BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TẠO VI NANG CHẾ PHẨM PROTEIN GIÀU CAROTENOID CHIẾT XUẤT TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG CHITOSAN Giáo viên hướng dẫn :ThS Phạm Thị Đan Phượng Sinh viên thực : Võ Hoàng Thục Lan Mã số sinh viên : 56131302 Khánh Hòa - 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRNG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN TẠO VI NANG CHẾ PHẨM PROTEIN GIÀU CAROTENOID CHIẾT XUẤT TỪ ĐẦU TÔM THẺ CHÂN TRẮNG BẰNG CHITOSAN GVHD: ThS Phạm Thị Đan Phượng SVTH: Võ Hoàng Thục Lan MSSV: 56131302 Khánh Hòa, tháng 7/ 2018 LỜI CAM ĐOAN Đề tài có tham khảo kết số tác giả nghiên cứu bảo quản chế phẩm protein giàu carotenoid từ phế liệu thủy sản công nghệ tạo vi nang Tuy nhiên em xin cam đoan cơng trình riêng em, kết số liệu đồ án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Sinh viên thực Võ Hoàng Thục Lan LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành đồ án này, trước hết, em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Cơng nghệ Thực phẩm kính trọng niềm tự hào học tập trường năm qua Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn ThS Phạm Thị Đan Phượng hết lòng bảo, quan tâm hướng dẫn tận tình, thường xuyên theo dõi trình thực đề tài hỗ trợ em mặt suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Khoa Công nghệ Thực phẩm (đặc biệt PGS.TS Trang Sĩ Trung, TS Nguyễn Văn Hòa ThS Nguyễn Cơng Minh) tập thể cán phòng thí nghiệm: Cơng nghệ Thực phẩm, Cơng nghệ Hóa sinh, Chế biến Thủy sản - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành - Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình ln quan tâm, chia sẻ tất bạn bè giúp đỡ, động viên em suốt trình học tập thực đề tài Khánh Hòa, ngày tháng năm 2018 Tác giả đồ án Võ Hoàng Thục Lan MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .vii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.2 1.1.1 Các nghiên cứu nước liên quan đến đề tài 1.1.2 Các nghiên cứu nước liên quan đến đề tài TỔNG QUAN VỀ CHẾ PHẨM PROTEIN GIÀU CAROTENOID (CAROTENOPROTEIN) 1.2.1 Bản chất chế phẩm protein giàu carotenoid (carotenoprotein) 1.2.2 Tính chất carotenoprotein 1.2.3 Lợi ích ứng dụng chế phẩm protein giàu carotenoid 1.2.4 Phương pháp thu nhận chế phẩm protein giàu carotenoid phương pháp sinh học cô đặc chế phẩm sau thu nhận 1.2.5 1.3 1.4 Astaxanthin 10 TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN 17 1.3.1 Bản chất cấu tạo chitosan 17 1.3.2 Tính chất chitosan 18 1.3.3 Ứng dụng chitosan 19 TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ VI NANG 20 i 1.4.1 Giới thiệu công nghệ vi nang 20 1.4.2 Các vật liệu bao gói sử dụng công nghệ tạo vi nang 22 1.4.3 Một số phương pháp tạo vi nang 24 1.4.4 Cơ chế tạo hạt vi nang từ chitosan phương pháp nhỏ giọt 25 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.2 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 27 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29 2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tạo hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid – chitosan… 33 2.3.3 Các phương pháp đánh giá 38 2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 39 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 Thành phần hóa học nguyên