJET1.2/blunt tự đóng vòng biểu enzyme giới hạn gây chết sau biến nạp khơng nhân lên Kết có dòng tái tổ hợp xuất đĩa ni cấy (khuẩn lạc trắng) PCR khuẩn lạc cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra diện đoạn chèn Hwzz Cặp mồi thiết kế hai bên trình tự MCS pJET1.2/blunt có trình tự sau: FpJET : 5'-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3' RpJET : 5'-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3' g Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính ni cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với SalI BamHI để kiểm tra diện Hwzz plasmid tái tổ hợp có thành phần sau: Plasmid pJET::Hwzz 10 µl NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/µl) µl SalI (20 U/µl) µl H2 O 15 µl Trang 36 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phản ứng cắt thực 37oC h Giải trình tự đoạn Hwzz Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau kiểm tra phản ứng PCR phản ứng cắt dùng để giải trình tự đoạn Hwzz cặp mồi FpJET/RpJET 2.2.5.2 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn cuối gen wzz a Thiết kế mồi Dựa vào trình tự gen wzz ngân hàng gen NCBI, thiết kế cặp mồi FTwzz/RTwzz để khuếch đại đoạn cuối gen wzz (Twzz, kích thước 405 bp) FTwzz có trình tự cắt BamHI, RTwzz có trình tự cắt XbaI có trình tự sau: FTwzz : 5’-AAGGATCCGTGGCACAGGCGATCTATCAGC-3’ RTwzz : 5’-AATCTAGATCAGATCCGTGCACGACG-3’ b Khuếch đại thu nhận đoạn Twzz E ictaluri DNA gen E ictaluri ly trích mục 2.2.1.2 sử dụng làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn Twzz cặp mồi FTwzz/RTwzz Sản phẩm PCR có kích thước 421 bp tinh qua cột để dòng hóa c Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Twzz (pJET::Twzz) Phản ứng nối thực đoạn Hwzz phần c mục 2.2.5.1 d Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị mục 2.2.1.4 e Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::Twzz vào E coli DH5α Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) ủ 370C 16 f Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc Trang 37 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đoạn Twzz chèn vào vector g Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính ni cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với BamHI XbaI để kiểm tra diện đoạn Twzz plasmid tái tổ hợp có thành phần sau: Plasmid pJET::Twzz 10 µl NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/µl) µl XbaI (20 U/µl) µl H2 O 15 µl Phản ứng cắt thực 37oC h Giải trình tự đoạn Twzz Plasmid tái tổ hợp pJET::Hwzz sau kiểm tra phản ứng PCR phản ứng cắt dùng để giải trình tự đoạn Hwzz cặp mồi FpJET/RpJET 2.2.5.3 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn đầu (Hwzz) đoạn cuối (Twzz) gen wzz a Phản ứng cắt giới hạn Phản ứng cắt giới hạn thực nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang hai đoạn Hwzz Twzz Đầu tiên phản ứng cắt mở vòng plasmid pJET::Hwzz enzyme BamHI XbaI Phản ứng cắt có thành phần sau: Plasmid JET::Hwzz 10 µl NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/µl) µl XbaI (20 U/µl) µl H2 O 15 µl Trang 38 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phản ứng cắt thực 37oC Sau đó, sản phẩm cắt tinh phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo phản ứng cắt plasmid pJET::Twzz enzyme BamHI XbaI để thu đoạn Twzz Thành phần phản ứng cắt sau: Plasmid JET::Twzz 15 µl X NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/ µl) µl XbaI (20 U/ µl) µl H2 O 26 µl Phản ứng cắt thực 37oC Đoạn Twzz tinh qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối b Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt mang đoạn Hwzz Twzz (pJET::HTwzz) Các sản phẩm cắt sau thu nhận nối với để tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz Phản ứng nối có thành phần sau: Plasmid pJET::Hwzz mở vòng 3µl Đoạn Twzz 10µl T4 DNA ligase buffer (10X) 2µl T4 DNA ligase (400 U/µl) 1µl H2 O µl Phản ứng nối thực nhiệt độ phòng 45 phút c Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị mục 2.2.1.4 d Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz vào E coli DH5α Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml) ủ 370C 16 e Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc Trang 39 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET::HTwzz f Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính ni cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với SalI XbaI để kiểm tra plasmid tái tổ hợp Phản ứng cắt có thành phần sau: Plasmid pJET::HTwzz 10 µl NE Buffer (10 X) 3µl SalI (20 U/µl) µl H2 O 16 µl Sau ủ 37oC, giờ, hỗn hợp phản ứng tủa ethanol 1000 tiếp tục cắt XbaI Thành phần điều kiện sau: H2 O 26 µl NE Buffer (10 X) µl XbaI (20 U/µl) µl Phản ứng cắt thực 37oC 2.2.5.4 Tạo dòng E coli DH5α chứa plasmid pJET1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin từ pCAMBIA 1300 a Thiết kế mồi Dựa vào trình tự gen kháng kanamycin (AF234296) pCAMBIA 1300 ngân hàng gen NCBI, thiết kế cặp mồi FKm/RKm để khuyếch đại đoạn gen kháng kanamycin 1219 bp Cặp mồi gắn trình tự FRT vị trí cắt enzyme BamHI có trình tự sau: FKm: 5’-AAGGATCCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCG GAATAGGAACTTC CCAGCCAGCCAA-3’ RKm: 5’-AAGGATCCAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGT Trang 40 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học ATAGGAACTTCCTAAAACAATTCATCCAGT-3’ b Khuếch đại thu nhận đoạn gen kháng kanamycin từ plasmid pCAMBIA 1300 Thực phản ứng PCR mẫu plasmid pCAMBIA 3000 với cặp mồi FKm/RKm để khuếch đại đoạn gen kháng kanamycin Sản phẩm PCR có kích thước 1327 bp tinh qua cột để dòng hóa c Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET 1.2/blunt mang đoạn gen kháng kanamycin (pJET::KmR) Phản ứng nối thực phần c mục 2.2.5.1 d Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị mục 2.2.1.4 e Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::KmR vào E coli DH5α Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Gen kháng kanamycin chèn vào giúp dòng tế bào chứa plasmid tái tố hợp kháng kanamycin Vì vậy, tế bào biến nạp trãi mơi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml), ủ 37oC 16 f Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra đoạn gen kháng kanamycin chèn vào vector g Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính nuôi cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với BamHI để kiểm tra diện đoạn gen Plasmid pJET::Km 10µl Trang 41 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/µl) µl H2 O 16 µl Phản ứng cắt thực 37oC 2.2.5.5 Tạo dòng E coli DH5α mang plasmid chứa cassette HTK (pJET::HTK) Cassette HTK chứa gen kháng kanamycin với hai bên đoạn đầu đoạn cuối gen wzz a Phản ứng cắt giới hạn Phản ứng cắt giới hạn thực nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp pJET mang cassette HTK Đầu tiên phản ứng cắt mở vòng plasmid pJET::HTwzz BamHI Phản ứng cắt có thành phần sau: Plasmid JET::HTwzz 10 µl NE Buffer (10 X) µl BamHI (20 U/µl) µl H2 O 15 µl Phản ứng cắt thực 37oC Sản phẩm cắt tinh phương pháp tủa với ethanol 100o để chuẩn bị cho phản ứng nối.Tiếp theo phản ứng cắt plasmid pJET::KmR enzyme BamHI để thu đoạn KmR Thành phần phản ứng cắt phần g mục 2.2.5.4 Đoạn KmR tinh qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối b Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HTK Các sản phẩm cắt sau thu nhận nối với để tạo plasmid tái tổ hợp pJET::HTK Phản ứng nối có thành phần sau: Plasmid pJET::HTwzz mở vòng µl Đoạn KmR 10 µl T4 DNA ligase buffer (10X) µl T4 DNA ligase (400 u/ µl) µl Trang 42 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học H2 O µl Phản ứng nối thực 16oC, qua đêm c Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị mục 2.2.1.4 d Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET::HTK vào E coli DH5α Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi môi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) ủ 37oC 16 e Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpJET/RpJET để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pJET::HTK f Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính ni cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với BglIIđể kiểm tra plasmid tái tổ hợp Phản ứng cắt có thành phần sau: Plasmid pJET::HTK 15 µl NE Buffer (10 X) µl BglII (20 U/µl) µl H2 O 26 µl Phản ứng thực 37oC 2.2.5.6 Tạo dòng tế bào E coli DH5α λpir mang plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK a Phản ứng cắt giới hạn Trang 43 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học Phản ứng cắt giới hạn thực nhằm chuẩn bị DNA cho phản ứng nối để tạo plasmid tái tổ hợp pGP704 mang cassette HTK Đầu tiên phản ứng cắt mở vòng plasmid pGP704 enzyme BglII Phản ứng cắt có thành phần sau: Plasmid pGP704 10 µl NE Buffer (10 X) µl BglII (20 U/µl) µl H2 O 15 µl Phản ứng cắt thực 37oC Sản phẩm cắt tinh phương pháp tủa với ethanol 100ođể chuẩn bị cho phản ứng nối Tiếp theo phản ứng cắt plasmid pJET::HTK BglII để thu cassette HTK Thành phần phản ứng cắt phần f mục 2.2.5.5 Cassette HTK tinh qua gel agarose để chuẩn bị cho phản ứng nối b Phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK Các sản phẩm cắt sau thu nhận nối với để tạo plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK Phản ứng nối có thành phần sau: Plasmid pGP04 mở vòng 3µl Cassette HTK 10µl T4 DNA ligase buffer (10X) 2µl T4 DNA ligase (400 u/ µl) 1µl H2 O µl Phản ứng nối thực 16oC, qua đêm c Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5α λpir phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị tế bào E coli DH5α mục 2.2.1.4 d Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E coli DH5α λpir Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi mơi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) ủ 37oC 16 Trang 44 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học e Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc PCR khuẩn lạc sử dụng cặp mồi FpGP704/RpGP704 để kiểm tra dòng tế bào chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK Cặp mồi có trình tự sau: FpGP704: 5'-GTTCCGCGCACATTTCC -3' RpGP704: 5'-GAATTCCCGGGAGAGCTCGATA -3' f Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các khuẩn lạc cho kết PCR khuẩn lạc dương tính nuôi cấy để tách chiết plasmid kiểm tra phản ứng cắt giới hạn - Plasmid tách chiết sử dụng kit Qiagen - Phản ứng cắt giới hạn với BglII để kiểm tra plasmid tái tổ hợp Phản ứng cắt có thành phần phần a mục 2.2.5.6 2.2.5.7 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E ictaluri::pKD46 để tạo chủng E ictaluri đột biến gen wzz - Plasmid pGP704::HTK tách chiết sử dụng kit Quiagen - Biến nạp plasmid vào E ictaluri::pKD46 mục 2.2.3.3 2.2.5.8 Tạo dòng E coli SM10 λpir chứa plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK a Chuẩn bị tế bào E coli SM10 λpir theo phương pháp hóa biến nạp Tế bào khả nạp chuẩn bị tế bào E coli DH5α mục 2.2.1.4 b Biến nạp plasmid tái tổ hợp pGP704::HTK vào E coli SM10 λpir Plasmid pGP704::HTK tách chiết sử dụng kit Quiagen Biến nạp thực mục 2.2.1.5 Tế bào biến nạp trãi mơi trường LB chứa ampicillin (50 µg/ml), kanamycin(50 µg/ml) ủ 37oC 16 c Kiểm tra dòng biến nạp PCR khuẩn lạc Các bước thực phần e 2.2.5.6 Trang 45 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học d Kiểm tra dòng biến nạp phản ứng cắt