Xác định tỷ lệ nhiễm escherichia coli o157h7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại hà nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu

169 281 0
Xác định tỷ lệ nhiễm escherichia coli o157h7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại hà nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU PHẠM THỊ TÂM CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Việt Nam Chính phủ hầu hết Ngành, cấp người tiêu dùng quan tâm Gần báo chí thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật không mục đích khơng phù hợp với qui định, gây ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ người Việc phát thấy chất sudan lòng đỏ trứng gà, melamin sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với ngưỡng quy định hồi chuông cảnh báo cho an toàn thực phẩm lưu hành Việt Nam Theo số liệu thống kê Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 nước xảy 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện có 41 trường hợp tử vong Nguyên nhân vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E coli Staphylococcus); độc tố tự nhiên hóa chất) [2] E.coli O15:H7 chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc thực phẩm nhiều quốc gia giới với hội chứng: tiêu chảy, viêm ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS) Thịt bò sản phẩm chế biến từ bị loại thực phẩm có nguy cao nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7 Theo báo cáo Griffin P.M, (1995) [47], 3,7% mẫu thịt bò vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7 Ở Châu Á, E.coli O157:H7 phát Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia (Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133] Ở Việt Nam, vi khuẩn phát thấy phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu cộng sự, 2005) [90] Bên cạnh đó, nghiên cứu tác giả nước phát thấy gen độc tố điển hình vi khuẩn E.coli O157:H7 thịt bò, thịt lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm cao (Phạm Công Hoạt cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong cộng sự, 2007) [5] Như vậy, với điều kiện chăn nuôi vệ sinh đặc biệt điều kiện giết mổ vệ sinh, thiếu kiểm soát Việt Nam nguy nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào loại thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng dễ xảy Với mục đích xác định có mặt vi khuẩn thịt bò để chủ động cơng tác phịng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, tiến hành thực đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu” Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội; - Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Việc xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 đặc tính sinh hóa độc lực vi khuẩn sở để xác định dịch tễ học hội chứng ngộ độc thực phẩm vi khuẩn gây ra, từ tạo sở để xây dựng biện pháp phịng ngừa q trình nhiễm thực phẩm điều trị bệnh vi khuẩn gây nên - Đề tài đưa quy trình chế tạo kháng thể đơn dịng đặc hiệu với vi khuẩn E.coli O157:H7 ứng dụng để sản xuất kit chẩn đoán huyết học xác định vi khuẩn 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài xác định có mặt vi khuẩn E.coli O157:H7 thịt bò bán Hà Nội số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh khả gây bệnh chủng - Đề tài chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi khuẩn E.coli O157:H7 Hai kháng thể sử dụng nghiên cứu tạo phức hợp kháng thể hạt nano silica để phát số lượng vi khuẩn E.coli O157:H7 Viện Cơng nghệ sinh học chủ trì thực - Việc xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát vi khuẩn góp phần tích cực cơng tác đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm Những đóng góp đề tài Kết đề tài hoàn toàn Việt Nam, với lý do: - Đề tài thực với đối tượng vi khuẩn E.coli O157:H7 nhiễm thịt bị đặc tính gây điển hình Kết đề tài minh chứng cho có mặt vi khuẩn thịt bò Hà Nội vùng phụ cận - Lần Việt Nam chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn thực phẩm chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thực phẩm Chơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khuẩn E.coli g©y bƯnh Escherichia coli (E.coli) vi khuẩn thường trú đường ruột người động vật máu nóng Hầu hết chủng E.coli vơ hại Tuy nhiên, suy giảm miễn dịch có tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá mà chủng E.coli thơng thường gây bệnh Với chủng gây bệnh, vi khuẩn xâm nhập vào thể thông qua bề mặt màng nhày niêm mạc da gây nên hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i) nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết viêm