liệu 40 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ dung dịch chitosan tới khả tạo vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 42 3.2.1 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch chitosan đến độ bền nhũ tương 42 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hình dạng hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 44 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến độ bền học hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 46 3.2.4 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch chitosan đến khả bọc astaxanthin protein hạt vi nang 48 ii 3.2.5 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến suất tạo hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid – chitosan 49 3.3 Ảnh hưởng loại nồng độ dung môi tới khả tạo vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 51 3.3.1 Ảnh hưởng loại nồng độ dung mơi đến hình dạng hạt vi nang 51 3.3.2 Ảnh hưởng loại nồng độ dung môi đến độ bền học hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 53 3.3.3 Ảnh hưởng loại nồng độ dung môi đến khả bao bọc astaxanthin protein hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 55 3.3.4 Ảnh hưởng loại nồng độ dung môi đến suất tạo vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid – chitosan 57 3.4 Ảnh hưởng nồng độ chitosan loại bao bì đến hàm lượng astaxanthin vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63 4.1 Kết luận 63 4.2 Đề xuất ý kiến 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 71 Phụ lục I: Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài 71 Phụ lục II Kết phân tích thí nghiệm tạo hạt vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid – chitosan phương pháp nhỏ giọt thiết bị DripperNeoV1 77 Phụ lục III Các hình ảnh thí nghiệm đề tài số hình ảnh thiết bị phân tích sử dụng đề tài 80 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo astaxanthin 10 Hình 1.2 Một số cấu trúc dạng đồng phân astaxanthin 11 Hình 1.3 Sự thay đổi astaxanthin tương tác với acid yếu 16 Hình 1.4 Cơng thức cấu tạo chitin chitosan 17 Hình 1.5 Mắt xích chitin đan xen mạch cao phân tử chitosan 17 Hình 1.6 Một số vi nang bao gói thành phần thực phẩm khác 20 Hình 1.7 Phương pháp đơng tụ polyme hóa bề mặt tạo hạt vi nang 24 Hình 1.8 Một số phương pháp học tạo hạt vi nang 24 Hình 1.9 Sự đơng tụ chitosan mơi trường kiềm 25 Hình 1.10 Một số kỹ thuật nhỏ giọt tạo vi nang 26 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nghiên cứu 29 Hình 2.2 Quy trình thu nhận chế phẩm protein giàu carotenoid từ đầu tôm thẻ chân trắng 30 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ chitosan tới khả tạo hạt vi nang 33 Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng dung môi tới khả tạo vi nang 35 Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm theo dõi hàm lượng astaxanthin thất q trình bảo quản vi nang hai loại bao bì 37 Hình 3.1 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến độ nhớt nhũ tương thời điểm ban đầu 42 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến độ bền nhũ tương theo thời gian 43 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hình dạng hạt vi nang 44 iv Hình 3.4 Hình ảnh hạt vi nang nồng độ chitosan khác 45 Hình 3.5 