ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––– NGUYỄN VIỆT NGA PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB6 TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ––––––––––––––––––––– NGUYỄN VIỆT NGA PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB6 TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp GS.TS Chu Hoàng Mậu Các số liệu, kết sử dụng luận văn trung thực đồng ý cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm kết nghiên cứu luận văn Tác giả luận văn Nguyễn Việt Nga i LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS Chu Hồng Mậu, người thầy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, bảo tạo điều kiện tốt giúp tơi thực nghiên cứu hồn thành luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ PGS.TS Lê Văn Sơn nhóm nghiên cứu, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm phân lập gen Tôi xin cảm ơn thầy cô cán Bộ môn Sinh học đại & Giáo dục sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Luận văn hỗ trợ Đề tài cấp Bộ Giáo dục & Đào tạo “Nghiên cứu bước đầu tạo dòng đậu tương chuyển gen GmDREB6 có khả chịu hạn cao”, mã số B2017-TNA-38 Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn Tác giả luận văn Nguyễn Việt Nga ii MỤC LỤC Trang TRANG BÌA PHỤ LỜI CAM ĐOAN………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN……………………………………………………… ii MỤC LỤC…………………………………………………………… iii DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………………… iv DANH MỤC BẢNG………………………………………………… v DANH MỤC HÌNH………………………………………………… vi MỞ ĐẦU …………………………………………………………… 1.Đặt vấn đề ………………………………………………………… Mục tiêu nghiên cứu …………………………………………… Nội dung nghiên cứu…………………………………………… Ý nghĩa khoa học thực tiễn ………………………………… Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………… ……… 1.1.Cây đậu tương ………… ……………………………………… 1.1.1 Cây đậu tương…………… ………………………………… 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu tương giới Việt Nam……… 1.2 Gen đặc tính chịu hạn đậu tương…………………… 1.2.1 Cơ chế chịu hạn đậu tương………… ……………… 1.2.2 Gen liên quan đến tính chịu hạn đậu tương…………… 11 1.3 Phân họ gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB……… ………… iii 12 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… 16 2.1 Vật liệu nghiên cứu địa điểm nghiên cứu………………… 16 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu………………………………………… 16 2.1.2 Địa điểm nghiên cứu………………………………………… 17 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………… 18 2.2.1 Nghiên cứu thông tin gen thiết kế cặp mồi nhân gen…………………………………………………………………… 19 2.2.2 Phương pháp tách chiết RNA tổng số……………………… 20 2.2.3 Phương pháp tạo cDNA…………………………………… 21 2.2.4 Phương pháp PCR…………………………………………… 21 2.2.5 Tách dòng gen GmDREB6…………………………………… 22 2.2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotide xử lý kết quả…………………………………………………………………… 24 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………… 25 3.1 Thiết kế cặp mồi PCR nhân gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……………….……………….……………….……… 25 3.1.1 Thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R……………….……… 25 3.1.2 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA………… 26 3.1.3 Kết nhân gen GmDREB6…………………………… 27 3.2 Tách dòng giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008…………………………………………………………… 28 3.2.1 Kết tách dòng gen DREB6……………………………… 28 3.2.2 Kết giải trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008……………………………………………………………… iv 29 3.3 Đặc điểm trình tự gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008……………………………………………………… 31 3.3.1 So sánh trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 với trình tự EF551166 NM_001248412 GenBank…………………………………………………………… 31 3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 giống DT2008 với trinh tự amino acid suy diễn EF551166 NM_001248412 GenBank……………………………………… 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………… 40 Kết luận…………………………………………………………… 40 Đề nghị…………………………………………………………… 40 CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN………………………… 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………… 42 v DANH MỤC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT AP2/ERF APETALA2/Ethylene Responsive Factor bp Base pair cDNA Complementary deoxyribonucleotide acid cs Cộng DNA Deoxyribonucleotide acid DNase Deoxyribonuclease E.coli Escherichia coli GmDREB6 Glycine max Dehydration responsive element binding protein gr Gram HSP Heat Shock Protein LEA Late Embryogenesis Abundant LTP Lipid Transfer Protein NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleotide acid TAE Tris – Acetate - EDTA DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự nucleotide cặp mồi……………………… 19 Bảng 2.2 Các bước tiến hành tách RNA tổng số………………… 20 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng tạo cDNA……………………… 21 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR…………………………… 22 Bảng 2.5 Bảng chu kỳ nhiệt phản ứng nhân gen DREB6………… 22 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB6 vào vector tách dòng………………………………………………………… 23 Bảng 2.7 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn E.coli…………….