1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÊ THỊ MAI LINH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG TUYẾN TRÙNG KÝ SINH GÂY SẦN RỄ Meloidogyne spp Ở TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: Tuyến trùng học Mã số: Thí điểm TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2019 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ -Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: TS Trịnh Quang Pháp Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Phan Kế Long Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tuyến trùng ký sinh gây sần rễ thuộc giống Meloidogyne nhóm tuyến trùng nội ký sinh cố định gây sần rễ Các lồi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả ký sinh nhiều loại chủ khác phân bố rộng giới, làm suy giảm suất sản lượng loại trồng Vì vậy, tuyến trùng sần rễ Meloidogyne trở thành mối quan tâm sản xuất nông nghiệp giới Tính đến năm 2006, có 111 lồi mơ tả có 18 lồi Meloidogyne ký sinh cà phê, chứng tỏ loài Meloidogyne có tính đa dạng cao Ở Việt Nam, năm 2000 ghi nhận loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne, Tây Nguyên ghi nhận xuất loài Các nghiên cứu sau cho thấy khu vực Tây Nguyên diện gây hại nhóm tuyến trùng Meloidogyne lớn đặc biệt cà phê hồ tiêu, làm hàng trăm hecta cà phê, hồ tiêu phải loại bỏ để thay trồng trồng khác Những tiêu chuẩn chủ yếu phân loại hình thái tuyến trùng sần rễ thường sử dụng cắt cutin vùng chậu (hậu mơn-sinh dục) cái, ngồi đặc điểm hình thái vùng đầu đực, vùng ấu trùng; đặc điểm hình thái lượng cái, đực, ấu trùng sử dụng nghiên cứu đa dạng hình thái lồi Tuy nhiên, chồng lấn đặc điểm hình thái quần thể loài, loài gần gũi, hay chủ khác vùng địa lý khác thường có dao động lớn nên gặp nhiều khó khăn chẩn loại đặc điểm hình thái Vì vậy, để hỗ trợ cho phương pháp phân loại dựa hình thái, kỹ thuật phân tử sử dụng hiệu phân loại loài Meloidogyne spp., chủ yếu sử dụng vùng gen hệ gen nhân (18S, ITS, 28S) vùng gen hệ gen ty thể COI COII đoạn khơng mã hóa vùng gen COII16s-rRNA hỗ trợ nhiều cho nghiên cứu phân loại phát sinh chủng loại loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne nhanh chóng xác, góp phần phục vụ cho biện pháp đánh giá tác hại phòng trừ tuyến trùng sần rễ Với tác hại phân bố rộng tuyến trùng sần rễ trồng, việc ngăn chặn phòng trừ nhóm tuyến trùng ln quan tâm định hướng tới nông nghiệp an tồn Biện pháp phòng trừ tuyến trùng chủ yếu sử dụng thuốc hóa học với hàm lượng cao gây tượng kháng thuốc ảnh hưởng đến môi trường đất, làm suy giảm đa dạng sinh vật có ích, ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe người vật ni Do đó, biện pháp phòng trừ sinh học trọng hơn, sử dụng vi sinh vật để chống lại loài tuyến trùng ký sinh thực vật xem biện pháp tiềm Xuất phát từ thực tiễn đa dạng trồng địa hình Tây Nguyên, đa dạng loài tuyến trùng sần rễ khả gây hại, thực đề tài: “Nghiên cứu đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp Tây Nguyên’’ Mục tiêu nghiên cứu  Xác định loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne gây hại trồng khu vực Tây Nguyên  Phân tích đặc điểm hình thái, phân tử đa dạng lồi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khu vực Tây Nguyên  Đánh giá khả sử dụng số vi sinh vật việc hạn chế phát triển tuyến trùng sần rễ Meloidogyne incognita điều kiện phòng thí nghiệm Nội dung nghiên cứu  Nghiên cứu phân bố, tần suất bắt gặp mật độ tuyến trùng sần rễ số trồng quan trọng: cà phê, hồ tiêu, rau màu trồng xen Tây Nguyên  Nghiên cứu hình thái đa dạng tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khu vực Tây Nguyên  Nghiên cứu đa dạng di truyền tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khu vực Tây Nguyên dựa phân tích vùng gen nhân gen ty thể  Đánh giá khả phòng trừ Meloidogyne incognita số vi sinh vật đối kháng như: nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus hợp chất 4-hydroxyphenylacetic acid 4HPAA 4.