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến độ bền học hạt vi nang 47 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến hiệu suất bọc astaxanthin protein hạt vi nang 48 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ chitosan đến suất tạo vi nang 50 Hình 3.8 Ảnh hưởng dung mơi đến hình dạng hạt vi nang 51 Hình 3.9 Hình hạt vi nang tạo thành với dung môi khác 52 Hình 3.10 Ảnh hưởng dung mơi đến độ bền hạt vi nang 54 Hình 3.11 Ảnh hưởng dung mơi đến hiệu suất bọc astaxanthin 55 Hình 3.12 Ảnh hưởng dung mơi đến hiệu suất bọc protein 56 Hình 3.13 Ảnh hưởng loại nồng độ dung môi đến suất tạo vi nang 58 Hình 3.14 Ảnh hưởng nồng độ chitosan bao bì đến hàm lượng astaxanthin vi nang chế phẩm protein giàu carotenoid - chitosan 60 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Thành phần hóa học phế liệu tôm Litopenaeus vannamei Bảng 1.2 Thành phần hóa học chế phẩm protein giàu carotenoid chiết rút từ đầu tôm Bảng 1.3 Hàm lượng astaxanthin từ nguồn phế liệu sinh học loài giáp xác 10 Bảng 1.4 Các dung mơi thường sử dụng để hòa tan chitosan 18 Bảng 1.5 Các ứng dụng chitin – chitosan 19 Bảng 1.6 Các loại vật liệu bao gói sử dụng cơng nghệ bao vi nang 23 Bảng 3.1 Thành phần hóa học đầu tôm thẻ chân trắng 40 Bảng 3.2 Thành phần hóa học chế phẩm protein giàu carotenoid thu 41 vi 80 Taksima, T., Limpawattana, M., & Klaypradit, W (2015), “Astaxanthin encapsulated in beads using ultrasonic atomizer and application in yogurt as evaluated by consumer sensory profile”, LWT - Food Science and Technology, 62(1), 431-437 81 Tinkler, J.H., Bohm, F., Schalch, W., Truscott, T.G (1994) Dietary Carotenoids Protect Human-Cells from Damage Journal of Photochemistry and Photobiology BBiology, 26(3), 283-285 82 T N Dang, N B Pham, T T Trinh (2009), “Preparation of nanocapsules containing Gac oil”, Hanoi University of Pharmacy 83 Tolasa, S., Cakli, S., Ostermeyer, U (2005) Determination of astaxanthin and canthaxanthin in salmonid European Food Research and Technology, 221, 787–791 84 Torrissen, O J., Hardy, R W, Shearer, K D (1989), "Pigmentation of Salmonids; Carotenoid deposition and metabolism", Crit Rev Aquat Sci., 1, 209-225 85 Tran HD, Le AN & Ta TMN (2012), “Dispersion of gac oil in aqueous phase: effect of polymer and homogenous conditions”, Journal of Science and Technology, 50, 988993 86 Tran HD, Le TH, An TT & Ta TMN (2013), “Effect of carrageenanaddition in encapsulation of gac oil using gelatin gelation method”, Journal of fisheries science and technology, 58-62 87 Trung, T.S (2010) Report of research project "Recovery of valuable components from shrimp processing waste" funded by International Foundation for Science, Sweden 88 Vasantha Rupasinghe, H.; Yasmin, A (2010), "inhibition of oxidation of aqueous emulsions of omega-3 fatty acids and fish oil by phloretin and phloridzin", Molecules, 15, 251-257 89 Yamashita, F., et al, (2002), “Effects of packaging and temperature on postharvest of atemoya”, Rev Bras., Jaboticabal – SP, vol 24, pp 658-660 90 Watanabe, Hussein, G., Sankawa, U., Goto, H., Matsumoto, K., H (2006), "Astaxanthin, a carotenoid with potential in human health and nutrition", J Nat Prod, 69, 443-449 91 Zagalsky, P.E (1976) Carotenoid-protein complexes Pure