………………………………………………… 24 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự mang mã số EF551166 NM_001248412…….………………… 33 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412….…… 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí gen GmDREB6 NST số đậu tương…………………………………………………… ……… 14 Hình 1.2 Trình tự amino acid protein DREB6 Genbank mang mã số ABQ42205………………………………………… 15 Hình 2.1 Hạt giống đậu tương DT2008…………………… 16 Hình 2.2 Vector pBT sử dụng tách dòng phân tử gen GmDREB6 từ đậu tương……………… ………………… 17 Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt trình thực phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008………………………… 18 Hình 3.1 Sơ đồ thiết kế cặp mồi DREB6-F/DREB6-R………… 25 Hình 3.2 Kết tách chiết RNA tổng số từ non giống đậu tương DT2008……………………………………………… 26 Hình 3.3 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmDREB6 (cDNA) từ mRNA giống đậu tương DT2008………………………………………………………… 27 Hình 3.4 Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân gen GmDREB6 từ dòng khuẩn lạc màu trắng……………… 28 Hình 3.5 Kết phân tích BLAST gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008………………………………………… 29 Hình 3.6 Trình tự nucleotide trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008…………… 30 Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 Genbank……………… 32 31 Hình 3.7 So sánh trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank 32 Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412.2 TT DT2008 EF551166 NM_001248412.2 Vị trí nucleotide 19 T A A 20 T A A 51 A T T 52 A T T 75 A T T 197 T A A 319 C G G 320 C G G 408 C G G 10 409 C G G 11 580 A T T 12 581 A T T 13 635 G C C 14 636 G C C 15 680 C G G 16 681 C G G Bảng 3.1 hình 3.7 cho thấy, trình tự nucleotide gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự nucleotide gen GmDREB6 mang mã số EF551166 NM_001248412 GenBank, vị trí 19, 20, 51, 52, 75, 197, 319, 320, 408, 409, 580, 581, 635, 636, 680, 681 Tất sai khác thay cặp A-T G-C G-C A-T Vấn đề đặt thay 33 cặp nucleotide có làm thay đổi amino acid hay khơng cần phải tiến hành so sánh trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 3.3.2 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 giống DT2008 với trinh tự amino acid suy diễn EF551166 NM_001248412 GenBank Hình 3.8 thể trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 từ gen GmDREB6 mang mã số EF551166 NM_001248412 GenBank 34 35 Hình 3.8 Trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412 GenBank Hình 3.9 bảng 3.2 trình bày kết so sánh sai khác trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 hai trình tự gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank 36 Hình 3.9 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự gen DREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank 37 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 suy diễn từ trình tự mang mã số EF551166, NM_001248412.2 TT Vị trí DT2008 EF551166 NM_001248412.2 amino acid F N N 18 T S S 66 L Q Q 107 P G G 137 P A A 194 K L L 212 G A A 227 S W W Hình 3.9 bảng 3.2 cho thấy, trình tự amino acid suy diễn gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank có vị trí amino acid sai khác, vị trí 6, 18, 66, 107, 137, 194, 212, 227 Sự sai khác trình tự amino acid protein suy diễn gen GmDREB6 so với hai gen mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank có liên quan đến mức độ chống chịu stress hạn đậu tương cần tiếp tục xem xét vùng AP2 điểm liên kết với sợi DNA Kết so sánh hình 3.10 cho thấy, vùng AP2 protein suy diễn từ gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương DT2008 có vị trí sai khác, amino acid thứ 38 66 107 Hai điểm sai khác amino acid khơng thuộc vào vị trí DNA binding (60, 61, 63, 65, 67, 69, 73, 75, 82, 84, 87) Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid vùng AP2 protein suy diễn từ gen GmDREB6 giống đậu tương DT2008 EF551166, NM_001248412.2 GenBank 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Cặp mồi DREB6-F/DREB6-R thiết kế dựa thông tin gen GmDREB6 mang mã số EF551166 GenBank Kích thước mồi xi DREB6-F 21 bp mồi ngược DREB6-R 19 bp Đã khuếch đại thành cơng đoạn mã hóa gen GmDREB6 từ mRNA giống đậu tương DT2008 1.2 Đã tách dòng cDNA thành cơng xác định trình tự nucleotide gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 Gen GmDREB6 phân lập từ mRNA có kích thước 693 bp, mã hóa 230 amino acid 1.3 Gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương Việt Nam DT2008 có 16 vị trí nucleotide sai khác so với gen GmDREB6 mang mã số EF551166, NM_001248412.2 GenBank vị trí amino acid sai khác protein suy diễn Đề nghị Tiếp tục phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương có khả chịu hạn khác sử dụng trình tự gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 để thiết kế vector chuyển gen mục đích tăng cường khả chịu hạn đậu tương chuyển gen 40 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN Lò Thị Mai Thu, Nguyễn Việt Nga, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Chu Hoàng Mậu (2018), “Đặc điểm gen GmDREB6 phân lập từ giống đậu tương chịu hạn DT2008”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Đại