Ý nghĩa khoa học thực tiễn Ý nghĩa khoa học  Thành phần loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bổ sung Tây Nguyên, ghi nhận thêm nhiều ký chủ bị nhiễm tuyến trùng Meloidogyne phân bố chúng Mô tả ghi nhận loài mới, Meloidogyne daklakensis ký sinh cà phê  Các tiêu hình thái lồi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne chủ địa điểm đánh giá, so sánh đưa biến đổi hình thái lồi lồi khác xác định tiêu quan trọng thay đổi phân loại lồi đặc điểm hình thái, hình thái lượng vân cutin vùng chậu cái, vùng đầu đực phần đuôi ấu trùng  Đánh giá đa dạng di truyền quần thể loài loài Meloidogyne Tây Nguyên phân tích đưa đoạn gen bảo thủ tiến hóa phát sinh lồi Từ góp phần đưa chọn lựa tốt phân loại nhóm lồi Meloidogyne sinh học phân tử Bên cạnh đó, lần đóng góp sở liệu vùng gen nhân (ITS, D2D3) gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) loài Meloidogyne có mặt Việt Nam Genbank  Luận án khẳng định vai trò ký sinh gây chết vi sinh vật có lợi điều kiện phòng thí nghiệm nấm Paecilomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 phòng trừ lồi Meloidogyne incognita phổ biến nhiều trồng Ý nghĩa thực tiễn  Xác định thành phần loài, mật độ tuyến trùng gây sần rễ hại trồng tiêu chuẩn phòng trừ hiệu Cung cấp số liệu khả ký sinh, ký chủ, gây hại phân bố loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ góp phần ngăn chặn chúng phát tán điều kiện tự nhiên bảo vệ trồng tránh bị lây nhiễm Từ lựa chọn phương thức canh tác phù hợp trồng cà phê hồ tiêu trồng xen luân canh  Luận án cung cấp sở liệu hình thái phân tử lồi Meloidogyne phục vụ cho tra cứu, tham khảo  Đánh giá khả phòng trừ tuyến trùng sần rễ Meloidogyne nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, hợp chất 4-HPAA làm sở cho việc lựa chọn tác nhân phòng trừ, qua góp phần giảm lượng thuốc hóa học phòng trừ, giữ cân sinh thái để phát triển bền vững trồng chủ lực Tây Nguyên Những đóng góp luận án  Luận án lần đưa liệu đầy đủ phân bố, chủ đặc trưng hình thái, phân tử lồi tuyến trùng sần rễ cà phê, hồ tiêu trồng xen Tây Nguyên Đã xác định thêm nhiều chủ nhiễm tuyến trùng Meloidogyne Tây Nguyên cho Việt Nam Bổ sung 145 trình tự vùng gen ITS, D2D3, COI, COII-16S, NAD5 loài tuyến trùng sần rễ Tây Nguyên Genbank  Đã ghi nhận 01 loài tuyến trùng sần rễ cho khoa học ký sinh cà phê mô tả, công bố đặt tên Meloidogyne daklakensis n sp 01 lồi lại gửi công bố  Lần đâu tiên Việt Nam đánh giá khả ký sinh gây chết nấm Pacylomyces javanicus, vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 chất kháng sinh 4-HPAA tuyến trùng sần rễ M incognita điều kiện phòng thí nghiệm Bố cục luận án Luận án gồm: 179 trang; Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 22 trang Đối tượng phương pháp nghiên cứu:13 trang; kết thảo luận: 119 trang; Kết luận kiến nghị: trang; Luận án gồm 34 bảng, 39 hình 183 tài liệu tham khảo Các danh mục công trình cơng bố, phụ lục kèm CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne giới 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu: Berkeley (1855) nhà khoa học công bố xuất tuyến trùng sần rễ rễ Đến năm 1949, Chitwood thống tách giống tuyến trùng Meloidogyne Gưldi, 1887 dựa lồi chuẩn M exigua (Goldi, 1887) tách khỏi tuyến trùng bào nang Heterodera Vị trí phân loại giống Meloidogyne theo