màng não, iii) viêm ruột, tiêu chảy Theo thống kê James Nataro cộng sự, (1998) [53], chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh chia thành nhóm ( phụ lục bảng 1) + Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm chủng E.coli gây viêm ruột, tiêu chảy trẻ em tuổi (Polotsky cộng sự, 1977) [106] + Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm chủng E.coli tiết độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) độc tố ruột không bền nhiệt (heat-labile enterotoxin- LT) Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl cyclase tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’ - monophosphat) Yếu tố kích thích ion Cl bicarbonat tách khỏi tế + bào đồng thời ức chế Na bên tế bào, gây tượng kéo nước từ tế bào, mơ vào lịng ống tiêu hóa hậu gây tiêu chảy nước Còn độc tố ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’ monophosphat) bên tế bào dẫn đến kích thích tiết muối nước gây tiêu chảy Những chđng E.coli có loại nội độc tố LT ST gây tiêu chảy trầm trọng kéo dài (Levine cộng sự, 1987) [70] + Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): chđng E.coli bám lên niêm mạc làm bong tróc gây loét niêm mạc gây tiêu chảy lẫn máu (giống triệu chứng bệnh lỵ vi khuẩn Shigella) (DuPont cộng sự, 1971) [35] + Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): nhóm E.coli gây tiêu chảy không sản sinh độc tố (Cravioto cộng sự, 1979) [29] + Nhóm EHEC: nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện vi khuẩn E.coli O157: H7 Vi khuẩn gây bệnh người với triệu chứng cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hố, phân có lẫn máu, gây hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp nghiêm trọng gây tử vong 85-95% ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7 có biểu hội chứng urê huyết (Riley cộng sự, 1983) [119] E.coli O157:H7 vi khuẩn thuộc loài E.coli gây ngộ độc thực phẩm người Theo ước tính CDC, (1999) [26], hàng năm số ca nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 nước chiếm khoảng 20.000 người, đó, khoảng 250 trường hợp tử vong Nguyên nhân tình trạng ngộ độc E.coli O157:H7 nhiễm nước uống, rau xanh, thịt bò sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bị Theo tác giả Faith cộng sự, (1996) [39], Hancock cộng sự, (1994) [48], tỷ lệ E coli O157:H7 gia súc non lớn gia súc trưởng thành Còn theo nghiên cứu Doyle cộng sự, (1997) [34] cho biết: E coli O157:H7 có mặt 3,7% mẫu thịt bò bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5% mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu Bên cạnh đó, nghiên cứu khác Le Saux cộng sự, (1993) [68], chứng minh vi khuẩn E coli O157:H7 nhiễm thịt bò tái, sữa tươi bánh humburger nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc thực phẩm Mỹ Canada Ngoài ra, người ta xác định có mặt vi khuẩn sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước hoa chưa trùng (Besser cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996) [78] rau sống (Morgan, 1988) [83] Ở Việt Nam, chưa có báo cáo số trường hợp ngộ độc thực phẩm E.coli O157:H7, nhiên, theo báo cáo Noboru cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân bị ni Việt Nam có mặt vi khuẩn Theo số nghiên cứu nước tác giả như: Phạm Công Hoạt cộng sự, (2003) [3] xác định 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc tố Stx vi khuẩn E.coli O157:H7 Còn nghiên cứu tác giả Trần Thanh Phong cộng sự, (2007) [5], gen độc tố đặc trưng vi khuẩn E.coli O157:H7 Stx1, Stx2, eae, hly, stb phát thấy thịt bò, thịt lợn, phân bò, phân lợn bình thường tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao, cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bị bình thường, 55,9% mẫu thịt bò mang đến gen độc lực đặc trưng nhóm EHEC; cịn lợn có đến 33,3% mẫu phân lợn tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn mang đến gen độc lực đặc trưng nhóm EHEC 1.2 Các đặc tính vi khuẩn E.coli O157:H7 1.2.1 Đặc tính sinh học 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái E.coli O157: H7 trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích thước tế bào khoảng 2x0,5µm, khơng hình thành nha bào, có lơng roi, có khả di động Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, trịn trơn, bóng, có lớp màng bao bọc, gắn chặt bề mặt môi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt mơi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC) 1.2.1.2 Đặc tính ni cấy Khác với hầu hết chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 không lên men đường D-sorbitol, đó, mơi trường