ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC \ THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện dưới sư hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn cán Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghê gen, Viện Công nghê sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghê Việt Nam tạo điều kiện giúp đỡ tơi tiến hành thí nghiệm đề tài Tơi xin cảm ơn sư động viên, khích lê gia đình bạn bè suốt thời gian học tập thực hiện đề tài luận văn Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh cao học Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Phân loại thực vật học đặc điểm sinh học quýt 1.1.1 Phân loại thực vật học quýt 1.1.2 Đặc điểm sinh học quýt 1.1.3 Thành phần dinh dưỡng quýt 1.2 Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid thực vật 1.2.1 Ascorbic acid 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vitamin C 1.3 Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền 11 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liêu, hóa chất thiết bị 17 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất thiết bị 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1 Phương pháp thu mẫu 17 2.2.2 Phương pháp xác định trình tư gen 17 2.3 Phương pháp xử lý số liêu 22 2.4 Địa điểm nghiên cứu hoàn thành luận văn 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Nhân giải trình tư gen GDP-D từ DNA giống quýt BS-LS 23 3.1.1 Kết nhân gen GDP-D kỹ thuật PCR 23 3.1.2 Kết tách dòng gen GDP-D 24 3.1.3 Đặc điểm trình tư gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS 25 3.2 Sư đa dạng trình tư nucleotide trình tư amino acid suy diễn gen GDP-D 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 Kết luận 34 Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh bp base pair CIAA 24 Chloroform: isoamylalcol CTAB Cetyl trimetyl amomnium bromide DEPC Diethyl Pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleotide acid DNTPs Deoxynucleotide triphosphate GDP-D GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase kb kilo base NCBI National Center for Biotechology Information PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris - Acetate - EDTA DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.2 Chu kì nhiêt phản ứng PCR nhân gen GDP-D 19 Bảng 2.3 20 Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT Bảng 2.4 Thành phần phản ứng colony - PCR 21 Bảng 3.1 Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tư nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 27 Bảng 3.2 Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tư protein suy diễn gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 29 Bảng 3.3 30 Trình tư gen mang mã số GenBank sử dụng phân tích Bảng 3.4 Hê số tương đồng số phân ly trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS trình tư GenBank 31 Bảng 3.5 Hê số tương đồng số phân ly BS-LS trình tư GenBank dựa trình tư amino acid suy diễn gen GDP-D 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.1 Các dạng Ascorbic acid tư nhiên Hình 1.2 Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số mẫu quýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F GDP-D-R 23 Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc 24 Hình 3.3 Đặc điểm trình tư nucleotide mẫu BS-LS thu máy xác định trình tư nucleotide tư động 25 Hình 3.4 Kết so sánh trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tư gen GDP-D GenBank mang mã số HQ224946 27 Hình 3.5 Kết phân tích sư tương đồng giữa trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với số trình tư gen cơng bố GenBank 28 Hình 3.6 Kết so sánh trình tư amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank 29 Hình 3.7 Sơ đồ hình mơ tả mối quan BS-LS với trình tư cơng bố GenBank dựa trình tư nucleotide gen GDPD 31 Hình 3.8 Sơ đồ hình mơ tả mối quan BS-LS với trình tư cơng bố GenBank dựa trình tư amino acid suy diễn gen GDP-D 32 (1, 2, 3, 4: GDP-D khuếch đại từ khuẩn lạc BS-LS; M: thang DNA chuẩn kb) 3.1.3 Đặc điểm trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS Kết xác định trình tư gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS máy xác định trình tư nucleotide tư động trình bày hình 3.3 Hình 3.3: Đặc điểm trình tư nucleotide mẫu BS-LS thu máy xác định trình tư nucleotide tư động 26 Hình 3.4 Kết so sánh trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tư gen GDP-D GenBank mang mã số HQ224946 Kết so sánh phần mềm BioEdit cho thấy, trình tư gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tỷ lê A+T= 53,19%; G+C= 46,81% So sánh trình tư gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tư gen GDP-D mã số HQ224946 GenBank sử dụng thiết kế mồi hình 3.4 cho thấy có 1083 vị trí nucleotide giống nhau, sai khác vị trí nucleotide, vị trí 370, 371, 984 (Bảng 3.1) Bảng 3.1 Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tư nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 Vị trí nucleotide 370 Gen GDP-D phân lập từ giống BS-LS - Gen GDP-D mang ma số HQ224946 GenBank T 371 - T 984 - A TT 27 Ngoài ra, BLAST NCBI cho thấy trình tư gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng so với trình tư gen GDP-D mang mã số HQ224946 sử dụng để thiết kế cặp mồi PCR 99% Bên cạnh đó, trình tư gen GDP-D phân lập từ giống qt BS-LS có tỷ lê tương đồng với số trình tư khác mang mã số XM 025101133, XM 006486355, XM 006435547 95%; FJ643600 87%; XM021440285, XM021440284 85% (Hình 3.5) Hình 3.5 Kết phân tích sư tương đồng giữa trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với số trình tư gen công bố GenBank Như vậy, chúng tơi tách dòng thành cơng giải trình tư gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS thu thập Bắc Sơn- Lạng Sơn với chiều dài 1083bp 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tiếp tục so sánh trình tư amino acid suy diễn từ trình tư gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với protein suy diễn từ trình tư gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank phần mềm BioEdit thể hiện hình 28 3.6 Kết cho thấy, protein gen GDP-D mã hóa có 361 amino acid So với protein suy diễn từ trình tư gen mang mã số HQ224946 GenBank trình tư amino acid mẫu quýt BS-LS có độ tương đồng 29 99% Tuy nhiên, trình tư amnio acid protein GDP-D có sư khác amino acid (Bảng 3.2) Hình 3.6 Kết so sánh trình tư amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 GenBank Bảng 3.2 Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tư protein suy diễn gen GDP-D giống quýt BS-LS HQ224946 TT Vị trí amino acid Protein suy diễn từ Protein suy diễn từ gen gen GDP-D phân lập GDP-D mang ma số từ giống BS-LS HQ224946 GenBank 124 X F 328 X G 30 Từ hình 3.6 bảng 3.2 cho thấy, trình tư amino acid suy diễn gen GDP-D giữa giống quýt BS-LS trình tư protein suy diễn gen GDP-D công bố GenBank mang mã số HQ224946 có 358 vị trí amino acid giống nhau, khác vị trí acid amin, vị trí 124, 328 3.2 Sự đa dạng trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen GDP-D Tiến hành so sánh trình tư nucleotide gen GDP-D từ mẫu quýt BS-LS với trình tư gen GDP-D cơng bố GenBank để xác định số tương đồng số sai khác trình tư gen GDP-D, đồng thời thiết lập sơ đồ hình để phân tích sư đa dạng mẫu qt thơng qua trình tư gen GDP-D Bảng 3.3 Trình tư gen mang mã số GenBank sử dụng phân tích TT Giống / Ma số GenBank Năm công bố Đối tượng XM_025101133 2018 Cam đỏ XM_006486355 2018 Cam đỏ FJ643600 2009 Quả Dương đào XM_006435547 2018 Cam đỏ XM_024064261 2007 Cam đỏ XM_021440284 2017 Cam đỏ XM_021440285 2017 Cam đỏ Các trình tư gen sử dụng để so sánh có mẫu (mang mã số XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, XM_021440284, XM_021440285, XM_024064261, FJ643600) mẫu BS-LS Kết bảng 3.4 cho thấy số tương đồng giữa cặp so sánh dao động từ 69,0% đến 99,5%; số sai khác từ 0,0% đến 40,1% 31 Bảng 3.4 Hê số tương đồng số phân ly trình tư nucleotide gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS trình tư GenBank Mối quan di truyền mẫu quýt sở phân tích gen GDP-D thể hiên sơ đồ hình hình 3.7 Hình 3.7 Sơ đồ hình mơ tả mối quan BS-LS với trình tư cơng bố GenBank dựa trình tư nucleotide gen GDP-D Sơ đồ hình (Hình 3.7) dựa kết so sánh trình tư nucleotide gen GDP-D cho thấy, mẫu phân thành hai nhóm chính, nhóm I gồm mẫu chia thành XM_025101133, hai nhóm phụ, nhóm phu XM_006435547, XM_006486355, gồm mẫu: XM_021440284, XM_021440285, BS-LS; nhóm phu gồm mẫu XM_024064261 Nhóm phu lại chia thành nhóm nhỏ: nhóm nhỏ gồm mẫu XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355, BS-LS; nhóm nhỏ gồm mẫu XM_021440284, 32 XM_021440285; nhóm nhỏ chia thành nhánh: nhánh gồm mẫu: XM_025101133, XM_006435547, XM_006486355; nhánh gồm mẫu BS LS; nhánh chia thành nhánh nhỏ: nhánh nhỏ gồm mẫu: XM_006435547, XM_006486355; nhánh nhỏ gồm mẫu XM_025101133 Nhóm II gồm mẫu FJ643600 Như vậy, mẫu qt BS-LS mà chúng tơi nghiên cứu thuộc nhóm I Tiếp tục phân tích mối quan mẫu dựa trình tư amino acid suy diễn, kết thể hiện bảng 3.5 Bảng 3.5 Hê số tương đồng số phân ly BS-LS trình tư GenBank dựa trình tư amino acid suy diễn gen GDPD Kết bảng 3.5 cho thấy, số tương đồng giữa cặp so sánh dao động từ 94,8% đến 99,9%; số sai khác từ 0,0% đến 3,1% Hình 3.8 Sơ đồ hình mơ tả mối quan BS-LS với trình tư cơng bố GenBank dựa trình tư amino acid suy diễn gen GDP-D 33 Khoảng cách di truyền tính sở so sánh trình tư nucleotide gen GDP-D giữa nhóm 30.5% (Hình 3.7), dựa trình tư amino acid khoảng cách di truyền giữa nhóm 1,4% (Hình 3.8) Kết phân tích cho thấy trình tư nucleotide gen GDP-D mẫu quýt khác tương đối nhiều, chúng mã hóa nhiều amino acid khác nhau, dẫn tới tổng hợp enzyme GDP-D có chức xúc tác khác Vì vậy, khả tổng hợp vitamin C mẫu khác 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS nhân thành công phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GDP-F/GDP-R có kích thước 1083bp 1.2 Trình tư gen GDP-D phân lập từ mẫu quýt BS-LS có 282 base loại A, 294 base loại T, 212 base loại C, 295 base loại G Tỷ lê A+T= 53,19%; G+C= 46,81% 1.3 Trình tư nucleotide gen GDP-D giống quýt BS-LS tương đồng với trình tư nucleotide gen GDP-D mang mã số HQ224946 99% tương đồng trình tư mang mã số FJ643600 87,3% 1.4 Trình tư amino acid suy diễn từ gen GDP-D giống quýt BS-LS giống trình tư amino acid protein mang mã số ADV59923 (do HQ224946 mã hóa) 99% giống protein mang mã số ACN38266 (do FJ643600 mã hóa) 95,9% 1.5 Hê số tương đồng trình tư gen GDP-D mẫu quýt nghiên cứu so với mẫu GenBank dao động từ 69,0% đến 99,5%, số sai khác 0,1% đến 4,7% Hê số tương đồng trình tư amino acid suy diễn mẫu so sánh dao động từ 98,4% đến 99,9% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu trình tư đoạn mã hóa gen GDP-D làm sở cho việc thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc GDP-D phục vu chuyển gen để cải thiện hàm lượng vitamin C quýt 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt Đường Hồng Dật (2003), Cam, chanh, quýt, bưởi kỹ thuật trồng, Nxb Lao động - Xã hội Nguyễn Hữu Hiệp, Trần Nhân Dũng, Đặng Thanh Sơn Nguyễn Văn Được (2004), “Đa dạng sinh học giống có múi huyện Gò Quao, tỉnh Kiên Giang”, Tạp chí Khoa học, số 1: 111-121 Chu Hoàng Mậu (2008), Phương pháp phân tích di truyền đại chọn giống trồng, Nxb Đại học Thái Nguyên Trần Đình Long (1997), Chọn giống trồng, Nxb Nơng nghiệp Hồng Trọng Phán (2008), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Đại học Huế Hoàng Thị Sản (2004), Phân loại học thực vật, Nxb Giáo dục Khuất Hữu Thanh (2003), Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gen, Nhà xuất khoa học kĩ thuật Nguyễn Duy Thành (2000), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Khoa học Kỹ thuật Lê Duy Thành (2003), Cơ sở di truyền chọn giống thực vật, Nxb Nơng nghiệp 10 Quyền Đình Thi (2005), Những kỹ thuật phân tích DNA, Nhà xuất Bản Khoa học Kỹ thuật 11 Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy (2000), Phân loại học thực vật, Nxb ĐHQGHN 12 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tố kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Xuân Sâm (2003), Công nghệ Enzym, Nxb Khoa học Kỹ thuật 13 Nguyễn Văn Uyển, Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập (1995), Tập (1996), Nxb Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 14 Đào Thanh Vân, Ngơ Xn Bình (2003), Giáo trình ăn (Giáo trình Sau đại học), Nxb Nông nghiệp 15 Đỗ Năng Vịnh (2008), Cây ăn có múi - Cơng nghệ sinh học chọn tạo giống, Nxb Nông nghiệp 36 II Tài liệu tiếng Anh 16 Mohd Anwar Ahmad, Rashmi Gaur (2012) “Comparative biochemical and RAPD analysis in two varieties of rice (Oryza sativa) under arsenic stress by using various biomarkers”, Journal of Hazardous Materials, Volumes 217218, Pages 141-148 17 Sadaf Altaf, Muhammad M K (2014), “Morphogenetic characterization of seeded and seedless varieties of Kinnow Mandarin (Citrus reticulata Blanco)”, Australian Jounal of Crop Science (AJCS, (11): 1542-1549 18 Goh Pik Seah ELCY , Mansor Clyde MAHANI, Yong-Jin PARK, Normah Mohd NOOR (2011), “Simple Sequence Repeat (SSR) profiling of ultivated Limau Madu (Citrus reticulata Blanco) in Malaysia”, Biotechnol Fac Sci Technol., Univ.Kebangsaan Malaysia, 43600UKM Bangi, Selangor, Malaysia, Fruits, 67-74 DOI:10.1051/fruits/2011070 19 Kinley Dorji, Chinawat Yapwattanaphun (2015), “Assessment of the genetic variability amongst mandarin (Citrus reticulata Blanco) accessions in Bhutan using AFLP marker”, BMC Genetics, 16:39 DOI 0.1186/s12863015-0198-8 20 Behrouz Golein, M Nazeryan, B Babakhani (2012), “Assessing genetic variability in male sterile and low fertile citrus cultivars utilizing simple sequence repeat markers (SSRs)”, African Journal of Biotechnology, 11(7), 1632-1638 21 Nicholas Smirnoff, Glen L.Wheeler (2000), “Ascorbic Acid in Plants Biosynthesis and Functio”, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology UK, 291-314 22 Xiao-Yan Yang Jin-Xia Xie, Fang-Fang Wang, Jing Zhong, Yong-Zhong Liu, Shu-Ang Peng (2011), “Comparison of ascorbate metabolism in fruits of 37 two citrus species with obvious difference in ascorbate content in pulp”, Journal of Plant Physiology, 168 (02) 2196-2205 23 Junjie Tao, Han Wu, Zhangyun Li, Chunhui Huang and Xiaobiao Xu (2018) “Molecular Evolution of GDP-D-Mannose Epimerase (GME), a Key Gene in Plant Ascorbic Acid Biosynthesis”, Front Plant Sci DOI: [10.3389/fpls.2018.01293] 24.Gilbert L, Alhagdow M, Nunes-Nesi A, Quemener B, Guillon F, Bouchet B, Faurobert M, Gouble B, Page D, Garcia V, Petit J, Stevens R, Causse M, Fernie AR, Lahaye M, Rothan C, Baldet P.(2009) “GDP-D- mannose 3,5-epimerase (GME) plays a key role at the intersection of ascorbate and non-cellulosic cell-wall biosynthesis in tomato”,Plant J, 60(3):499-508, DOI: 10.1111/j.1365-313X.2009.03972 III Trang web tham khảo 25 https://vi.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C 26.http://khoahoc.tv/tim-ra-bi-an-cua-co-che-tong-hop-vitamin-c-o-thuc-vat15341 27.http://thegioicaygiong.vn/san-pham/giong-cay-quyt-ngot.html/ 28.http://www.hoahocngaynay.com/vi/hoa-hoc-va-doi-song/hoa-thucpham/239-vitamin-c.html 29 http://suckhoedoisong.vn/vo-quyt-vi-thuoc-da-nang-n115235.html 38 ...ĐẠI H C THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI H C SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP- D- MANNOSE- 3’. 5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ C Y QUÝT MIỀN NÚI PHÍA B C VIỆT NAM Ngành:... chọn đề tài: Phân lập gen mã hóa enzyme GDP- D- mannose- 3’. 5’- epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ quýt miền núi phía B c Việt Nam. ” M c tiêu nghiên c u Đánh giá đ c điểm trình tư gen. .. mannose epimerase (GDP- D) , x c t c GDP- D- mannose đến GDP- galactose GDP- L L -gulose, enzyme quan trọng đường sinh tổng hợp ascorbic acid thư c vật C c ch c mơ hình biểu hiện GDP- D nghiên c u kỹ c ng