hệ thống Karsen et al (2013) 1.1.2 Đặc điểm sinh học, vòng đời tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne: Chu kỳ sống tuyến trùng sần rễ Meloidogyne bao gồm giai đoạn phát triển bao gồm: trứng; ấu trùng tuổi 1(J1) nằm trứng; ấu trùng tuổi (ấu trùng cảm nhiễm-J2) giai đoạn di động; ấu trùng tuổi 3, (J3, J4) giai đoạn trưởng thành với đực cố định rễ Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp có hình thức sinh sản khác nhau: sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) phần lớn lồi lại sinh sản lưỡng tính (parthenogensis) khơng cần đực 1.1.3 Khả gây hại số trồng: Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả ký sinh tất loại trồng, lên tới 5500 loại khác nhau, bao gồm từ công nghiệp, nông nghiệp cỏ dại Thiệt hại cho kinh tế giới hàng năm ước tính lên tới hàng trăm tỷ đô la 1.1.4 Nghiên cứu phân loại loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne 1.1.4.1 Phương pháp phân tích hình thái: Chitwood (1949) Jebson (1983) sử dụng chi tiết đặc điểm: kim hút, DGO, đặc điểm cắt cutin cái, vùng đầu đực, hình thái lượng kim hút; khoảng cách từ gốc kim hút đến lỗ đổ tuyến thực quản lưng (DGO) để mơ tả lồi Các nghiên cứu gần sử dụng chi tiết số hình thái hình thái lượng 1.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử: Các phương pháp bao gồm phân tích vùng gen ribosome (rDNA) hệ gen nhân vùng gen hệ gen ty thể (mtDNA) 1.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chung tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne Việt Nam: Các nghiên cứu công bố đề cập đến nhiều khía cạnh khác nhau, chủ yếu thành phần loài, phạm vi ký chủ, phát triển số lượng quần thể tuyến trùng biện pháp phòng trừ Nguyễn Ngọc Châu Nguyễn Vũ Thanh (2000) có lồi tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne Cho đến nghiên cứu hạn chế chủ yếu tập trung vào số phương pháp phòng trừ 1.2.2 Tình hình nghiên cứu tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne Tây Nguyên 1.2.2.1 Tổng quan Tây Nguyên: Tây Nguyên khu vực cao nguyên bao gồm tỉnh, xếp theo thứ tự vị trí địa lý từ bắc xuống nam gồm Kon Tum, Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông Lâm Đồng tiểu vùng miền Trung Việt Nam Nằm vùng nhiệt đới xavan, khí hậu Tây Nguyên chia làm hai mùa: mùa mưa từ tháng đến hết tháng 10 mùa khô từ tháng 11 đến tháng năm sau Tây Nguyên có đến triệu hecta đất bazan màu mỡ, tức chiếm đến 60% diện tích đất bazan nước, đất bazan giàu chất dinh dưỡng, tầng phong hoá sâu, phân bố tập trung thuận lợi cho việc hình thành vùng chuyên canh qui mô lớn với công nghiệp cà phê, ca cao, hồ tiêu, nên vùng có diện tích cơng nghiệp lớn nước với trồng xuất chủ lực cà phê hồ tiêu 1.2.2.2 Tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne Tây Nguyên Tuyến trùng sần rẽ Meloidogyne xem xem đối tượng gây hại nghiêm trọng vùng trồng cà phê hồ tiêu Tây Nguyên gây bệnh vàng lá, còi cọc, chậm lớn cà phê, bệnh chết chậm hồ tiêu 1.3 Biện pháp phòng trừ sinh học tuyến trùng sần rễ Meloidogyne Phòng trừ sớm giải pháp quan trọng việc kiểm soát tuyến trùng Hiện nay, biện pháp phòng trừ sử dụng có biểu triệu chứng bệnh tuyến trùng gây tương đối nặng nên việc phòng trừ khó có hiệu có tác dụng chậm trễ Biện pháp sinh học hay phòng trừ sinh học biện pháp tạo sản phẩm tác động trực tiếp gián tiếp tới tuyến trùng ký sinh thực vật Nấm Paecilomyces javanicus có khả ký sinh gây chết tuyến trùng Meloidogyne Dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 hoạt chất kháng sinh 4-HPAA chủng vi khuẩn sinh có khả ức chế tuyến trùng Meloidogyne incognita CHƢƠNG THỜI GIAN, ĐỐI TƢỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Các loài tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu Một số trồng vùng Tây Nguyên: cà phê, hồ tiêu, rau màu, ổi, lúa Nấm Paecilomyces javanicus, dịch chiết vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124, Kháng sinh 4-Hydroxyphenylacetic (4-HPAA) (Hãng Sigma) 2.1.3 Thời gian, địa điểm nghiên cứu Thời gian khảo sát thực địa tiến hành từ tháng 1/ 2014 đến tháng 10 năm 2017 số địa điểm thuộc huyện: CuM‘ga (tỉnh Đắk Lắk); Di Linh (tỉnh Lâm Đồng); Kiến Đức (tỉnh Đắk Nông); Chư Sê (tỉnh Gia Lai) Đắk Hà (tỉnh Kon Tum) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát thực địa phương pháp thu mẫu 2.2.2 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ đất Tuyến trùng tách lọc từ đất theo phương pháp mô tả Nguyễn Ngọc Châu (2003) 2.2.3 Phương pháp tách lọc tuyến trùng từ rễ Phương pháp tách mẫu rễ theo xay nghiền: theo mô tả Nguyễn Ngọc Châu (2003) Các mẫu rễ có nốt sần soi trực tiếp kính hiển vi soi để tách túi trứng.Con phân tích sơ hình thái ủ nở trứng thành ấu trùng để nhân nuôi phục vụ cho nghiên cứu 2.2.4 Nhân nuôi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp Tuyến trùng thuộc giống Meloidogyne nhân nuôi cà chua theo phương pháp mơ tả López-Pérez et al 2011 2.2.5.Phương pháp xử lý làm làm tiêu tuyến trùng Phương pháp cố định tuyến trùng theo Courtney et al., 1955, Phương pháp làm tiêu cố định; Phương pháp cắt cutin vùng hậu môn- sinh dục (Hartman & Sasser, 1985) 2.2.6 Nghiên cứu hình thái Phân loại lồi tuyến trùng sần rễ thuộc giống Meloidogyne dựa khóa phân loại Eisenback (1985), Hewlett & Tarjan (1981; 1983), Jepson (1987), Karssen (2002), Kazachenko & Mukhina (2013) kết hợp với tài liệu khác có liên quan 2.2.7 Nghiên cứu đa dạng di truyền 2.2.7.1 Tách chiết DNA: Theo Holterman et al 2009: Ấu trùng ủ nở từ túi trứng sử dụng để tách chiết DNA 2.2.7.2 Phản ứng PCR Multiplex-PCR phân loại nhanh loài Meloidogyne: loài M arenaria, M incognita, M javanica sử dụng đồng thời cặp mồi đặc hiệu Far/Rar; Mi2F4/Mi1R1; Fjav/Rjav mô tả theo Kiewnick et al (2013) PCR khuếch đại vùng gen: Các vùng gen sử dụng nghiên cứu gồm gen ribosome (D2D3, ITS) vùng gen ty thể (COI, COII-16S, NAD5) 2.2.7.3 Điện di sản phẩm: Kết phản ứng Multiplex PCR so sánh theo kết Kiewnick et al (2013) 2.2.7.4 Tinh sản phẩm PCR đọc trình tự DNA: kít GenJet PCR Purification (Thermo Scientific- Đức) theo quy trình nhà sản xuất gửi giải trình tự cơng ty Macrogen- Hàn Quốc 2.2.7.5 Phân tích trình tự DNA: Các trình tự lựa chọn để phân tích, so sánh chương trình ClustalW phần mềm BioEdit (Hall 1999) 2.2.7.6 Thiết lập phát sinh chủng loại: Các trình tự vùng gen thiết lập phát sinh chủng loại theo phương pháp ML (Maximum Likelihood) với mơ hình phù hợp cho trình tự chương trình Modeltest MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013), 2.2.8 Nghiên cứu khả phòng trừ điều kiện phòng thí nghiệm 2.3.8.1 Chuẩn bị nguồn vi sinh vật: Nấm Paecilomyces javanicus cung cấp trường Đại học Khoa học Tự nhiên- ĐHQGHN, Vi khuẩn Lysobacter antibioticus từ chế phẩm GCM Đại học Quốc gia Chonnam (Hàn Quốc)., Hợp chất 4-HPAA từ hãng Sigma 2.2.8.2 Đánh giá khả ức chế tuyến trùng M incognita: Các phương pháp thực theo phương pháp mơ tả Yoon et al., 2012 có hiệu chỉnh 2.2.8.3 Phân tích số liệu: Số liệu để tính tỷ lệ trứng nở (%) tỷ lệ chết ấu trùng (%) chuyển sang hàm Asin ((x/100)^1/2) phân tích so sánh ANOVA chương trình thống kê SPSS 20 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tần suất xuất hiện, đặc điểm phân bố, khả gây hại loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne 3.1.1 Tần suất xuất loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne số trồng Tây Nguyên Kết phân tích 553 mẫu 22 chủ khác tỉnh thuộc Vùng Tây Nguyên với diện tuyến trùng sần rễ Meloidogyne 17/22 ký chủ với tần suất bắt gặp trung bình 55,6% Lớn ghi nhận hồ tiêu 84,3%, cà chua 83,3% cà phê 68%, mẫu lạc, bơ, sầu riêng, sắn không ghi nhận xuất của tuyến trùng sần rễ Meloidogyne 3.1.2 Phân bố, mật độ loài tuyến trùng sần rễ giống Meloidogyne bắt gặp vùng thu mẫu chủ Trên sở phân tích hình thái dựa cutin vùng chậu cái, hình dạng ấu trùng , phần đầu đực quần thể tuyến trùng sần rễ Meloidogyne phản ứng Multiplex-PCR ghi nhận loài địa điểm nghiên cứu: M incognita, M javanica, 12 không bị đứt đoạn, vòm lưng thấp tròn bao quanh vulva, anus mút đuôi Phasmids không rõ Vulva nằm vị trí trung tâm vùng khơng có vân Hình 3.13 Ảnh chụp lồi Meloidogyne daklakensis (A-E: cái: A: hình dạng; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu môn- sinh dục; F-I: ấu trùng: F: phần miệng; G: đường bên; H-I: phần đuôi; K-N: đực: K, L: phần đầu- miệng; M: đường bên;N: phần đi; thước đo:A: 100 µm; B-N: 10 µm; B, C, E, F, G, I, L, M, N: ảnh chụp SEM; A, D, H, K: ảnh chụp kính hiển vi) Con đực: Vùng đầu cao, tách khỏi thể bao gồm vòng mơi lớn, mơi đĩa mơi tạo thành hình nơ, mơi bên lơn có dạng tam giác, thấp đĩa môi môi giữa; lỗ mở amphid dạng khe ngang lớn dài nằm đĩa môi mơi bên Vòng mơi sau chia thành bốn phần khía dọc Kim hút mập thẳng, núm gốc bên phát triển, hai núm lại vát phía sau 13 Ấu trùng: Cơ thể dài dạng mảnh, thon dài phía Đi thn dài nhọn 3.2.7 Lồi Meloidogyne sp 3.2.7.1 Đặc điểm hình thái hình thái lượng Hình 3.16 Ảnh chụp lồi Meloidogyne sp (A-E: cái: A: hình dạng thể; B-C: phần đầu; D-E: phần hậu mônsinh dục; F-K: ấu trùng: F,G: phần đầu ; H: đường bên; I-K: phần đuôi ;L-O: đực: L,M: phần đầu- miệng; N: đường bên; O: phần đi; thước đo: A: 100 µm; B-M:10 µm; B, E, G, H, K, M, N, O: ảnh chụp SEM; A, C, F, I, L: Ảnh chụp kính hiển vi) Con cái: Con dạng phần đuôi lồi ngoài, màu trắng đục Phần đầu tách biệt với thể, lỗ miệng dạng khe ngang, nằm vùng trước miệng hình trứng, bao quanh nhú mơi Đĩa mơi dạng tròn, 14 nhô cao so với môi Tấm cutin vùng hậu môn-sinh dục dạng tròn đến oval, vân nhẵn, liên tục Vòm lưng thấp tròn bao quanh vulva mấu Con đực: Phần đầu cao tròn, gồm vòng mơi lớn hai vòng sau mơi, đơi chứa vòng khơng hồn tồn Vùng đầu khơng tách biệt với thể Các môi phụ lưng môi phụ bụng hợp thành môi giữa, môi với hai nhú đầu Ấu trùng: Cở thể mảnh, thuôn dần đến phần thn dài Đi dạng nón nhọn với chóp tròn khơng phân đốt Hyaline rõ ràng Phasmids nhỏ, rõ ràng 3.3 Đa dạng hình thái, hình thái lƣợng lồi Meloidogyne 3.3.1 Phân tích đa dạng hình thái lượng loài Meloidogyne spp Ở qua phân tích số khác biệt (CDA) phần mềm Genstat 12 với 20 số hình thái lượng ghi nhận giá trị có ý nghĩa số Stl, EP, a tỷ lệ EP/ST, số phù hợp với mô tả lồi Meloidogyne.Kết phân tích CDA 26 số hình thái lượng đực có số cho vectơ có ý nghĩa số b’ c’ sử dụng phân loại lồi Meloidogyne.Trong phân tích CDA 16 số hình thái lượng ấu trùng ghi nhận số cho số vectơ có ý nghĩa chiều cao môi, DGO, Hyaline, b c’ xem số phân biệt lồi 3.3.2 Đa dạng hình thái lồi Meloidogyne spp Hình 3.21 Đặc điểm so sánh cutin vùng chậu loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp., (Thước đo: 10 µm;) 15 Hình 3.22 Đặc điểm so sánh vùng đầu đực loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp (Thước đo: 10 µm) Hình 3.23 Đặc điểm so sánh phần ấu trùng tuổi loài tuyến trùg sần rễ Meloidogyne spp., (Mũi tên vị trí phasmid; thước đo:10 µm) 16 3.4 Phân tích đa dạng di truyền loài Meloidogyne spp 3.4.1 Phản ứng Multiplex-PCR Kết sản phẩm điện di loài M incognita cho kích thước 300 bp, lồi M arenaria cho kích thước 420 bp lồi M javanica cho kích thước 670 bp, phù hợp với nghiên cứu Kiewnick et al., 2013 Phương pháp sử dụng để phân loại nhanh loài M incognita, M javanica, M arenaria phản ứng Multiplex-PCR Hình 3.24 Hình điện di sản phẩm Multiplex PCR (Giếng M: Marker 100; J: M javanica; A: M arenaria; I: M incognita; 1-27: M incognita ; 28-29: M graminicola; 30-36: M javanica; 37-40: M daklakensis; 41-43: M enterolobii; 44-48: M arenaria; 49-50: Meloidogyne sp; +, - : mẫu đối chứng) 17 3.4.2 Phân tích đa dạng di truyền 3.4.2.1 Vùng gen ITS-rDNA Hình 3.25 Cây phát sinh chủng loại loài Meloidogyne spp., dựa vùng gene ITS xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình TN92+G) Số gốc nhánh giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%) Các số hiệu phía sau tên lồi ký hiệu mẫu mã số genbank 18 3.4.2.2 Vùng gen D2D3-rDNA Hình 3.26 Cây phát sinh chủng loại lồi Meloidogyne spp., dựa vùng gene D2D3 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình K2+G) Số gốc nhánh giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%) Các số hiệu phía sau tên lồi ký hiệu mẫu mã số genbank 19 3.4.2.3.Vùng gen COI-rRNA Hình 3.27 Cây phát sinh chủng loại lồi Meloidogyne spp., dựa vùng gene COI xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình GTR+G) Số gốc nhánh giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%) Các số hiệu phía sau tên lồi ký hiệu mẫu mã số genbank 20 3.4.2.4 Vùng gen COII-16S rRNA Hình 3.28 Cây phát sinh chủng loại loài Meloidogyne spp., dựa vùng gene COII-16S xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mơ hình HKY+G+I) Số gốc nhánh giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%) Các số hiệu phía sau tên loài ký hiệu mẫu mã số genbank 21 3.4.2.5 Vùng gen NAD5 Hình 3.29 Cây phát sinh chủng loại loài Meloidogyne spp., dựa vùng gene NAD5 xây dựng theo phương pháp Maximum Likelihood (mô hình GTR+G) Số gốc nhánh giá trị bootstrap với 1000 lần lấy lại mẫu (%) Các số hiệu phía sau tên lồi ký hiệu mẫu mã số genbank Thảo luận: Trong nghiên cứu phân tích vùng gen tất lồi Meloidogyne phổ biến nhóm lại với (M incognita, M javanica, M arenaria, M arabicida, M izalcoensis) tạo thành nhánh (nhánh Ia) với bootstrap lên tới 99 gen ITS, 92 gen D2D3, 96 gen COI, 99 gen COII-16S 98 gen NAD5, xem loài nhiệt đới ghi nhận nhiều nước nhiệt đới, 22 lồi ơn đới (M hapla; M fallax, M chitwoodi) nhóm lại với thành nhánh khác Ba loài thuộc nhánh Ia bao gồm M incognita, M javanica, M arenaria có mức độ tương đồng cao khó có khả phân biệt chúng Jansen et al., 2016 phân tích vùng gen ty thể bao gồm COI, COII, CO3, NAD1, NAD3, NAD5 kết lồi Meloidogyne nhánh Ia phân loại xác, đoạn gen NAD5 chứa số vị trí sai khác nhiều xem vùng gen ưu tiên cho loài Meloidogyne nhánh Ia Việc giải trình tự phân tích vùng gen NAD5 hiệu cho loài M incognita, M javanica, M arenaria, lồi lại M ethiopica, M inornata, M luci nhánh Ia cần bổ sung thêm vùng gen COII-16S Kết thể nghiên cứu phân tích vùng gen lồi M incognita, M javanica, M arenaria ghi nhận biến đổi nucleotide vùng NAD5 nhiều từ 1-2%, tạo thành nhánh khác lồi Vị trí biến đổi phân tích phát sinh chủng loại thể điều nhóm lồi tách thành nhánh gần Các phân tích loài M enterolobii (5342, 5349, 5352) liên quan chặt chẽ với lồi nhiệt đới lồi ơn đới, nên loài M.enterolobii thuộc nhánh chứa loài Meloidogyne nhiệt đới Kết phù hợp với nghiên cứu Tigano et al., 2005 vùng gen phân tích dễ dàng phân biệt lồi M enterolobii với loài khác, tạo thành nhánh tách biệt với nhánh Ia (nhánh Ib) với bootstrap lên tới 99 gen ITS, 92 gen D2D3, 99 gen COI, 100 gen COII-16S 100 gen NAD5 Đối với lồi khác ngồi nhánh I vùng gen hoàn toàn phù hợp sử dụng để phân tách loài Onkendi, Moleleki (2013) chứng minh vùng gen ITS, D2D3 cơng cụ hữu ích để nhận dạng loài M marylandi, M graminis M naasi M enterolobii, M hapla, M chitwoodi M fallax Để xác định đến loài gần gũi sử dụng đến vùng gen ty thể có tiến hóa cao bảo thủ loài Sự đa dạng di truyền quần thể loài loài M incognita, M javanica, M arenaria thấp chúng có biến đổi di truyền, nhiên đa dạng di truyền quần thể lồi khác nhóm MIG cao Kết hợp với phân tích đa dạng hình thái với biến đổi lớn đặc điểm hình thái, hình thái lượng 23 quần thể khác lồi biến đổi hình thái liên quan đến ký chủ địa điểm thu mẫu Do vậy, đa dạng di truyền lồi nhiệt đới gen nhân (ITS, D2D3) gen ty thể (COI, COII) khó tách lồi sử dụng phân tích tiến hóa lại phù hợp với lồi ngồi nhóm lồi M incognita, M javanica, M arenaria Và gen NAD5 có khả phân tích tiến hóa M incognita, M javanica, M arenaria Bên cạnh đó, để phân tích giám định nhanh lồi nhiệt đới M incognita, M javanica, M arenaria sử dụng mồi đặc hiệu 3.5 Thử nghiệm phƣơng pháp phòng trừ tuyến trùng M incognita 3.5.1 Ảnh hưởng nấm Paecylomyces javanicus Khả nở trứng giảm dần nồng độ nấm tăng lên, tỷ lệ nở trứng giảm 11,8%, 8,9% 3,8% CT1, CT2 CT3 so với khả nở trứng nước 39,1% NaCl 0,9% 30% sau 120 theo dõi Đối với ấu trùng chết môi trường nồng độ nấm sau 120 theo dõi lên tới 75% trong mơi trường nước cất NaCl 0,9% tỷ lệ chết đạt 2,6- 6,8% Bảng 3.28 Ảnh hưởng nấm P javanicus đến tỷ lệ nở trứng tuyến trùng M incognita Bảng 3.29 Ảnh hưởng nấm P javanicus đến tỷ lệ chết ấu trùng M incognita 3.5.2 Ảnh hưởng vi khuẩn Lysobacter antibioticus HS124 Vi khuẩn có tác động trực tiếp sau 72 tỷ lệ chết ấu trùng tuổi CT2 CT3 14,8 23,8% sai khác có ý nghĩ với CT1 ĐC đạt cao CT3 sau 168 với tỷ lệ chết đạt 65,5% ĐC 15% 24 Đối với tỷ lệ nở chứng sau 48 thử nghiệm CT3 có sai khác có ý nghĩa với cơng thức lại đạt tỷ lệ nở thấp CT3 sau 168 30,4% so với 70% ĐC Bảng 3.30 Ảnh hưởng vi khuẩn L antibioticus HS124 đến tỷ lệ nở trứng M incognita Bảng 3.31 Ảnh hưởng vi khuẩn L antibioticus HS124 đến tỷ lệ chết ấu trùng M incognita 3.5.3 Ảnh hưởng hợp chất 4-HPAA tới tuyến trùng M incognita Ở nồng độ hợp chất 4-HPAA 7,5mg/ml sau 24 thử nghiệm có tỷ lệ chết tương ứng từ 31,9 37,7 % sai khác có ý nghĩa thống kê Ở nồng độ 2,5 mg/ml sau 72h theo dõi hầu hết tỷ lệ gây chết tuyến trùng M incognita đạt tới 98,1 - 98,2% đạt tới 99% sau 120 Như vây, hợp chất 4-HPAA có hiệu diệt tuyến trùng M incognita cao Tỷ lệ nở trứng tuyến trùng M incognita xử lý với hợp chất 4HPAA sau 24 thử nghiệm không ghi nhận trứng nở CT3 CT4, tỷ lệ nở ĐC 16,3%sai khác có ý nghĩa sau 120 tỷ lệ nở ĐC 80,7% CT3 CT4 ghi nhận từ 0-4% trứng nở Bảng 3.32 Đồ thị ảnh hưởng hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ nở trứng tuyến trùng M incognita Bảng 3.33 Đồ thị ảnh hưởng hợp chất 4-HPAA đến tỷ lệ chết ấu trùng M incognita 25 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Phân tích 50 quần thể loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp 17 loài chủ khác Tây Nguyên ghi nhận 07 loài Meloidogyne: M incognita, M javanica, M arenaria, M graminicola, M enterolobii, 01 loài cho khoa học M daklakensis 01 loài Meloidogyne sp., với mật độ tần suất bắt gặp cao nhiều loại trồng số có nhiều trồng xen cỏ nên việc định hướng canh tác cần quan tâm để tránh việc lây lan phát triển quần thể tuyến trùng sần rễ trước