thạch Sorbitol MacKonkey sử dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn (March cộng sự, 1986) [77] Trên mơi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 khơng sinh enzyme glucuronidase, mơi trường có bổ sung chất 4- methylumbelliferyl--D-glucuronide (MUG), vi khuẩn không phát quang, vi khuẩn E.coli khác lại có khả Vì vậy, người ta phân biệt khuẩn lạc E.coli O157:H7 môi trường thạch MUG ánh sáng tử ngoại Ngồi ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 phân biệt môi trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) Fluorocult E.coli O157 (Merck, Đức) Trên môi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc vi khuẩn có màu xanh nhạt E.coli khác có màu vàng Cịn mơi trường thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ, xanh, tím 1.2.1.3 Sức đề kháng + Nhiệt độ: khả thích ứng với nhiệt độ vi khuẩn E.coli nhóm EHEC, bao gồm chủng E.coli O157:H7 tương tự với nhóm khác Theo Doyle cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn bị ức chế điều kiện 44 C Tuy nhiên, Palumbo cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả thích ứng với nhiệt độ E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy: môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn phát triển tốt nhiệt độ 45 C, cịn với mơi trường EC (E.coli) chúng lại bị ức chế nhiệt độ 44 C Theo Buchanan cộng sự, (1994) [21], Rajkowski cộng sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng vi khuẩn E.coli O157:H7 khoảng 8-10 C + Độ pH: theo Buchanan cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi khuẩn E.coli O157:H7 5,5-7,5 Vi khuẩn bị ức chế mạnh mức pH 4,0-4,5, nhiên ảnh hưởng pH tới phát triển vi khuẩn phụ thuộc vào yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer cộng sự, 1995) [71] Còn theo nghiên cứu Benjamin cộng sự, (1995) [13], Buchanan cộng sự, (1996) [22], chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả chịu độ pH 2,5 2-7 37 C Trong loại thực phẩm lên men nước ép trái cây, mát, E.coli O157:H7 tồn sau vài tháng Tuy nhiên, khả sống sót vi khuẩn phụ thuộc nhiều vào thời gian bảo quản, ví dụ: nước ép hoa vi khuẩn tồn từ 2-3 ngày 0 25 C, C, vi khuẩn tồn từ 10-30 ngày (Zhao cộng sự, 1993) [148] + Khả chịu mặn: theo Buchanan cộng sự, (1994) [22], vi khuẩn E.coli O157:H7 chịu nồng độ muối từ 0,5-5% 1.2.2 Đặc tính sinh hố Kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E.coli O157:H7 thực sau bước nuôi cấy vi khuẩn mơi trường đặc hiệu SMAC Các khuẩn lạc có màu vàng nâu nhạt cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria Agar), sau 18 nuôi cấy 42 C, thu nhận khuẩn lạc đứng riêng rẽ để làm phản ứng sinh hóa bảng 1.1 Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel cộng sự, 1998) [122] Phản ứng β-Glucuronidase Sorbitol Salicin Esculin Arginine dihydrolase Adonitol Inositol Cellobiose Urease Citrate KCN Sucrose Glucose (acid) Glucose (gas) Indol Arabinose Trehalose Mannitol Lactose Maltose Rhamnose Xylose Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Raffinose Dulcitol Kết phản ứng + + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính 152 Bảng 3.11 Bảng Kết theo dõi ảnh hưởng yếu tố thí nghiệm 91 đến trình dung hợp tế bào Phân tích mơ hình thí nghiệm dung hợp tế bào 92 Kết thí nghiệm ảnh hưởng yếu tố đế 96 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 trình sinh trưởng sinh kháng thể tế bào lai Kết tách dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn 102 dòng Kết xác định độ đặc hiệu dòng kháng thể 105 đặc hiệu với kháng nguyên H7 vi khuẩn E.coli O157:H7 (OD450) Danh mục bảng phụ lục Bảng Các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình Bảng Kháng nguyên chủng vi khuẩn E.coli Bảng Cấu trúc kháng nguyên O số chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình Bảng Phản ứng chéo kiểu kháng nguyên O E coli Bảng Phản ứng chéo kháng nguyên O E coli với vi khuẩn khác Bảng Thành phần cấu tạo số loại kháng nguyên K thuộc nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20 Bảng Cấu trúc số loại kháng nguyên K vi khuẩn E.coli thuộc nhóm O8, O9, O101, O2 Bảng Thành phần cấu tạo số loại kháng nguyên K khơng thuộc nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20 Bảng Sự phát triển nghiên cứu kháng thể đơn dòng Bảng 10 Thành phần phản ứng PCR Bảng 11 Thành phần phản ứng nối ghép sản phẩm PCR vector pBT 153 Bảng 12 Thành phần phản ứng cắt đoạn DNA enzym Bam HI Bảng 13 Thành phần gel SDS-PAGE Hình ảnh báo cáo Trang Hình 1.1 Cấu trúc độc tố Stx chế gây bệnh 14 Hình 1.2 Cấu trúc LPS 