học Thái Nguyên 187(11), pp 163-168 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thế Dân (1999), Cây Đậu Tương, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Trần Văn Điền (2007), Giáo trình đậu tương, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Danh Đông, (1982), Trồng đậu tương, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), “Promoter ứng dụng công nghệ gen thực vật”, Tạp chí cơng nghệ sinh học 5(1), pp 1-18 Nguyễn Thị Thúy Hường (2011), Phân lập, tạo đột biến điểm gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn thử nghiệm chuyển vào đậu tương Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Trần Thị Phương Liên (2010), Protein tính chống chịu thực vật, Nxb Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ Chu Hồng Mậu (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội Lò Thanh Sơn (2015), Nghiên cứu đặc điểm chuyển gen GmEXP1 liên quan đến phát triển rễ đậu tương, Luận án tiến sĩ sinh học, Đại học Thái Nguyên Phạm Văn Thiều (2008), Cây đậu tương – Kỹ thuật trồng chế biến sản phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 42 Tiếng Anh 10 Cao Xin-You, You-Zhi M (2008), “Isolation and identification of a GmGβ1 Interacting Protein with GmDREB5 Protein in Soybeen (Glycine max), Acta agronomica sinica, 34 (10), pp 1688-1695 11 Charlson D.V., Hu X., Okimoto B., Purcell L.C (2009), “Glycine max cultivar Jackson drought responsive element binding protein (DREB1)”, GenBank, Accession FJ965342, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 12 Chen M., Wang Q.Y., Cheng X.G., Xu Z.S., Li L.C., Ye X.G., Xia L.Q., Ma Y.Z (2007), “GmDREB2 a soybean DRE-binding transcription factor, conferred drought and high-salt tolerance in transgenic plants”, Biochem Biophys Res Commun., 353, pp 299-305 13 Chen M., Ma Y., Xu Z., Li L., Wang Q (2007), “Glycine max dehydrationresponsive element binding protein (DREB5) mRNA”, NCBI, GenBank, Accession EF583447, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 14 Chen M., Xu Z., Xia L., Li L., Cheng X., Dong J., Wang Q., Ma Y (2009b), “Cold-induced modulation and functional analyses of the DREbinding transcription factor gene GmDREB3, in soybean (Glycine max L.)”, J Exp Bot., 60(1), pp 121-135 15 Chen F., Chen S.Y., and Liu Q (2002), “Isolation of a rice cDNA encoding a DREB-like protein induced by stresses”, GenBank, Accession AY064403, http://www.ncbi.nlm.nih.gov 16 Hao Y J (2011), “Soybean NAC TF promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants”, Plant J., 68, pp.302-313 17 Huang B., Jin L and Liu J (2007), “Molecular cloning and functional characterization of a DREB1/CBF-like gene (GhDREB1L) from cotton”, Sci China Life Sci 50(1), pp 7-14 43 18 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zang J.S., Chen S.Y (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theor Appl Genet, 110(8), pp 1355-1362 19 Liu M., Wang N., Ma Y.Z., Cheng X.G.(2005), “Glycine max dehydration responsive element-binding protein 3(DREB3) mRNA”, GenBank, Accession DQ055133 20 Ma,Y.Z., Liu,Y.W., Chen,M., Xu,Z.S., Li,L.C and Zh,G.Y.(2007), “Glycine max dehydration-responsive element binding protein mRNA”, GenBank: EF551166.1 21 Mizoi J1, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K (2012), “AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses”, Biochim Biophys Acta., 1819(2), pp 86-96 22 Riechmann JL, Heard J, Martin G, Reuber L, Jiang CZ, Keddie J, Adam L, Pineda O, Ratcliffe OJ, Samaha RR, Crelman R, Pilgrim M, Broun P, Zhang JZ, Ghandehari D, Sherman BK, Yu GL (2000), “Arabidopsis transcription factors: Genome-wide comparative analysis among eukaryotes” Science 290, pp 2105–2110 23 Sambrook J.F and Russell D.W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Vols 1, and 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2100 pp 24 Dao Xuan Tan, Ho Manh Tuong, Vu Thi Thu Thuy, Le Van Son, and Chu Hoang Mau (2015), “Cloning and Overexpression of GmDREB2 Gene from a Vietnamese Drought-resistant Soybean Variety“ Braz Arch Biol Technol., 58(5), pp 651-657 25 Turner NC, Wright GC and Siddique KHM (2001) “Adaptation of grain legumes (pulses) to water limited environments” Adv Agron 71, pp 193-23 44 26 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?LinkName=nuccore_gene&from_uid= 146552061 27 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001248412 45 ... tạo gen nguyên liệu cho chuyển gen thông tin gen chuyển lựa chọn Xuất phát từ lý chọn thực đề tài: Phân lập gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB6 từ đậu tương phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực. .. ––––––––––––––––––––– NGUYỄN VIỆT NGA PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ DREB6 TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG PHỤC VỤ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT Ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 42 01 21 LUẬN VĂN THẠC SĨ... trình thực phân lập gen GmDREB6 từ giống đậu tương DT2008 18 Hình 2.3 mơ tả bước tiến hành phân lập gen GmDREB6 từ đậu tương, bao gồm bước: (1) Phân tích thông tin gen DREB6 đậu tương GenBank thiết