trồng trồng Các loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp có mức đa dạng cao hình thái cá thể loài loài Các đặc điểm như: chiều dài từ đầu- lỗ tiết, đặc điểm cutin vùng chậu Chiều cao môi, chiều dài kim hút, đặc điểm vùng đầu đực Chiều dài đuôi, chiều dài hyaline, đặc điểm phần đuôi ấu trùng đặc điểm sử dụng phân loại loài thuộc giống Meloidogyne Các loài M incognita, M javanica, M arenaria có đa dạng di truyền thấp khó phân tách lồi vùng gen ITS, D2D3, COI, COII Gen NAD5 có ý nghĩa phân loại lồi Các lồi lại có đa dạng di truyền cao tất vùng gen (ITS, D2D3, COI, COII, NAD5) có ý nghĩa phân tích tiến hóa lồi Phương pháp Multiplex-PCR sử dụng để phân loại nhanh nhóm ba lồi M incognita, M arenaria, M javanica phổ biến Việt Nam với độ nhạy xác cao với kích thước đoạn băng tương ứng 300, 420, 670bp phản ứng PCR Nấm P javanicus nồng độ 2×106 bào tử/ml cho hiệu lực cao nhất, ức chế nở trứng đến 96% gây chết 87% ấu trùng M incognita sau 168 thử nghiệm Dịch bào tử vi khuẩn L antibioticus nồng độ 3×105 bào tử/ml làm chết tới 65,5 % ấu trùng M incognita, tỷ lệ nở trứng 30,4% sau 168 Hợp chất 4-HPAA nồng độ 2,5mg/ml gây chết ấu trùng lên tới 90% nở trứng 11,8% sau 96 4.2 KIẾN NGHỊ Xác định vị trí phân loại xác loài Meloidogyne sp nghiên cứu Thử nghiệm đồng ruộng vi sinh vật đối kháng nói trên sơ chủ 26 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Quốc tế: Trinh, Q P., Le, T M L., Nguyen, T D., Nguyen, H T., Liebanas, G., & Nguyen, T A D Meloidogyne daklakensis n sp.(Nematoda: Meloidogynidae), a new root-knot nematode associated with Robusta coffee (Coffea canephora Pierre ex A Froehner) in the Western Highlands, Vietnam Journal of helminthology, 2018, 1-13 Trong nƣớc Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh Quang Pháp , Nguyễn Thị Phương Anh, Phạm Văn Ty Nghiên cứu khả ức chế tuyến trùng Meloidogyne incognita cà phê nấm Paecilomyces javanicus Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 13(4): 1025-1029, 2015 Lê Thị Mai Linh, Trịnh Quang Pháp Đa dạng di truyền vùng 28srDNA số loài tuyến trùng gây sần rễ (Meloidogyne spp.) Tây Nguyên HTQG Bệnh hại thực vật Việt Nam lần thứ 16-2016; 298-303 Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Nguyễn Hữu Tiền, Trịnh Quang Pháp Ghi nhận loài tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne incognita ngô tỉnh Đắk Lắk Tạp chí sinh học 2017, 39(1): 1523 Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Phan Kế Long, Trịnh Quang Pháp Đa dạng di truyền vùng gen ty thể COII-16S-rRNA số loài tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp ký sinh cà phê tỉnh Đắk Lắk Hội nghị sinh thái Tài nguyên sinh vật lần thứ 7, 2017, 768-773 Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh Quang Pháp, Nguyễn Văn Toàn Ảnh hưởng vi khuẩn Lysobacter antibioticus đến tuyến trùng nốt sần rễ Meloidogyne incognita điều kiện phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật, 2017 Số (271) 18-24 ... tiễn đa dạng trồng địa hình Tây Nguyên, đa dạng loài tuyến trùng sần rễ khả gây hại, thực đề tài: Nghiên cứu đa dạng tuyến trùng ký sinh gây sần rễ Meloidogyne spp Tây Nguyên ’ Mục tiêu nghiên cứu. .. Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Tuyến trùng ký sinh gây sần rễ thuộc giống Meloidogyne nhóm tuyến trùng nội ký sinh cố định gây sần rễ Các lồi tuyến trùng sần rễ Meloidogyne có khả ký sinh nhiều... màu trồng xen Tây Nguyên  Nghiên cứu hình thái đa dạng tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khu vực Tây Nguyên  Nghiên cứu đa dạng di truyền tuyến trùng sần rễ Meloidogyne khu vực Tây Nguyên dựa phân