20 Hình Sơ đồ gen mã hố kháng ngun O157 23 Hình 1.4 Cấu trúc bề mặt tiên mao vi khuẩn E.coli 23 Hình 1.5 Sơ đồ gen tổng hợp kháng nguyên H7 25 Hình 1.6 Sơ đồ gen chủng vi khuẩn E.coli K12 30 Hình 1.7 Các loại kháng thể đơn dịng tái tổ hợp 40 Hình 3.1 Hình 3.2 Các hình ảnh sinh hóa định typ kháng huyết vi khuẩn E.coli O157:H7 Kết tách chiết ADN tổng số chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập 61 63 Hình 3.3 Kết phản ứng nhân đoạn gen 16s ARNr 63 Hình 3.4 Sơ đồ vector pBT 64 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli DH5 sau biến nạp vector tái tổ hợp Kết tách chiết DNA plasmide từ khuẩn lạc xanh, trắng Kết cắt ADN plasmide enzyme Bam HI Hình ảnh tách ADN tổng số vi khuẩn E.coli O157:H7 Kết xác định gen độc tố chủng E.coli O157:H7 phân lập Biểu bệnh tích tế bào bị gây nhiễm độc tố tách từ chủng E.coli O157:H7 M61 (pha loãng 102) Kết điện di kháng nguyên vi khuẩn E.coli 66 67 68 70 72 74 77 154 O157:H7 gel SDS-PAGE Hình 3.12 Hình 3.13 Ảnh hưởng điều kiện yếu tố dung hợp 94 đến trình lai tế bào Đại thực bào thu nhận từ ổ bụng chuột BALB/c để 97 làm tế bào nuôi duỡng Ảnh hưởng thành phần bổ sung vào mơi Hình 3.14 trường nuôi đến khả sinh trưởng sinh kháng 99 thể tế bào lai Hình 3.15 Hình 3.16 Tế bào lai giếng phiến nhựa 96 lỗ Dòng tế bào sau ngày tách dòng (trong phiến nhựa 96 lỗ) 101 103 Hình ảnh điện di kháng nguyên vi khuẩn E.coli Hình 3.17 O157:H7 gel SDS-PAGE Western blot với 104 Mab C3.26.IV Biểu đồ, đồ thị báo cáo Đồ thị 3.1 Đồ thị 3.2 Đồ thị 3.3 Đồ thị 3.4 Biến thiên kháng thể tạo thành thỏ gây 79 miễn dịch Biến thiên kháng thể chuột tiêm kháng 83 nguyên H7 với hàm lượng khác Biến thiên hàm lượng kháng thể chuột 86 tiêm chất bổ trợ khác Kết theo dõi trình sinh trưởng sinh 100 kháng thể dịng tế bào lai Hình ảnh phụ lục Hình Thời gian biểu bệnh người E coli O157:H7 Hình Các gen có liên quan đến độc tố vi khuẩn nhóm EHEC Hình Sơ đồ phân lập E coli O157:H7 155 Trình tự gen 16s ARNr vi khuẩn E.coli O157:H7 máy giải trình tự Perkin Elmer Hình VERO kiểm tra độc tố E.coli O157:H7 Kiểm tra bệnh tích tế bào VERO Chai ni cấy tế bào Hình ảnh ni cấy tế bào lai sau tách dịng Hình ảnh tếHình bào u5 tủy chuột dịng Sp 2/0-Ag14 Hình Hai khuẩn lạc tế 6bào lai giếng nuôi sau tách dịng (giếng lai bị loại) Khuẩn lạc tếHình bào 7lai sau tách dịng Hình Hình Hình 10 156 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT ADN : Acid deoxyribonucleic ARN : Acid ribonucleic ARNr : Acid ribonucleic ribosome BHI : Brain Heart Infusion ĐTB : Đại thực bào E.coli O157:H7: Escherichia coli O157:H7 EPEC : Enteropathogenic E.coli ETEC : Enterotoxigenic E.coli EIEC : Enteroinvasine E.coli EAEC : Enteroaggregative E.coli EHEC : Enterohaemorhagic E.coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid CDC : Center for Disease Control and Prevetion Cl : Clorua CFU : Colony Forming Unit ELISA : Enzyme Link Immunosorbent Assay FAO : Food and Agriculture Organization FDA : Food and Drug Administration FCA : Freund's Complete Ajuvant FCS : Fetal Carf Serum FIA : Freund's incomplete Ajuvant KIA : Kligler Iron Agar LB : Luria Agar LPS : Lipopolysaccharide Kda : Kilo Dalton 157 Kb : Kilobase HAT : Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine HT : Hypoxanthine, Thymidine JICA : Japan International Cooperation Agency Kháng nguyên O: Kháng nguyên thân Kháng nguyên H: Kháng nguyên lông Kháng nguyên K: Kháng nguyên giáp mô LT : heat-labile toxin HGKT : Hiệu giá kháng thể HUS : Haemolytic Ureamic Syndrome MDCS : miễn dịch sở Na : Natri OPI : oxaloacetate, pyruvate, bovine insulin PCR : Polymerase Chain Reaction PBS : Phosphate buffer saline PEG : polyethylene glycol SMAC : Sorbitol MacConkey ST : Heat stable toxin Stx : Shiga toxin TBL : tế bào lai USDA : United States Department of Agriculture Wzx : Gen mã hóa kháng nguyên thân Wzy : Gen trùng hợp kháng nguyên thân ... Escherichia coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu? ?? Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm E .coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội; - Sản xuất. .. khả sản sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên H7 - Kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng với vi khuẩn E .coli O157:H7 lựa chọn dịng có độ đặc hiệu cao, ổn định cho mục đích chẩn đốn, xác định. .. tăng sinh, pha loãng tách dòng tiết dòng kháng thể đơn dòng khác Bằng phương pháp miễn dịch học ELISA Western blot người ta xác định kháng thể đơn dòng đặc hiệu Kháng thể đơn dịng thu trực tiếp