giới hạn Các bước thực phần f 2.2.5.6 2.2.5.9 Tạo chủng E ictalruri đột biến gen wzz phương pháp tiếp hợp Tiếp hợp (Joshua Lederberg Edward Tatum khám phá vào năm 1946) vận chuyển vật liệu di truyền vi khuẩn vi khuẩn nhận thông qua tiếp xúc tế bào, chuyển gen theo hướng nằm ngang giống biến nạp tải nạp, phương pháp biến nạp tải nạp khơng có tiếp xúc tế bào với tế bào Để thực tiếp hợp, chủng cho phải có yếu tố di truyền di động, thường yếu tố tiếp hợp, plasmid di động transposon - Chủng vi khuẩn E coli SM10 λpir chủng có kiểu gen sau: kmR, thi- 1, thr, leu, tonA, lacY, supE, recA::RP4-2-Tc::Mu, λpir - Plasmid pGP704 có nguồn gốc từ plasmid pBR322 có chứa AmpR, loại bỏ điểm khởi đầu chép (oriE1) mang điểm khởi đầu chép R6K (oriR6K), bình thường khơng nhân lên mà đòi hỏi phải có protein П mã hóa từ gen pir Protein П cung cấp prophage (lambda pir) mang gen pir Plasmid chứa đoạn 1.9-kb BamHI mã hóa mob RP4 Vì vậy, pGP704 di động vào chủng nhận chức chuyển mà cung cấp RP4, hợp vào nhiễm sắc thể E coli SM10 - Cassette chứa gen đột biến chuyển vào pGP704, biến nạp vào E coli SM10 λ pir Trộn chung E coli SM10 λpir E ictaluri, chuyển lên màng để thực phản ứng lai, sau lai plasmid vào chủng nhận khơng thể nhân lên thiếu gen pir, gen đột biến sát nhập vào gen nhiễm sắc thể tái tổ hợp tương đồng mà có trao đổi chéo gen plasmid gen tương ứng nhiễm sắc thể Sự chọn lọc mơi trường LB có chứa kháng sinh kanamycin colistin Vì plasmid pGP704 khơng tự nhân lên chủng nhận E ictaluri nên tất khuẩn lạc E ictaluri mọc mơi trường có chứa kháng sinh có gen đột biến Qui trình tiếp hợp thực sau: Trang 46 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Thạc sĩ Sinh học Nuôi chủng nhận E ictaluri::pKD46 mơi trường BHI broth có bổ sung ml MgSO4 (10 mM), mg bovine serum albumin (BSA)/ ml,10 µg DNase I/ml 10mM L – arabinose - Nuôi chủng cho E coli SM10 λpir mang plasmid pGP704::HTK - Trộn E ictaluri::pKD46 với E coli SM10 λpir theo tỉ lệ 10:1 - Cho vào ml MgSO4 (10 mM), mg bovine serum albumin (BSA)/ ml 10 µg DNase I/ml - Chuyển 2-3 ml dung dịch trộn lên màng lai cellulose acetate filter (0,45 µm pore size, 33 mm diameter; Millipore ) - Đặt màng lai lên môi trường BHI agar, chia đĩa petri làm phần, phần cho ml môi trường BHI agar (agar 2%) chứa MgSO4 (10 mM), mg/ ml 70 µg DNase I/ml Tris (pH = 7,5), 20 mM - Ủ 28oC , 4h - Phủ lên mm agar - Huyền phù vi khuẩn mơi trường BHI lỏng có bổ sung ml MgSO4 (10 mM), mg bovine serum albumin (BSA)/ ml 10 µg DNase I/ml - Votex 10 giây - Pha loãng, trải đĩa chọn lọc E ictaluri đột biến môi trường BHI kanamycin-colistin 2.2.6 Loại bỏ plamid pKD46 khỏi chủng E ictaluri đột biến gen wzz Plasmid pKD46 nhạy cảm với nhiệt độ không nhân lên điều kiện 37oC Vì ni cấy điều kiện 37oC giúp loại plasmid pKD46 Nuôi cấy khuẩn lạc E ictaluri đột biến gen wzz điều kiện lắc 250 vòng/phút, 28oC, qua đêm Sau tăng nhiệt độ lên 37oC, ni cấy qua đêm Trãi dịch nuôi cấy môi trường BHI kanamycin Kiểm tra plasmid pKD46 cách cấy khuẩn lạc vào môi trường BHI ampicilin Các khuẩn lạc loại bỏ plasmid pKD46 khả kháng ampicilin không mọc môi trường chứa ampicillin Trang 47 ... Trang 24 Trần Thị Thanh Thanh - Luận văn Thạc sĩ Sinh học Chuyển dịch nuôi cấy vào falcon 50 ml lạnh Ngâm nước đá - 10 phút Tất bước phải thực đá lạnh - Ly tâm thu sinh khối tế bào 3000 vòng/phút,... cấy thu sinh khối có bổ sung L – arabinose đến nồng độ cuối 10 mM Tế bào khả nạp sử dụng liền để không hoạt tính enyme tái tổ hợp λ red Trang 28 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.2.3... pháp điện biến nạp - Glycerol 10% - Nước cất vô trùng Trang 17 Trần Thị Thanh Thanh Luận văn Thạc sĩ Sinh học 2.1.3 Môi trường 2.1.3.1 Môi trường LB (Luria Bertami) Trypton 10 g Yeast extract