Appl Chem., 47, 103-120 92 Zagalsky, P.E (1994), “Carotenoproteins: Advances in structure determination”, Pure & Appl Chem., Vol 66, No 5, pp 973-980 93 Z Zhang, R Zhang, D J McClements (2016), “Encapsulation of β-carotene in alginate-based hydrogel beads: Impact on physicochemical stability and bioaccessibility”, Food Hydrocolloids 70 PHỤ LỤC Phụ lục I: Các phương pháp phân tích sử dụng đề tài Xác định hàm lượng ẩm hàm lượng khoáng (AOAC, 1990) Cốc sấy sấy khô nhiệt độ 105oC 5-6 (đến khối lượng khơng đổi), sau để bình hút ẩm để làm nguội Cân xác định khối lượng cốc sấy W1 Cho mẫu cho vào cốc sấy cân khối lượng W2 Sấy 105oC 24 giờ, cân khối lượng W3 (AOAC, 1990) Tất khối lượng xác định tính theo gram Hàm lượng ẩm tính theo cơng thức sau: % Hàm lượng ẩm = [(W2 – W3)/( W – W1)] x 100 Sau xác định hàm lượng ẩm, ta đem nung cốc sấy có chứa mẫu khơ nhiệt độ 6000C, khoảng giờ, để bình hút ẩm cân khối lượng W4 Hàm lượng tro xác định theo công thức sau: % Hàm lượng tro = [(W4 – W1)/(W2 – W1)] x 100 Xác định hàm lượng đạm tổng số theo phương pháp Kjeldahl - Ngun lý: Vơ hóa mẫu acid sulfuric đậm đặc với có mặt chất xúc tác Sau đó, tiến hành kiềm hóa sản phẩm phản ứng Tiếp theo, chưng cất chuẩn độ lượng amoniac giải phóng ra, từ tính hàm lượng nitơ tổng số mẫu Để tính hàm lượng protein thơ, lấy giá trị hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6,25 - Dụng cụ, hóa chất  Dụng cụ:  Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động, Đức  Các dụng cụ thủy tinh chưng cất đạm kèm theo số dụng cụ thủy tinh khác ống đong, bình định mức, cốc chịu nhiệt Đức 71  Hóa chất: H2SO4 đậm đặc, dung dịch NaOH 40%, hỗn hợp xúc tác K2SO4 CuSO4 (5:1), dung dịch H3BO3 4%, thuốc thử tashiro (2g metyl xanh: 1g metyl đỏ pha 1000ml cồn 96o) - Tiến hành Vơ hóa mẫu: Cân lượng mẫu từ 0,2 – 1g cho vào ống Kjeldahl Thêm khoảng 0,5-1g xúc tác (hỗn hợp K2SO4:CuSO4 theo tỉ lệ 5:1) Cho vào ống khoảng 12 ml acid sulfuric đậm đặc Đặt ống Kjeldahl vào hệ thống phá mẫu Cài đặt nhiệt độ thời gian cho máy, thời gian vô hóa mẫu khoảng từ – Khi giai đoạn hoàn tất, chất lỏng ống có màu xanh da trời nhạt có màu trắng Nếu thấy ống số cặn rắn thêm nước cất vào lắc Chưng cất amoniac: Đặt ống Kjeldahl vô hóa vào hệ thống chưng cất Thời gian chưng cất mẫu khoảng phút Thêm giọt thị Tashiro vào bình hấp thụ tiến hành chưng cất Chuẩn độ lượng amoniac hấp thụ: tiến hành chuẩn độ dung dịch HCl 0,1N Dấu hiệu ngừng chuẩn độ màu dung dịch chuẩn độ chuyển từ màu xanh dương sang màu mận đỏ Tính kết Hàm lượng nitơ mẫu thử xác định theo công thức sau: (V1 – V0) C 100 WN (%) = Trong đó: M WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) V1 : thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử(ml) V0: thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) M : khối lượng mẫu đem phân tích (g) 72 C: Nồng độ HCl dung để chỉnh độ Hàm lượng protein thô mẫu thử xác định theo cơng thức sau: WProtein (%) = 6,25.WN Trong đó: WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) WProtein: hàm lượng protein thô mẫu (%) Xác định hàm lượng astaxanthin phương pháp Metusalach (1997), Tolasa cộng (2005) Dụng cụ, hóa chất ‐ Dụng cụ & thiết bị: Máy đồng hóa, máy quay chân không, máy so màu Các dụng cụ thuỷ tinh cốc, bình định mức 10ml, 250ml, ống đong 50ml, 100ml ‐ Hóa chất: hexan, isopropanol, eter dầu mỏ (petrolium ether), NaCl Tiến hành ‐ Cân xác 1g mẫu cho vào cốc thủy tinh ‐ Thêm 5ml dung môi chứa hexan isopropanol với tỷ lệ 3:2 Đồng hóa phút Để yên 30 phút Sau tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1 Tách chiết lần ‐ Dịch chiết đựng bình chiết bổ sung thêm 12ml eter dầu mỏ 10ml nước muối sinh lý Lắc nhẹ bình chiết để yên 10 phút nhiệt độ phòng cho tách pha hoàn toàn ‐ Tách bỏ pha dưới, lấy pha dung mơi bên Sau đó, rửa pha dung mơi 10ml nước muối sinh lý ‐ Tiến hành cô quay chân không 40oC để bay dung môi 73 ‐ Hòa tan mẫu với ete dầu mỏ định mức lên 10ml Sau đó, tiến hành pha lỗng mẫu (nếu cần) đo độ hấp thụ dung dịch 468 nm(A468), dùng eter dầu mỏ làm dung dịch so sánh Hàm lượng carotennoid tổng số (µg astaxanthin/g mẫu) mẫu tính theo cơng thức Simpson Haard (1985): C (µg/g mẫu) = Trong đó: A.D.V 0.2.G C: hàm lượng astaxanthin mẫu (µg/g mẫu) A: Độ hấp thụ dung dịch bước sóng 468 nm V: Thể tích mẫu chiết (ml) D: Hệ số pha lỗng G: Trọng lượng mẫu khơ (g) 0,2: hệ số hấp thụ dung dịch bước sóng 468 nm µg/ml astaxanthin chuẩn Xác định hàm lượng lipid theo phương pháp Bligh & Dyer (1959) - - Hóa Chất:  Chloroform (CHCl3)  Methanol (MeOH)  Dung dịch KCL 0,88%, thay NaCL 0,9% Tiến Hành: Cân gam mẫu lượng nước thêm vào cần thiết (0,8ml nước), tùy thuộc vào hàm lượng ẩm mẫu Sử dụng ống ly tâm thủy tinh dung dích 50ml, cho số gam mẫu lượng nước xác định vào, thêm 2,7ml chloroform 5,4ml methanol sau đồng hóa phút Thêm 2,7ml chloroform đồng hóa phút Thêm 2,7ml NaCl 0,9% tiếp tục 74 đồng hóa phút Đem hỗn hợp ly tâm nhiệt độ từ 0-5oC, 2500 vòng 20 phút Sau ly tâm xong, sử dụng pipet 50ml để hút pha chloroform có chứa lipid nằm phía ống ly tâm, pha lọc qua Na2S2O4 (để hút nước) xuống bình định mức 10ml, thêm chloroform đến vạch Sau xử lý xong, dung dịch mang xác định hàm lượng lipid tổng - Xác định hàm lượng lipid tổng: Lấy xác 2ml dung dịch mẫu xử lý, cho vào ống nghiệm có nắp 4ml sấy chân không đến khối lượng không đổi Cho vào tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi, áp suất khoảng 65-70 psi - Tính kết quả: Lipid tổng số (%) tính theo công thức XL(%) = (m1 - m0) Vdm 10000 Trong đó: Vm.m (100 – W) XL : Hàm lượng lipid tổng số tính theo trọng lượng khơ mẫu (%) M1 : Trọng lượng cân ống nghiệm có nắp mẫu sau sấy (g) M0 : Trọng lượng cân ống nghiệm có nắp đến khối lượng khơng đổi (g) m: Trọng lượng cân mẫu (g) Vdm :Thể tích định mức sau xử lý (ml) Vm : Thể tích mẫu sau xử lý lấy để sấy (ml) W: Độ ẩm mẫu (%) Phân tích đặc điểm hình dạng hạt ‐ Đo kích thước viên nang: Kích thước hạt xác định cách sử dụng thước kẹp có độ chia nhỏ 0,01mm để đo kích thước 300 hạt Kích thước trung bình 300 hạt coi 75 kích thước mẫu cho lần thí nghiệm lặp lại ba lần độc lập Kết biểu diễn dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn ‐ Xác định hình dạng hạt: Hình dạng hạt quan sát kính hiển vi soi Hình ảnh chụp lại camera, sau xử lý phần mềm ImageJ 14.6 Các thông số xác định bao gồm: - Phân bố kích thước hạt (theo diện tích – Area) - Độ tròn – Circularity (Tỷ lệ chu vi thực hạt chu vi đường tròn có diện tích, có giá trị từ – 1)  Độ tròn > 0,96: Hạt tròn (Primery spheres)  Độ tròn