Ngày đăng: 13/03/2019, 11:30

Từ khóa liên quan

Mục lục

  • 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

  • 3.2 Ý nghĩa thực tiễn

    • 1.2.1 Đặc tính sinh học

    • 1.2.2 Đặc tính sinh hoá

  • Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá của vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel và cộng sự, 1998) [122]

    • 1.2.3 Đặc tính gây bệnh

    • 1.2.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli O157:H7

  • 1.3 Nguồn tàng trữ vi khuẩn E.coli O157:H7

  • 1.4 Các phương pháp chẩn đoán, xác định vi khuẩn

    • 1.4.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

    • 1.4.2 Phương pháp miễn dịch học

    • 1.4.4 Phương pháp PCR-Mutiplex

  • Bảng 1.2 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-

  • Bảng 1.3 Trình tự các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR-Multiflex phát hiện các gen độc tố của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Blanco và cộng sự) [16]

    • 1.5.1 Kháng nguyên thân (O)

  • Hình 1.2 Cấu trúc cơ bản của LPS

  • Hình 1.3 Sơ đồ gen mã hoá kháng nguyên O157

    • 1.5.2. Kháng nguyên lông (H)

  • Hình 1.5 Sơ đồ gen tổng hợp kháng nguyên H7

    • 1.5.3 Kháng nguyên giáp mô (K)

  • 1.6 Kháng thể đơn dòng

    • 1.6.1 Lịch sử phát triển kháng thể đơn dòng

    • 1.6.3 Các công nghệ sản xuất kháng thế đơn dòng

  • Hình 1.7 Các loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp

  • 2.2 Vật liệu nghiên cứu

    • 2.2.2 Hoá chất, vật liệu thí nghiệm

  • Hình 2.1 Kích thước các thang chuẩn

    • 2.2.3 Trang thiết bị thí nghiệm

  • 2.3 Nội dung

    • 2.3.2 Nghiên cứu xác định độc lực của các chủng E.coli O157:H7 phân lập

  • 2.4 Phương pháp nghiên cứu

    • 2.4.1 Phương pháp thu thập mẫu (TCVN 4833-1-2002, ISO 3100-1-1991) [6]

    • 2.4.2 Phân lập vi khuẩn E.coli O157:H7 (USDA, 2002) [140]

    • 2.4.3 Các phản ứng sinh hóa của vi khuẩn E.coli O157:H7 (Samuel và cộng sự, 1998) [122]

    • 2.4.4 Giải trình tự gen 16s ARNr (Sambrook và cộng sự, 2001)[121]

    • 2.4.5 Phương pháp điện di ADN (Sambrook, 2001) [121]

    • 2.4.6 Phương pháp chế kháng nguyên (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

    • 2.4.7 Phương pháp gây miễn dịch (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

    • 2.4.8 Phản ứng ELISA gián tiếp (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

    • 2.4.9 Phản ứng Western blot (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

    • 2.4.10 Phương pháp tạo kháng thể đơn dòng (Yoshihito Kihiwaraki, 2002) [147]

    • 2.4.11 Phản ứng PCR-multiplex

  • Hình 3.1 Các hình ảnh hình thái, sinh hóa và định typ bằng kháng huyết thanh của E.coli O157:H7

    • 3.1.2 Giải trình tự gen 16s ARNr của vi khuẩn E.coli O157:H7

  • Hình 3.2 Kết quả tách chiết ADN tổng số của chủng

  • Hình 3.3 Kết quả phản ứng nhân đoạn gen 16s ARNr

  • Hình 3.4 Sơ đồ vector pBT

  • Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt ADN plasmid

  • Hình 3.7 Kết quả cắt ADN plasmide bằng enzyme Bam HI

  • Bảng 3.3 So sánh mức độ tương đồng của trình tự gen 16s ARNr thu được với các trình tự của GeneBank

    • 3.2.1 Xác định các gen độc tố của các chủng E.coli O157:H7 phân lập

    • 3.2.2 Xác định khả năng sinh độc tố gây bệnh của các chủng E.coli O157:H7 phân lập trên tế bào VERO

    • 3.3.1 Chế tạo và lựa chọn kháng nguyên của E.coli O157:H7

  • Hình 3.11 Kết quả điện di kháng nguyên của vi khuẩn E.coli O157:H7 trên gel SDS-PAGE

  • Bảng 3.6 Kết quả đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ

  • Bảng 3.7 Kết quả kiểm tra khả năng phát hiện đặc hiệu kháng nguyên của các kháng thể tạo thành trên thỏ

    • 3.3.2 Đáp ứng miễn dịch của chuột Babl/C với kháng nguyên lông H7

  • Bảng 3.8 Kết quả theo dõi ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của chuột

  • Đồ thị 3.2 Biến thiên kháng thể trên chuột được tiêm kháng nguyên H7 với các hàm lượng khác nhau

    • 3.3.3 Nghiên cứu các điều kiện lai tế bào lách chuột mẫn cảm với kháng nguyên H7 và tế bào u tủy chuột

  • Bảng 3.11 Kết quả theo dõi ảnh hưởng của các yếu tố thí nghiệm

  • Bảng 3.12 Phân tích mô hình thí nghiệm dung hợp tế bào

  • (d)

  • (e) (f)

  • Hình 3.12 Ảnh hưởng của các điều kiện và yếu tố dung hợp đến quá trình lai tế bào

  • Bảng 3.13 Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của các yếu tố bổ sung đến quá trình sinh trưởng và sinh kháng thể của tế bào lai

  • Hình 3.13 Đại thực bào thu nhận từ ổ bụng chuột BALB/c

    • Theo dõi khả năng sinh trưởng của tế bào (hình 3.14a, b, c):

    • Theo dõi khả năng sinh kháng thể đặc hiệu của tế bào lai với kháng nguyên H7:

  • Hình 3.14 Ảnh hưởng của các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi

  • Hình 3.15 Tế bào lai

    • 3.3.5 Kết quả tách dòng tế bào lai và kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng với kháng nguyên H7

  • Bảng 3.14 Kết quả tách dòng các tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng

  • Hình 3.16 Dòng tế bào sau 5 ngày tách dòng

  • Hình 3.17 Hình ảnh điện di kháng nguyên E.coli O157:H7 trên gel SDS-PAGE và Western blot với Mab C3.26.IV

  • TÀI LIỆU THAM KHẢO

  • Trang phụ bìa

  • Lời cam đoan i

  • Mục lục iii

  • Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt iv

  • Danh mục các bảng, các hình ảnh, đồ thị v

  • vi

  • LỜI CAM ĐOAN

  • TÁC GIẢ LUẬN ÁN

  • iv

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan